פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

המטרה הכוללת של אסטרטגיה ניסויית זו היא להבחין בין המכלולים התפקודיים השונים שחלבון עשוי להיות מעורב בהם, וזאת באמצעות הפרקציה של קומפלקסים חלבוניים שעברו טיהור באמצעות זיקה (affinity purification) בשיטת אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד ב-Blue Native, ופרופיל קורלציה של ספקטרומטריית מסות. שיטה זו יכולה לסייע בהוספת מידע ארגוני לרשימות החלבונים הנוצרות בניסויי ספקטרומטריית מסות המבוססים על טיהור באמצעות זיקה. היתרונות העיקריים של הליך זה הם פשטות הביצוע, רזולוציה טובה, ועומס עבודה שאינו עולה בהרבה על זה של CMSMS רגיל בג'ל.

פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לטיהור של קומפלקסים של חלבונים מ-200 עד 500 מיליון תאים המבטאים רמות אנדוגניות של חלבון עם תג FLAG. לאחר הפשרת משק התאים, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, יש להוסיף חמישה מיליליטר של בופר ליזיס קר מאוד המכיל DTT ומעכבי פרוטאז לסספנסיית התאים ולערבב בתנועות סיבוביות. יש להדגיר את הסספנסיה על קרח למשך 10 דקות.

העבר את תרחיף התאים להומגנייזר קר. בכס את התאים באמצעות 20 עד 30 תנועות של העיכה הצפופה עד שלא תהיה צמיגות מורגשת, ולאחר מכן העבר את ההומוגנאט למבחנות מיקרו-צנטריפוגה קרות. לאחר סבב צנטריפוגה, העבר את הליזאט הצלול למבחנה נקייה וקרה, תוך השארת כ-50 µL של ליזאט במבחנה המקורית.

שמרו אליקוט של 35 µL מהליזאט לצורך מדידת ריכוז החלבון ומעקב אחר הטיהור. לאחר מכן, הסירו את הבאפר מהחרו지를 שהוכנו מראש. השהו מחדש את החרוזים ב-1 mL של הליזאט, ולאחר מכן ערבבו עם שאר הליזאט.

דגרו את התערובת על גלגל סיבוב בטמפרטורה של 4 °C למשך שעה עד שעתיים. רכזו את החרוזים לדופן המבחנה באמצעות מגנט. אספו מנת עליון (aliquot) של 30 µL מהנוזל העליון והשליכו את השאר.

יש להשעות את החרו지를 ב-0.5 milliliters של בופר IPP150 באמצעות פיפוט ארבע עד שש פעמים. לאחר מכן, יש להעביר את התו сусפנזיה למבחנה קרה בנפח 1.5 milliliter. לאחר מכן, יש לשטוף את החרו지를 שלוש פעמים עם 0.5 milliliters של בופר FLAG elution native.

עם השטיפה האחרונה, העבירו את החרו지를 למבחנה קרה חדשה. הסירו את הבופר באופן יסודי. השעיו מחדש את החרו지를 ב-100 µL של 200 µg/mL פפטיד 3X5 בבופר אלוציה טבעי.

לאחר מכן, הדגרי בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות תוך סיבוב עדין. אספי את החרו지를 באמצעות המגנט, והעבירי את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה חדשה וקרה. חזרי על שלב זה פעמיים לפני איסוף כלל התמציות (eluates).

רכז את האלוואט לנפח של 25 µL ביחידת סינון צנטריפוגלית באמצעות צנטריפוגה ב-10,000 ×g בטמפרטורה של 4 °C. הכן את הדגימה על ידי הוספת באפר טעינה לדגימות native בריכוז 4X ותוסף דגימה 0.5%G-250 ל-25 µL של האלוואט המרוכז. טען את הדגימה ואת סמני המשקל המולקולרי native, תוך השארת באר ריקה ביניהם.

לאחר מכן, טענו 10 עד 20 µL של 1X native sample loading buffer לכל הבארות הריקות. מלאו את תא הקתודה ב-200 mL של 1X native PAGE dark blue cathode buffer בזהירות, כדי לא להפריע לדגימות. מלאו את תא האנודה ב-550 mL של 1X native PAGE anode buffer.

הריצו את הג'ל במתח של 150 volts למשך 30 דקות. לאחר הפסקת ההרצה, הסירו את באפר הקתודה הכחול הכהה באמצעות פיפט סרולוגית והחליפו אותו ב-1X באפר קתודה כחול בהיר. לאחר המשך ההרצה למשך 60 דקות, פתחו את קסטת הג'ל והשליכו את אחת מפלטות הקסטה.

הג'ל נשאר מחובר ללוחית הקסטה השנייה. מקמי את הג'ל בתבנית המכילה תמיסת קיבוע בכמות מספקת לכיסויו, והדגירי למשך 30 דקות עם ניעור עדין. לאחר מכן, הסירי את תמיסת הקיבוע והחליפי אותה במים לפני סריקת הג'ל.

כדי להתכונן לספקטרומטריית מסות, ראשית הניחו פלטת 96 בארות בעלת תחתית קונית מעל פלטת 96 בארות אחרת לאיסוף הפסולת. נקבו את תחתית הבארות של הפלטה בעלת התחתית הקונית באמצעות מחט במידה 21 gauge. לאחר מכן, הוסיפו 200 µL של 50% acetonitrile ו-0.25% formic acid לבארות של הפלטה הנקובה.

דגרו את ערימת הפלטות בשייקר למשך 10 דקות. לאחר מכן, סובבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-500 ×g למשך דקה אחת, כך שהנוזל יזרום דרך החורים אל פלטת איסוף הפסולת. לאחר חזרה על שלבי השטיפה פעמיים, מלאו את הבארות של פלטת 96 הבארות מנוקבת ב-150 µL של 50 mM ammonium bicarbonate.

בשלב הבא, הניחו את הג'ל על משטח נקי. חתכו את הנתיב המכיל את הדגימה ל-48 פרוסות זהות. חתכו כל פרוסה לשני או שלושה חלקים קטנים יותר, למעט חמש הפרוסות האחרונות בחלקו העליון של הג'ל.

הניחו כל פרוסה באופן רצף בבאר אחת של פלטת 96 בארות שטופה עם קצה מנוקב. הוסיפו 50 µL של acetonitrile לכל באר והדגירו את הפלטה עם ניעור למשך 30 עד 60 דקות. לאחר הסרת הנוזל באמצעות סרכז, הוסיפו לכל באר 200 µL של TSEB בריכוז 2 mM ו-ammonium bicarbonate בריכוז 50 mM.

דגרו את הפלטה תוך써 ניעור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני הסרת הנוזל באמצעות סנטריפוגציה כפי שבוצע קודם לכן. ייבשו את חתיכות הג'ל על ידי הוספת 200 microliters של אצטוניטריל טהור ודגרו תוך ניעור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, עד שחתיכות הג'ל הופכות ללבנות ואטומות. לאחר הסרת האצטוניטריל, הוסיפו 150 microliters של trypsin בתוך ammonium bicarbonate קר לכל באר.

דגרו את הפלטה עם ניעור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. לאחר מכן, הניחו פלטה נקייה בעלת תחתית קונית מתחת לפלטה המכילה את הג'ל, תוך וידוא שהפלטות מכוונות נכונה. לאחר מכן, אספו את הנוזל המכיל את הפפטידים על ידי סנטריפוגציה ב-200 ×g למשך דקה אחת.

הניחו את הפלטה המכילה את הפפטידים במאדה צנטריפוגלי ואידו את הנוזל בזמן ביצוע השלב הבא. הוסיפו 150 µL של 50% acetonitrile, 0.25% formic acid לחתיכות הג'ל. דגרו עם ניעור בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות.

אספו את הנוזל אל הפלטה המיובשת חלקית באמצעות סרטיפוגציה במהירות של 200 ×g למשך דקה אחת. המשיכו באידוי הפלטה המכילה את הפפטידים תוך כדי ביצוע השלב הבא. העבירו את תמיסות הפפטידים לפלטת סינון צנטריפוגלית שטופה.

הניחו פלטה עם תחתית קונית נקייה מתחתיה לאיסוף הפפטידים וסבבו את ערימת הפלטות בצנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן. אידו את הנוזל בפלטה בעלת התחתית הקונית עד שהבארות יתייבשו לחלוטין. לאחר הייבוש, ניתן לכסות את הפלטה במכסה סיליקון ולאחסנה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד לביצוע ספקטרומטריית מסה וניתוח נתונים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

תוצאות מייצגות מההצמדה ההיררכית (hierarchical clustering) של פרופילי נדידה ב-blue native PAGE של Mta2 וחלבונים המטהרים יחד מוצגות כאן כדנדרוגרמה ומפת חום המייצגת את עוצמת החלבונים. פרופיל הנדידה של Mta2 מראה שני שיאים המעידים על שני קומפלקסים נפרדים. חלק מיחידות ה-NuRD מראות דפוס דומה, עם שפע מרבי במבנה בעל המשקל המולקולרי הנמוך יותר.

לעומת זאת, תתי-יחידות אחרות של NuRD נפוצות יותר במכלול ה-NuRD בעל המשקל המולקולרי הגבוה יותר. מצד שני, האינטראקטור של Mta2, שנקרא Cdk2ap1, נמצא רק במכלול ה-NuRD בעל המשקל המולקולרי הגבוה יותר. לאחר ששולטים בטכניקה זו, ניתן לבצעה בתוך יומיים וחצי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור את כל הדגימות והריאגנטים על קרח כדי למנוע דיסוציאציה של קומפלקסים חלבוניים. ניתן להחיל פרוצדורה זו על כל חלבון רצוי, בתנאי שניתן לבחון אותו מהמדיום האפיני באמצעות אלוציה תחרותית בתנאים טבעיים (native). לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון co-immunoprecipitation הפוכה או סדרתית, כדי לתקף את תת-הקומפלקסים שזוהו.