כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי
22 במאי 2017
החקירה של סחר קרום הוא חיוני להבנת תפקודים נוירונים. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תנועתיות שלפוחית נוירונים. זוהי שיטה נוחה שניתן להתאים את כימות של סחר קרום במערכת העצבים.
המטרה הכללית של ניתוח הדמיה זה היא לצפות בניידות של וזיקולות בנוירונים ולכמת אותה בקלות. גישה זו מאפשרת לנתח תעבורת ממברנה בנוירונים בצורה פשוטה ויעילה מבחינת זמן. כדי להתחיל בהליך זה, העבירו את הרחם לצלוחית פטרי חדשה עם 70% ethanol.
בשלב הבא, העבירו את הרחם לצלוחית פטרי אחרת המכילה HBSS. לאחר מכן, הוציאו את העוברים מהרחם באמצעות פינצטה סטרילית ומספריים כירורגיים. לאחר מכן, הניחו אותם בצלוחית פטרי חדשה עם HBSS.
תחת מיקרוסקופ סטריאו, הסר את העור ואת הגולגולות והוצא את המוחות באמצעות פינצטת דיסקציה סטרילית. לאחר מכן, העבר אותם לצלחת פטרי אחרת המכילה HBSS. הסר את הקרומי העוטפים את המוח (meninges) באמצעות פינצטת דיסקציה סטרילית.
לאחר מכן, גזרו את האזורים העודפים. בשלב הבא, העבירו את הקורטקסים לצלוחית פטרי חדשה המכילה HBSS. אספו את כל הקורטקסים באמצעות טפטפת חד-פעמית או פיפט של 25 milliliter והעבירו אותם לשפור של 15 milliliter.
לאחר מכן, הסר את ה-HBSS באמצעות פיפטה. לאחר מכן, הוסף שלוש מיליליטר של תמיסת אנזימים לקליפת המוח לשפופרת המכילה את הקליפות. הנח את השפופרת במקלח מים והדגר אותה ב-37 °C למשך חמש דקות.
לאחר מכן, הוסיפו שלוש מיליליטרים נוספים של תמיסת אנזימים לקורטקס המוחי למבחנה המכילה את הקורטקסים, והדגירו אותם בבן-מאט בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות נוספות. לאחר חמש דקות, הסירו את תמיסת האנזימים לקורטקס המוחי והוסיפו חמישה מיליליטרים של DMEM המכיל 10% fetal bovine serum. בצעו דיסוציאציה של הקורטקסים על ידי פיפטאציה עדינה מעלה ומטה באמצעות פיפטה של חמישה מיליליטרים עם טיפ P1000 סטרילי.
לאחר מכן, בצעו פיפטור חוזר של הקורטקסים באמצעות פיפטה של 5 mL עם טיפ P200. הניחו מסננת תאים מניילון של 40 µm על מבחנה של 50 mL וסננו את התרחיף כדי להסיר שרידים. לאחר מכן, סבבו את התרחיף בצנטריפוגה במהירות של 420 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, והסירו את מצע ה-DMEM.
לאחר מכן, יש להוסיף 5 ml של מצע גידול לתאי קליפת המוח (cerebral cortical culture medium) ולערבב בעדינות כדי לשחרר את משקע התאים. לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר (hemocytometer) והתאימו את ריכוז התאים באמצעות מצע הגידול לתאי קליפת המוח. בשלב הבא, זרעו 3×10⁶ נוירוני קליפה ב-2 ml של תרחיף תאים בכל צלחית זכוכיתית בעלת תחתית שטוחה בנפח 35 ml המסומנת בקוד.
בנוהל זה, ערבבו 4 µg של פלסמיד עם 200 µL של מצע ללא סרום. במבחנה נפרדת, דללו 8 µL של ריאגנט טרנספקציה ב-200 µL של מצע ללא סרום. לאחר מכן, דגרו את התמיסה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר חמש דקות, ערבב את תמיסת הפלסמיד עם תמיסת ריאגנט הטרנספקציה והדגר את התערובת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף את התערובת לצלוחיות עם תחתית זכוכית מצופות. הדגר את הנוירונים בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות.
לאחר מכן, החליפו את המצע בשני מיליליטר של מצע תרבית לקליפת המוח (cerebral cortical culture medium) והדגירו את הנוירונים ב-37 °C למשך יום עד יומיים. לצורך הדמיה, השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנציה המצויד במצלמת CCD ובעדשות אובייקטיב 40X. שמרו על טמפרטורה של 37 °C באמצעות מערכת דגירה.
רכשו תמונות של נוירונים בקצב של פריים אחד כל חמש שניות לאורך תקופה של 100 שניות, בבקרה של תוכנת רכישת התמונות. כדי לנתח את התמונות, פתחו את כל התמונות הרצופות בתוכנת ImageJ באמצעות Manual Tracking. כדי לאחד את התמונות הרצופות, בחרו Image, לאחר מכן Stacks, ואז Images to Stack ולחצו על OK. לאחר מכן, בחרו Plugins ולאחר מכן Manual Tracking.
חלון מעקב (Tracking) יקפוץ. סמנו את תיבת הסימון של Show Parameters והגדירו את פרמטרי המעקב בסעיף Parameters. לאחר מכן, לחצו על Add track כדי להתחיל מעקב חדש.
לאחר קביעת הוויזקולות הרלוונטיות, לחצו על מרכז הסיגנלים בתמונות הרצפיות כדי לתעד את קואורדינטות ה-xy. חזרו על פעולה זו כדי לאסוף את קואורדינטות ה-xy של הוויזקולות מכל התמונות הרצפיות; כל תמונה עוברת באופן אוטומטי לתמונה הבאה לאחר בחירת נקודת הייחוס. תמונה זו מציגה את הניידות של ויזקולות המכילות LAMP-EGFP בדנדריטים של נוירונים קורטיקליים של עכבר לאחר יומיים של טרנספקציה, שהחלה ב-DIV 4.
התמונה המוקטנת מציגה דימוי של צילום רצף (time-lapse) של שלפוחיות חיוביות ל-LAMP-EGFP. ראש החץ האדום מצביע על שלפוחית נעה וראש החץ הכחול מצביע על שלפוחית במנוחה. ראשי החץ הכתומים מצביעים על אותות פלואורסצנציה חזקים יותר.
כאן מוצגת מיקום ציר ה-X התלוי בזמן של וסיקולות חיוביות ל-LAMP-EGFP. הוסיקולה במעגל האדום, המסומנת ב-b, נעה, והוסיקולה במעגל הכחול, המסומנת ב-a, נחה. גרף עמודות זה מציין את מרחק התנועה הכולל של LAMP-EGFP.
תרשים עמודות זה מציין את מרחק התנועתיות הממוצע של שלפוחיות המכילות LAMP-EGFP.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לכימות ניידות של שלפוחיות בנוירונים, שהיא חיונית להבנת תפקודי הנוירונים. גישה זו מאפשרת ניתוח פשוט של תעבורת ממברנות במערכת העצבים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- תעבורת ממברנה
רקע
- תעבורת ממברנות היא קריטית לתפקוד נוירונלי.
- ניידות של שלפוחיות ממלאת תפקיד מרכזי בתהליך זה.
- הבנה של מנגנונים אלו יכולה לספק תובנות לגבי בריאות נוירונלית.
- שיטות נוכחיות לכימות תנועת שלפוחיות הן לעיתים קרובות מורכבות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה נוחה לכימות ניידות של וסיקולות.
- הסהלה של ניתוח תעבורת ממברנות בנוירונים.
- שיפור ההבנה של תפקודי נוירונים באמצעות מתודולוגיות משופרות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח דימויים לצפייה בניידות של שלפוחיות.
- העברה של דגימות ביולוגיות למצעים מתאימים לצורך ניתוח.
- שימוש בכלים סטריליים לטיפול בדגימות.
- פרוצדורות יעילות בזמן לצורך כימות.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת כימות קל של ניידות שלפוחיות.
- היא מספקת גישה פשוטה לניתוח תעתוע ממברנות.
- התוצאות עשויות לתרום להבנה טובה יותר של תפקודי נוירונים.
- יישומים פוטנציאליים בתחומי מחקר שונים במדעי המוח.
מסקנות
- שיטה זו מפשטת את חקר ניידות הוויזקולות בנוירונים.
- ניתן להתאימה ליישומים שונים במדעי המוח.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על גישה זו כדי לבחון את בריאות הנוירונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה עבור מנהלים
כימות ניידות של וסיקולות מספק תובנות קריטיות לגבי מנגנוני תעבורת ממברנות המשפיעים על בריאות נוירונים ועל פנוטיפים של מחלות. שיטה זו מאפשרת תיקוף של יעדים בשלב מוקדם על ידי קישור דינמיקה סוב-צלולית לתוצאות פונקציונליות במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות. הגישה תומכת בביטחון חיזוי בסינון פרה-קליני על ידי אספקת מדדים כמותיים וניתנים לשחזור של הובלה וסיקולרית במערכות נוירונליות רלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השערות טיפוליות באמצעות מדידת ניידות אנדוזומים וליזוזומים כמדדים תפקודיים לבריאות נוירונלית.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות כימות סטנדרטי של תנועת וסיקולות במודלים תאיים רלוונטיים למחלה.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי קישור פגמים בניידות למסלולים מכניסטיים בהפרעות נוירונליות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מדידות כמותיות של מרחק וקצב תנועתיות לצורך סריקת תרכובות בנוריטים ובסומה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות של הבדיקה באמצעות מעקב מבוסס ImageJ עם פרמטרים מוגדרים ודימוי בזמן אמת (time-lapse).
- יכולת הרחבה: תואם לסוגי תאים מרובים, כולל פיברובלסטים ותאי אנדותל, מה שמאפשר שימוש חוזר בין פלטפורמות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם לאסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור דינמיקת שלפוניות להישרדות נוירונלית ולתפקוד סינפטי.
- ערך תפעולי: תומך ברצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות קריאות ניידות עקביות במגוון מודלים.
- הפחתת סיכונים: מספק מידע לקבלת החלטות על התקדמות מותאמת-סיכון על ידי זיהוי תרכובות המצילות פגמים בתהליכי תובלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת נתונים כמותיים על ניידות, המעניקים מידע על מעורבות המטרה (target engagement) ועל ויסות מסלולים במערכות עצביות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי כימות תנועת שלפוחיות כקריאה תפקודית של שלמות תעבורת הממברנה.
- סינון: מאפשרת מוכנות לבדיקה באמצעות פרוטוקולי דימוי ומעקב סטנדרטיים לניתוח שלפוחיות תלוי-זמן.
- אנליזה: מייצרת מדדי מרחק ניידות ותנועה ממוצעת המאפשרים ניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומני: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי קישור פגמים בהובלה שלפוחית למנגנונים של מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמת דימוי רב-פעמית שניתן להחיל על קווי תאים עצביים ולא-עצביים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות בקשרים המכניסטיים בין פגמי תעבורה לבין פנוטיפים נוירונליים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות ניתוח מבוסס תוספים (plug-in) ופרמטרי מעקב מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת נתונים כמותיים ואובייקטיביים על מעורבות מטרות במסלולי ניידות של שלפוחיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד עדיפויות מותאם סיכון על ידי זיהוי תרכובים המודולטיים של דינמיקת אנדוזום-ליזוזום במודלים של מחלות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות עצביות, טרנספקציה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית לצורך סימון ודימוי מדויקים של שלפוחיות.
- התהליך תלוי בפלטפורמת ImageJ עם תוסף Manual Tracking ובסביבת עיבוד תמונות סדרתי.
- נדרשת סטנדרטיזציה של יעילות הטרנספקציה, מרווחי הדימוי ופרמטרי המעקב בין הניסויים השונים.
- התאמה לקווי תאים שונים עשויה לדרוש אופטימיזציה של ביטוי הסמן ומדידות בסיס של ניידות.
- מגבלות מעשיות כוללות תלות ביעילות הטרנספקציה ופוטנציאל לפוטוטוקסיסיות במהלך דימויי time-lapse ממושכים.
