כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי
22 במאי 2017
החקירה של סחר קרום הוא חיוני להבנת תפקודים נוירונים. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תנועתיות שלפוחית נוירונים. זוהי שיטה נוחה שניתן להתאים את כימות של סחר קרום במערכת העצבים.
המטרה הכוללת של ניתוח הדמיה זה היא לצפות בתנועתיות השלפוחית בתאי עצב ולכמת אותה בקלות. גישה זו מאפשרת לנתח סחר בממברנות בתאי עצב בצורה פשוטה וחסכונית בזמן. כדי להתחיל בהליך זה, העבירו את הרחם לצלחת פטרי חדשה עם 70% אתנול.
לאחר מכן, העבירו את הרחם לצלחת פטרי אחרת עם HBSS. לאחר מכן הוציאו את העוברים מהרחם באמצעות מלקחיים מעוקרים ומספריים כירורגיים. לאחר מכן הניחו אותם בצלחת פטרי חדשה עם HBSS.
תחת מיקרוסקופ סטריאו, הסר את העור והגולגולות והוציא את המוחות באמצעות מלקחיים מעוקרים. לאחר מכן, העבירו אותם לצלחת פטרי אחרת עם HBSS. הסר את קרומי המוח באמצעות מלקחיים מעוקרים.
לאחר מכן חתוך את האזורים הנוספים. לאחר מכן, העבירו את הקליפות לצלחת פטרי חדשה עם HBSS. אוספים את כל קליפות המוח בעזרת טפטפת חד פעמית או פיפטה של 25 מיליליטר ומניחים אותם בצינור של 15 מיליליטר.
לאחר מכן, הסר את ה-HBSS על ידי פיפטינג. לאחר מכן, הוסף שלושה מיליליטר של תמיסת אנזים קליפת המוח לצינור המכיל את קליפת המוח. הכניסו את הצינור לאמבט מים ודגרו עליו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
לאחר מכן הוסיפו עוד שלושה מיליליטר של תמיסת אנזים קליפת המוח לתוך הצינור המכיל את קליפת המוח ודגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך חמש דקות נוספות. לאחר חמש דקות הסר את תמיסת האנזים בקליפת המוח והוסף חמישה מיליליטר של DMEM המכיל סרום בקר עוברי 10%. נתק את קליפת המוח על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה באמצעות פיפטה של חמישה מיליליטר עם קצה P1000 סטרילי.
ואז פיפטה שוב את קליפת המוח באמצעות פיפטה של חמישה מיליליטר עם קצה P200. שים מסננת תאי ניילון של 40 מיקרומטר על צינור של 50 מיליליטר וסנן את המתלה כדי להסיר את הפסולת. לאחר מכן, צנטריפוגה את המתלה ב -420 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ואז הסר את מדיום ה- DMEM.
לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של מדיום תרבית קליפת המוח והשעהה בעדינות את כדור התא. לאחר מכן ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר והתאימו את ריכוז התאים באמצעות מדיום התרבות בקליפת המוח. לאחר מכן, צלחת שלוש פעמים 10 לששת הנוירונים בקליפת המוח בשני מיליליטר של תרחיף תאים עבור כל צלחת תחתית זכוכית מקודדת של 35 מיליליטר.
בהליך זה, מערבבים ארבעה מיקרוגרם של פלסמיד עם 200 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום. בצינור נפרד יש לדלל שמונה מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה ב -200 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום. לאחר מכן, דגרו את התמיסה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר חמש דקות מערבבים את תמיסת הפלסמיד ואת תמיסת המגיב הטרנספקציה ומדגרים את התערובת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מוסיפים את התערובת לכלי תחתית הזכוכית המקודדים. דגרו על תאי העצב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
לאחר מכן, החלף את המדיום בשני מיליליטר של מדיום תרבית קליפת המוח ודגר את הנוירונים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים. לצורך הדמיה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמת CCD עם עדשות אובייקטיביות פי 40. שמור על הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת דגירה.
רכוש תמונות נוירונים בפריים אחד כל חמש שניות במשך תקופה של 100 שניות הנשלטת על ידי תוכנת רכישת התמונה. כדי לנתח את התמונות, פתח את כל התמונות הרציפות בתוכנת ImageJ עם מעקב ידני. כדי לשלב את התמונות הרציפות בחר תמונה, לאחר מכן ערימות, ולאחר מכן תמונות לערימה ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר מכן, בחר תוספים ולאחר מכן מעקב ידני.
יופיע חלון מעקב. לחץ על תיבת הסימון הצג פרמטרים והגדר את פרמטרי המעקב בסעיף פרמטרים. לאחר מכן לחץ על הוסף רצועה כדי להתחיל רצועה חדשה.
לאחר קביעת השלפוחיות המעניינות, לחץ על מרכז האותות בתמונות העוקבות כדי לרשום את קואורדינטות ה-xy. חזור על הליך זה כדי לאסוף את קואורדינטות xy של השלפוחיות מכל התמונות העוקבות, כל תמונה מתקדמת אוטומטית לתמונה העוקבת לאחר בחירת נקודת ההתייחסות. התמונה הזו מראה את התנועתיות של LAMP-EGFP שמכיל שלפוחיות בדנדריטים של תאי העצב בקליפת המוח של העכבר אחרי יומיים של טרנספקציה, שהתחילו בארבעה DIV.
הכניסה מציגה את תמונת ה-Time-lapse של השלפוחיות החיוביות של LAMP-EGFP. ראש החץ האדום מציין שלפוחית נעה וראש החץ הכחול מציין שלפוחית נחה. ראשי החצים הכתומים מצביעים על אותות פלואורסצנטיים גבוהים יותר.
להלן מיקום ציר ה-X התלוי בזמן של השלפוחיות החיוביות של LAMP-EGFP. השלפוחית בעיגול האדום, המסומנת b, זזה והשלפוחית בעיגול הכחול, המסומנת a, נחה. גרף עמודות זה מציין את המרחק הכולל של תנועת LAMP-EGFP.
וגרף עמודות זה מציין את מרחק התנועתיות הממוצע של LAMP-EGFP המכיל שלפוחית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לכימות ניידות של שלפוחיות בנוירונים, שהיא חיונית להבנת תפקודי הנוירונים. גישה זו מאפשרת ניתוח פשוט של תעבורת ממברנות במערכת העצבים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- תעבורת ממברנה
רקע
- תעבורת ממברנות היא קריטית לתפקוד נוירונלי.
- ניידות של שלפוחיות ממלאת תפקיד מרכזי בתהליך זה.
- הבנה של מנגנונים אלו יכולה לספק תובנות לגבי בריאות נוירונלית.
- שיטות נוכחיות לכימות תנועת שלפוחיות הן לעיתים קרובות מורכבות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה נוחה לכימות ניידות של וסיקולות.
- הסהלה של ניתוח תעבורת ממברנות בנוירונים.
- שיפור ההבנה של תפקודי נוירונים באמצעות מתודולוגיות משופרות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח דימויים לצפייה בניידות של שלפוחיות.
- העברה של דגימות ביולוגיות למצעים מתאימים לצורך ניתוח.
- שימוש בכלים סטריליים לטיפול בדגימות.
- פרוצדורות יעילות בזמן לצורך כימות.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת כימות קל של ניידות שלפוחיות.
- היא מספקת גישה פשוטה לניתוח תעתוע ממברנות.
- התוצאות עשויות לתרום להבנה טובה יותר של תפקודי נוירונים.
- יישומים פוטנציאליים בתחומי מחקר שונים במדעי המוח.
מסקנות
- שיטה זו מפשטת את חקר ניידות הוויזקולות בנוירונים.
- ניתן להתאימה ליישומים שונים במדעי המוח.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על גישה זו כדי לבחון את בריאות הנוירונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה עבור מנהלים
כימות ניידות של וסיקולות מספק תובנות קריטיות לגבי מנגנוני תעבורת ממברנות המשפיעים על בריאות נוירונים ועל פנוטיפים של מחלות. שיטה זו מאפשרת תיקוף של יעדים בשלב מוקדם על ידי קישור דינמיקה סוב-צלולית לתוצאות פונקציונליות במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות. הגישה תומכת בביטחון חיזוי בסינון פרה-קליני על ידי אספקת מדדים כמותיים וניתנים לשחזור של הובלה וסיקולרית במערכות נוירונליות רלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השערות טיפוליות באמצעות מדידת ניידות אנדוזומים וליזוזומים כמדדים תפקודיים לבריאות נוירונלית.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות כימות סטנדרטי של תנועת וסיקולות במודלים תאיים רלוונטיים למחלה.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי קישור פגמים בניידות למסלולים מכניסטיים בהפרעות נוירונליות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מדידות כמותיות של מרחק וקצב תנועתיות לצורך סריקת תרכובות בנוריטים ובסומה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות של הבדיקה באמצעות מעקב מבוסס ImageJ עם פרמטרים מוגדרים ודימוי בזמן אמת (time-lapse).
- יכולת הרחבה: תואם לסוגי תאים מרובים, כולל פיברובלסטים ותאי אנדותל, מה שמאפשר שימוש חוזר בין פלטפורמות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם לאסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור דינמיקת שלפוניות להישרדות נוירונלית ולתפקוד סינפטי.
- ערך תפעולי: תומך ברצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות קריאות ניידות עקביות במגוון מודלים.
- הפחתת סיכונים: מספק מידע לקבלת החלטות על התקדמות מותאמת-סיכון על ידי זיהוי תרכובות המצילות פגמים בתהליכי תובלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת נתונים כמותיים על ניידות, המעניקים מידע על מעורבות המטרה (target engagement) ועל ויסות מסלולים במערכות עצביות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי כימות תנועת שלפוחיות כקריאה תפקודית של שלמות תעבורת הממברנה.
- סינון: מאפשרת מוכנות לבדיקה באמצעות פרוטוקולי דימוי ומעקב סטנדרטיים לניתוח שלפוחיות תלוי-זמן.
- אנליזה: מייצרת מדדי מרחק ניידות ותנועה ממוצעת המאפשרים ניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומני: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי קישור פגמים בהובלה שלפוחית למנגנונים של מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמת דימוי רב-פעמית שניתן להחיל על קווי תאים עצביים ולא-עצביים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות בקשרים המכניסטיים בין פגמי תעבורה לבין פנוטיפים נוירונליים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות ניתוח מבוסס תוספים (plug-in) ופרמטרי מעקב מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת נתונים כמותיים ואובייקטיביים על מעורבות מטרות במסלולי ניידות של שלפוחיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד עדיפויות מותאם סיכון על ידי זיהוי תרכובים המודולטיים של דינמיקת אנדוזום-ליזוזום במודלים של מחלות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות עצביות, טרנספקציה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית לצורך סימון ודימוי מדויקים של שלפוחיות.
- התהליך תלוי בפלטפורמת ImageJ עם תוסף Manual Tracking ובסביבת עיבוד תמונות סדרתי.
- נדרשת סטנדרטיזציה של יעילות הטרנספקציה, מרווחי הדימוי ופרמטרי המעקב בין הניסויים השונים.
- התאמה לקווי תאים שונים עשויה לדרוש אופטימיזציה של ביטוי הסמן ומדידות בסיס של ניידות.
- מגבלות מעשיות כוללות תלות ביעילות הטרנספקציה ופוטנציאל לפוטוטוקסיסיות במהלך דימויי time-lapse ממושכים.
