Name: פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: למדו פרוטוקול לטיהור מתחמי חלבון באמצעות Blue Native PAGE וספקטרומטריית מסה. השיטה מספקת רזולוציה גבוהה לניתוח אינטראקציות חלבוניות בקנה מידה גדול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו מומנה על ידי Wellcome Trust (WT098051).

<ol><li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+%28CCM3%29+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li>
<li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking%2C+mass+spectrometry%2C+and+bioinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li>
<li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+a+beautiful+friendship%3A+cross-linking%2Fmass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li>
<li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li>
<li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li>
<li>Kaake, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vivo+cross-linking+mass+spectrometry+platform+to+define+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).</li>
<li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li>
<li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li>
<li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+activator+Mirk%2FDyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha%2Fbeta+MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li>
<li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+soluble+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li>
<li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li>
<li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li>
<li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340(2013).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS%2FMS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li>
<li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE%2FLC-MS%2FMS+and+clustering+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li>
<li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li>
<li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+%28NuRD%29+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li>
<li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+%28Wnt%29+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li>
<li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li>
<li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+%28NuRD%29+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li>
<li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+WDR5+interaction+%28Win%29+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28(2013).</li>
<li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן, אנו מתארים את שימוש טיהור זיקה ואחריו ג&#39;ל אלקטרופורזה כחולה מקורית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה כמותית כדי לפתור קומפלקסי חלבונים. גישה זו מציעה שיטה לפענח רשימות אינטראקצית חלבון חד ממדיות לתוך אסיפות חלבון פונקציונליות. אנחנו מדגימים את השיטה מבוססת על שימוש חלבונים-tagged אפיטופ. עם זאת, אם שורת תאי מבטאי חלבון מתויג אינה זמינה, אלטרנטיבה יכולה להיות להשתמש נוגדנים כנגד החלבון של עניין, בתנאים שיש פפטיד זמין להשיג elution התחרותי ילידים. כמות של חומר המוצא וכמות חרוזים ייתכן שיהיה צורך לשנות בהתאם לרמת הביטוי של חלבון המטרה. אנחנו בדרך כלל לבצע פרוטוקול זה עם 2-5 x 10 8 תאים חומר מוצאים, וזה מספיק אפילו בשביל חלבונים עם רמת ביטוי נמוכה. רכב חיץ תמוגה צריך להיבחר באופן אמפירי כדי להשיגליד כדי להשלים solubilization של פיתיון. זה עשוי להיות מאתגר עבור סוגים מסוימים של חלבונים, ב הכרומטין מסוים או חלבונים בממברנה מחייב. אפשרויות חלופיות כוללות הגדלה כמות מלח, ובלבד מורכב החלבון נחקר הוא יציב מלח גבוה, או באמצעות sonication ו / או טיפול nuclease עבור חלבוני מחייב הכרומטין 20, 29. במקרה של חלבונים בממברנה, מיתוג דטרגנט DDM או digitonin עשוי להיות רצוי 30. במקרה של ה- DNA מחייבת חלבונים, כדאי לכלול nuclease כגון benzonase במהלך שלב טיהור 20. הסרה מלאה של חומצות גרעין מבטיחה כי האינטראקציות זוהו להתרחש בין חלבונים ואינם בתיווך DNA. מרכיב קריטי להביא בחשבון בעת ​​השימוש בגישה זו היא היציבות של המתחם תחת חקירה. ההליך הוא ארוך עשוי להיות כרוך preservinגרם חלבון הלילה מורכב. השגנו הצלחה טובה עם שני מתחמי שיפוץ הכרומטין (ד בודה ומ פרדו, מידע לא מוצג), אבל זה צריך להיבדק. צעד טיהור הזיקה עשוי להתקצר אם נדרש. טכניקות חלופיות שיאפשרו חלוקה מקורית, כגון כרומטוגרפיה הדרה גודל, כבר בשימוש נרחב במשך 50 שנים לאפיין קומפלקסים חלבונים. אנחנו ואחרים הראו כי ההחלטה של עמוד כחול יליד עדיפה על זו מושגת באמצעות כרומטוגרפיה הדרה גודל 20, 31, 32, 33. יתרון נוסף של עמוד כחול ילידים הוא שזה לא דורש מערכות כרומטוגרפיה, שהם יקרים, אלא משתמש בציוד חלבון electrophoretic כי הוא נפוץ במעבדות. במונחים של הידיים על הזמן, שיטה זו אינה כרוכה בעבודה יותר מ א geLC-MS / MS המסורתיתpproach או חלוקת כרומטוגפיות מחוברת. עם זאת, כפי הטכניקות החלוקות ביותר לעשות, יש לו גבול הרזולוציה שלהם. מתחמים כי הם מאוד הומוגנית או קרובים במסה וצורה עשויים להיות מעבר ברזולוציה שמציעה עמוד ילידי כחול, ומכאן בפרוטוקול כפי שדווח כאן לא יכול להיות מוצלח אוניוורסלי בפתרון מתחמים מובהקים עם יחידות משנה משותפות. בנימה מעודדת, היינו מצליחה להפריד שני מתחמי tetrameric דומים מאוד שיתוף שלוש יחידות משנה (M. פרדו, כתב יד בהכנה). מאז ספקטרומטריית מסה הפכה רגישה יותר ויותר, אפילו בכמויות זעירות של interactors שאינו ספציפי ומזהמים ניתן בדגימות AP-MS. הגישה המוצגת כאן עשויה לסייע אפלית interactors אמיתי מפני זיהום רקע בתחום טיהור הזיקה ידי התמקדות תשומת הלב על חלבונים עם פסגות הגירה בקנה אחד עם פסגות הגירת פיתיון על משקל מולקולרי גבוה יותר מזה שלחלבוני monomeric. מספר קבוצות השתמשו בטכניקות חלוקות ואחריו פרופיל מתאם חלבון להתוות קומפלקסי חלבונים בקנה מידה הסלולר ללא צורך בבידוד קודם 10, 11, 12, 34. עם זאת, זה יכול לגרום לכשל לזהות אינטראקציות תת-stoichiometric. השילוב של צעד העשרה באמצעות טיהור זיקה יכול לעזור להתגבר על זה. הגישה המתוארת כאן צריכה להיות שימושית בדרך כלל בשביל לחקור את הטופולוגיה של קומפלקסים חלבוניים לפרום את המתחמים המרובים חלבון נתון לוקח חלק בתוך אותה בהקשר הסלולר. האסטרטגיה היא פשוט מקובל המעבדות כי לא יכול להיות ציוד חלוקת כרומטוגפיות יקר כדי לפתור קומפלקסי חלבונים.

בתאים, רוב החלבונים תפקידיהם באמצעות אינטראקציות חלבון-חלבון חולף או על ידי יצירת מכלולים חלבון יציב. אפיון אינטראקציות חלבון חיוני בתהליכים תאיים הבנה לחלוטין. טיהור זיקה בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (AP-MS) היא אחת האסטרטגיות ביותר מיושמות כלל לזהות אינטראקציות חלבון ילידים. שיפורים משמעותיים ביכולות מכשיר השיגו בעשור האחרון הפכו גישה זו עצמה אדירה. חשוב לציין כי האינטראקציות שזוהו על ידי ניסויי AP-MS כוללות תערובת של עמותות ישירות ועקיפות בין הפיתיון פושט. בנוסף, לעתים קרובות חלבונים להשתתף בכמה מתחמים שונים בתוך אותו בהקשר הסלולר, אשר עשוי להיות תפקידים ביולוגיים שונים, ולכן interactors שמזוהים על ידי AP-MS אולי מייצגות מגוון של מכלולי חלבון נפרדים או ישויות פונקציונליות. לא ניתן לגזורמידע טופולוגי כאלה מראש מהרשימות מונו-ממדי של החלבונים שיוצרים ניסויי AP-MS פשוט. עם זאת, הטכניקה ניתן לניצול נוסף כדי להגדיר את הארכיטקטורה של קומפלקסי חלבונים על ידי שילוב עם שיטות אחת או יותר כדי לפתור מכלולים אלה. על מנת לפתור את הטופולוגיה של אינטראקציות חלבון המזוהות באמצעות AP-MS, מספר אסטרטגיות יושמו. גישה אחת היא לבצע ניסויי AP-MS איטרטיבי באמצעות הפושט מזוהה בסיבוב קודם של ניסויים כמו פיתיונות 1. למרות מאוד אינפורמטיבי, זה בהחלט משימת עבודה אינטנסיבית הוא בניסוי ומדוקדק. חלבון cross-linking בשילוב עם ספקטרומטריית מסה נמצא בשימוש יותר ויותר כדי להפיק מידע טופולוגי על קומפלקסים חלבונים 2, 3, 4, 5. עם זאת, computatioניתוח סופי של פפטידים צולבים עדיין נותר משימה מאתגרת ולכן הוא צוואר הבקבוק בתהליך העבודה. הופעתו של ריאגנטים MS-cleavable cross-linking צריכה להקל מיפוי של שאריות חומצת אמינו הנמצאות בסמיכות אינטראקצית חלבונים 6, 7. חלופה נוספת היא לשלב טיהור זיקה עם טכניקות הפרדה מאונכות לפני 8, 9. חלוקת זיהוי תכונות חומרים על ידי סינון ג&#39;ל או החלפת יונים, או חלוקת שיפוע סוכרוז יש גם לאחרונה נעשתה שימוש בשילוב עם ספקטרומטריית מסה כמותית לתאר מתחמי multiprotein ברמה מערכתית, על ידי עקיפת שלב הבידוד המורכב 10, 11, 12, 13. ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידי כחול (BN-עמוד) יושמה באופן נרחבלחקור אינטראקציות חלבון מקומיות, בדרך כלל אלה בקומפלקסי חלבון קרום המיטוכונדריה 14. טכניקת פרדה זו גם שמשה לאחרונה בשילוב עם כימותי חלבון ללא תווית ו פרופיל מתאם, לא רק על מתחמי המיטוכונדריה 15, 16, 17, אלא גם עבור התרת קומפלקסי חלבונים אחרים מתאי כולה 18, 19. החוקרים שערו כי השילוב של טיהור זיקה עם גישות חלוקות מקורות עוקבות וכמותיים MS אמור לספק אסטרטגיה שימושית לפתרון מכלולי חלבון מרובים המכילים חלבון מסוים. כאן אנו מתארים שיטה המשלבת טיהור זיקה מבוססת אפיטופ גנרית עם ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידי הכחול של המתחמים המבודדים, ואחריו sp מסה כמותיתectrometry ו פרופיל מתאם חלבון, כדי לפתור את המכלולים המרובים חלבון עלול להיות מעורב. אנו מעסיקים תאי גזע עוברי בעכבר שבו חלבון של העניין התמזג תג epitope מתבטא מן הלוקוס אנדוגני להשיג קרוב שפע פיסיולוגי ולהבטיח ילידים יעילים בידוד מורכב. גישה זו פורמת את האינטראקציות המרובות חלבון עוסק, כדי לפתור אותן לתוך אסיפות נפרדות על פי פרופיל המתאם שלהם, בעוד שאינה מצריך עבודה יותר geLC-MS 20 הקונבנציונלי.

<table><tbody><tr><td>חלבון G Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, דרגת חלבון, תמיסה של 10%</td><td>Millipore</td><td>655206</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל פימלימידאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>80490</td><td></td></tr><tr><td>0.2 M מאגר טריאתנולאמין, pH 8.2</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T0449</td><td></td></tr><tr><td>3x FLAG peptide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 5K NMWCO, PES</td><td>Sartorius</td><td>VS0112</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel</td><td>Life Technologies</td><td>BN1001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Cathode Additive</td><td>Life Technologies</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>4x מאגר טעינת מדגם NativePAGE</td><td>Life Technologies</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>NativeMARK</td><td>Life Technologies</td><td>LC0725</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 5% G-250 תוסף לדוגמא&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>BN2004</td><td></td></tr><tr><td>Nunc תחתון חרוטי 96 בארות, פוליפרופילן</td><td>Thermo</td><td>249944</td><td></td></tr><tr><td>Multiscreen HTS מערכת סינון 96 בארות</td><td>Thermo</td><td>MSDVN6550</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96 בארות טבעי</td><td>Thermo</td><td>276002</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>יודואצטמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל, HPLC כיתה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A/0627/17</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין, דרגת ריצוף</td><td>Roche</td><td>11418475001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant (תוכנה)</td> <td>N.A.</td><td>נ.א.</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td></tr><tr><td>פרסאוס (תוכנה)</td> <td>נ.א.</td><td>נ.א.</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td></tr></tbody></table>

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

רוב החלבונים פועלים בשיתוף עם אחרים; לפיכך, חיוני לאפיין את היחידות הפונקציונליות הללו על מנת להבין באופן מלא תהליכים ביולוגיים. טיהור זיקה יחד עם ספקטרומטריית מסה (AP-MS) הפך לשיטת הבחירה לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון. עם זאת, מחקרי AP-MS קונבנציונליים מספקים מידע על אינטראקציות חלבון, אך המידע הארגוני הולך לאיבוד. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו אסטרטגיה לחשיפת המכלולים הפונקציונליים המובהקים שחלבון עשוי להיות מעורב בהם, על ידי פתרון קומפלקסים של חלבונים מטוהרים בזיקה לפני אפיונם על ידי ספקטרומטריית מסה. קומפלקסים של חלבונים המבודדים באמצעות טיהור זיקה של חלבון פיתיון באמצעות תג אפיטופ ופליטה תחרותית מופרדים באמצעות אלקטרופורזה מקורית כחולה. השוואה של פרופילי נדידת חלבונים באמצעות פרופיל מתאם באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית מאפשרת הקצאה של חלבונים הפועלים באינטראקציה לישויות מולקולריות נפרדות. שיטה זו מסוגלת לפתור קומפלקסים של חלבונים בעלי משקלים מולקולריים קרובים שאולי לא ייפתרו על ידי טכניקות כרומטוגרפיות מסורתיות כגון סינון ג'ל. עם מעט יותר עבודה מאשר AP-geLC-MS/MS קונבנציונלי, אנו מדגימים שאסטרטגיה זו עשויה במקרים רבים להספיק להשגת מידע טופולוגי מורכב חלבוני במקביל לזיהוי אינטראקציות חלבון.

זרימת העבודה של פרופיל מתאם חלבון יליד הכחול טיהור הזיקה ידי ספקטרומטריית מסה (ABC-MS) אסטרטגיה מתוארת באיור 7. קומפלקסים חלבונים Native סביב חלבון של עניין מבודדים על ידי טיהור זיקה באמצעות נוגדנים נגד תג אפיטופ (ב FLAG במקרה זה) ו elution תחרותי. המתחמים נפתרים על ידי BN-עמוד, ואת שביל ג&#39;ל כולה הוא נכרת לתוך 48 חלקים, והכינו עבור רובה LC-MS / MS. מידע כמותי MS משמש לצורך יצירת פרופיל ההעברה של כל חלבון מזוהה ברחבי ההפרדה ילידי כחול. חלבונים כי האינטראקציה כדי ליצור פרופילי הגירה דומים מורכבת תצוגה ברורה עם פסגות superimposable. כאשר חלבון של עניין לוקח חלק בלמעלה מ הרכבה אחד, פסגות מרובות הם נצפו פרופיל ההגירה שלה, בהינתן תת-המתחמים נמצאים בתוך כושר ההפרדה של ג&#39;ל הכחול מהקורה. השוואה שיטתית של המיגפרופילים מנה יכולה להיות מושגת על ידי מתאם חלבון פרופיל משתמש אשכולות היררכי. Dendrogram ואת עוצמות השיא עבור כל השברים הם דמיינו במפה-חום, הקלת זיהוי של אינטראקצית חלבונים ששייכים קומפלקסי חלבונים נפרדים (איור 8). השתמשנו באסטרטגיה זו כדי לנתח את השותפים באינטראקציה של Mta2, למקטע הליבה של הכרומטין NuRD שיפוץ 20 מורכבים. כפי שניתן לראות בתרשים 9, פרופיל ההגירה של Mta2 מוצג שני שיאים של עוצמות מובהקות בין 700 kDa ו 1.2 מד&quot;א, עם שיא המסה התחתון מוצג שפע גבוה. תת-יחידות ליבת NuRD אחרות, כולל Mta1 / 3, Hdac1 / 2 ו Mbd3, הראו דפוס הפרדה זהה, אם כי הפסגות לכמה יחידות המשנה, כלומר Chd4, Gatad2a / b ו- Rbbp4 / 7, היה חלוקת השפע ההפוכה (איור 9 א, B). לעומת זאת, הפרופיל של CDK2ap1, גורם רגולטורים הוא מגייס את מורכבות NuRD יזמי גן Wnt 23, הציג רק את שיא המסה הגבוה יותר (איור 9 ג), וכך עשיתי Sall4, A מדכא תעתיק כי גם הוכח לאגד 20 NuRD, 24, 25. לפיכך, החלוקה של חלבוני Mta2 הקשורים מטוהר זיקה לפי דף הכחול ילידים הצליחה לפתור שתי צורות שונות של מורכבות NuRD. גם ABC-MS מאפשרת זיהוי של interactors רומן תוך הקצאה אותם גופי חלבון מסוימים. באמצעות בחינה של אשכולות חלבונים בעוצמות שבריר מיוצג א-מפת חום זיהינו מתאם חזק בין יחידות משנה NuRD ו Wdr5, למקטע רגולטוריות של המתחם methyltransferase MLL 26, עם Wdr5 מוצגות שתי פסגות הגירה חופפות עם p שני NuRDeaks (איור 8), דבר המצביע על אינטראקציה הרומן בין Wdr5 ו NuRD. אנחנו אישר אינטראקציה זו על ידי שיתוף immunoprecipitation ושיתוף ההגירה כרומטוגרפיה הדרה גודל 20. הבחירה של חישוב מרחק מטרי של האשכולות ההיררכיים תשפיע על צורת האשכולות ומכאן המתאמים. אנו ממליצים להתנסות מדדים השונים כדי להשיג את ההתאמה הטובה ביותר עם ידע אינטראקציה קיים של החלבון או מורכבות עניין. באופן כללי השגנו את התוצאות הטובות ביותר עם מטר מרחק מנהטן (L1) 20. מתאם פירסון או מדדי מרחק האוקלידית גם דווח לזיהוי מתחמים המבוססים על טכניקות חלוקה אלטרנטיבית 10, 11, 12. קוואןנתוני titative MS המתקבל שהברים הכחולים ילידים יכולים לשמש גם כדי לקבוע את והרכב של קומפלקסי חלבונים. IBAQ ערך (כימות מוחלטת מבוסס בעוצמה) מספק מדד של השפע היחסי של החלבונים שזוהו 27, 28. ערכי iBAQ לחברי מורכב החלבון בכל שהברים בתוך שיא נדידת פרופיל מתנרמלים לזה של חלבון הפיתיון כדי להשיג כמויות יחסיות. IBAQs מנורמל פני שיא פרופיל עבור חבר מורכב חלבון נתון צריך לעקוב מגמה אופקית, ואת ערכי המגמה לשקף את והרכב של חלבוני האינטראקציה ביחס חלבון הפיתיון. לקבלת ייצוג מפורט יותר של חישובים ורכב, לראות 20. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> איור 7: עבודה סכמטי המסכם את ABC-MS יםtrategy. נתון זה שונה מ 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="הספרה 8" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> איור 8. אשכולות היררכיים של פרופילי הגירת BN-עמוד של interactors Mta2. החלבונים הקשורים Mta2 הצטופפו על סמך מידת הדמיון של פרופילי ההגירה שלהם. רק קבוצת משנה של מפת החום המכילה קומפלקס NuRD מוצג (מצורף באריזת הכחול). התיבה הצהובה מדגישה את הקורלציה החזקה של Wdr5 עם מורכבות NuRD. המשקלים המולקולריים המבוארים נאמדו מן מרחקי ההגירה של סטנדרטי חלבון לרוץ באותו ג&#39;ל. מחקר זה פורסם במקור ב פרוטאומיקה מולקולרי ותאי 20 האגודה האמריקאית לביוכימיה מו<html> ביולוגית lecular. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> איור 9. פרופיל הגירה BN-עמוד של יחידות משנה NuRD וחלבונים הקשורים. א) יחידות משנה Mta2 ו NuRD נוכח דפוס בעוצמה דומה. B) יחידות משנת Mta2 ו NuRD עם הדפוס העוצם ההפוך. ג) Mta2 ו Cdk2ap1, המהווה כיום רק ישות NuRD משקל מולקולרי גבוה. המשקלים המולקולריים המבוארים נאמדו מפרופיל הגירה של סטנדרטי החלבון. מחקר זה פורסם במקור ב מולקולרי ותא פרוטאומיקה 20 האגודה האמריקנית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית._blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="קובץ משלימה" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> נתונים משלימים: נתונים לדוגמה. MaxQuant הנגזרות קובץ proteingroups.txt המכיל הזדהויות חלבון וערכי כימותים מניסוי ABC-MS. מחקר זה פורסם במקור ב מולקולרי ותא פרוטאומיקה 20 האגודה האמריקנית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

המטרה הכוללת של אסטרטגיה ניסויית זו היא להבחין בין המכלולים התפקודיים השונים שחלבון עשוי להיות מעורב בהם, וזאת באמצעות הפרקציה של קומפלקסים חלבוניים שעברו טיהור באמצעות זיקה (affinity purification) בשיטת אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד ב-Blue Native, ופרופיל קורלציה של ספקטרומטריית מסות. שיטה זו יכולה לסייע בהוספת מידע ארגוני לרשימות החלבונים הנוצרות בניסויי ספקטרומטריית מסות המבוססים על טיהור באמצעות זיקה. היתרונות העיקריים של הליך זה הם פשטות הביצוע, רזולוציה טובה, ועומס עבודה שאינו עולה בהרבה על זה של CMSMS רגיל בג'ל.פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לטיהור של קומפלקסים של חלבונים מ-200 עד 500 מיליון תאים המבטאים רמות אנדוגניות של חלבון עם תג FLAG. לאחר הפשרת משק התאים, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, יש להוסיף חמישה מיליליטר של בופר ליזיס קר מאוד המכיל DTT ומעכבי פרוטאז לסספנסיית התאים ולערבב בתנועות סיבוביות. יש להדגיר את הסספנסיה על קרח למשך 10 דקות.העבר את תרחיף התאים להומגנייזר קר. בכס את התאים באמצעות 20 עד 30 תנועות של העיכה הצפופה עד שלא תהיה צמיגות מורגשת, ולאחר מכן העבר את ההומוגנאט למבחנות מיקרו-צנטריפוגה קרות. לאחר סבב צנטריפוגה, העבר את הליזאט הצלול למבחנה נקייה וקרה, תוך השארת כ-50 µL של ליזאט במבחנה המקורית.שמרו אליקוט של 35 µL מהליזאט לצורך מדידת ריכוז החלבון ומעקב אחר הטיהור. לאחר מכן, הסירו את הבאפר מהחרו지를 שהוכנו מראש. השהו מחדש את החרוזים ב-1 mL של הליזאט, ולאחר מכן ערבבו עם שאר הליזאט.דגרו את התערובת על גלגל סיבוב בטמפרטורה של 4 °C למשך שעה עד שעתיים. רכזו את החרוזים לדופן המבחנה באמצעות מגנט. אספו מנת עליון (aliquot) של 30 µL מהנוזל העליון והשליכו את השאר.יש להשעות את החרו지를 ב-0.5 milliliters של בופר IPP150 באמצעות פיפוט ארבע עד שש פעמים. לאחר מכן, יש להעביר את התו сусפנזיה למבחנה קרה בנפח 1.5 milliliter. לאחר מכן, יש לשטוף את החרו지를 שלוש פעמים עם 0.5 milliliters של בופר FLAG elution native.עם השטיפה האחרונה, העבירו את החרו지를 למבחנה קרה חדשה. הסירו את הבופר באופן יסודי. השעיו מחדש את החרו지를 ב-100 µL של 200 µg/mL פפטיד 3X5 בבופר אלוציה טבעי.לאחר מכן, הדגרי בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות תוך סיבוב עדין. אספי את החרו지를 באמצעות המגנט, והעבירי את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה חדשה וקרה. חזרי על שלב זה פעמיים לפני איסוף כלל התמציות (eluates).רכז את האלוואט לנפח של 25 µL ביחידת סינון צנטריפוגלית באמצעות צנטריפוגה ב-10,000 ×g בטמפרטורה של 4 °C. הכן את הדגימה על ידי הוספת באפר טעינה לדגימות native בריכוז 4X ותוסף דגימה 0.5%G-250 ל-25 µL של האלוואט המרוכז. טען את הדגימה ואת סמני המשקל המולקולרי native, תוך השארת באר ריקה ביניהם.לאחר מכן, טענו 10 עד 20 µL של 1X native sample loading buffer לכל הבארות הריקות. מלאו את תא הקתודה ב-200 mL של 1X native PAGE dark blue cathode buffer בזהירות, כדי לא להפריע לדגימות. מלאו את תא האנודה ב-550 mL של 1X native PAGE anode buffer.הריצו את הג'ל במתח של 150 volts למשך 30 דקות. לאחר הפסקת ההרצה, הסירו את באפר הקתודה הכחול הכהה באמצעות פיפט סרולוגית והחליפו אותו ב-1X באפר קתודה כחול בהיר. לאחר המשך ההרצה למשך 60 דקות, פתחו את קסטת הג'ל והשליכו את אחת מפלטות הקסטה.הג'ל נשאר מחובר ללוחית הקסטה השנייה. מקמי את הג'ל בתבנית המכילה תמיסת קיבוע בכמות מספקת לכיסויו, והדגירי למשך 30 דקות עם ניעור עדין. לאחר מכן, הסירי את תמיסת הקיבוע והחליפי אותה במים לפני סריקת הג'ל.כדי להתכונן לספקטרומטריית מסות, ראשית הניחו פלטת 96 בארות בעלת תחתית קונית מעל פלטת 96 בארות אחרת לאיסוף הפסולת. נקבו את תחתית הבארות של הפלטה בעלת התחתית הקונית באמצעות מחט במידה 21 gauge. לאחר מכן, הוסיפו 200 µL של 50% acetonitrile ו-0.25% formic acid לבארות של הפלטה הנקובה.דגרו את ערימת הפלטות בשייקר למשך 10 דקות. לאחר מכן, סובבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-500 ×g למשך דקה אחת, כך שהנוזל יזרום דרך החורים אל פלטת איסוף הפסולת. לאחר חזרה על שלבי השטיפה פעמיים, מלאו את הבארות של פלטת 96 הבארות מנוקבת ב-150 µL של 50 mM ammonium bicarbonate.בשלב הבא, הניחו את הג'ל על משטח נקי. חתכו את הנתיב המכיל את הדגימה ל-48 פרוסות זהות. חתכו כל פרוסה לשני או שלושה חלקים קטנים יותר, למעט חמש הפרוסות האחרונות בחלקו העליון של הג'ל.הניחו כל פרוסה באופן רצף בבאר אחת של פלטת 96 בארות שטופה עם קצה מנוקב. הוסיפו 50 µL של acetonitrile לכל באר והדגירו את הפלטה עם ניעור למשך 30 עד 60 דקות. לאחר הסרת הנוזל באמצעות סרכז, הוסיפו לכל באר 200 µL של TSEB בריכוז 2 mM ו-ammonium bicarbonate בריכוז 50 mM.דגרו את הפלטה תוך써 ניעור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני הסרת הנוזל באמצעות סנטריפוגציה כפי שבוצע קודם לכן. ייבשו את חתיכות הג'ל על ידי הוספת 200 microliters של אצטוניטריל טהור ודגרו תוך ניעור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, עד שחתיכות הג'ל הופכות ללבנות ואטומות. לאחר הסרת האצטוניטריל, הוסיפו 150 microliters של trypsin בתוך ammonium bicarbonate קר לכל באר.דגרו את הפלטה עם ניעור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. לאחר מכן, הניחו פלטה נקייה בעלת תחתית קונית מתחת לפלטה המכילה את הג'ל, תוך וידוא שהפלטות מכוונות נכונה. לאחר מכן, אספו את הנוזל המכיל את הפפטידים על ידי סנטריפוגציה ב-200 ×g למשך דקה אחת.הניחו את הפלטה המכילה את הפפטידים במאדה צנטריפוגלי ואידו את הנוזל בזמן ביצוע השלב הבא. הוסיפו 150 µL של 50% acetonitrile, 0.25% formic acid לחתיכות הג'ל. דגרו עם ניעור בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות.אספו את הנוזל אל הפלטה המיובשת חלקית באמצעות סרטיפוגציה במהירות של 200 ×g למשך דקה אחת. המשיכו באידוי הפלטה המכילה את הפפטידים תוך כדי ביצוע השלב הבא. העבירו את תמיסות הפפטידים לפלטת סינון צנטריפוגלית שטופה.הניחו פלטה עם תחתית קונית נקייה מתחתיה לאיסוף הפפטידים וסבבו את ערימת הפלטות בצנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן. אידו את הנוזל בפלטה בעלת התחתית הקונית עד שהבארות יתייבשו לחלוטין. לאחר הייבוש, ניתן לכסות את הפלטה במכסה סיליקון ולאחסנה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד לביצוע ספקטרומטריית מסה וניתוח נתונים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.תוצאות מייצגות מההצמדה ההיררכית (hierarchical clustering) של פרופילי נדידה ב-blue native PAGE של Mta2 וחלבונים המטהרים יחד מוצגות כאן כדנדרוגרמה ומפת חום המייצגת את עוצמת החלבונים. פרופיל הנדידה של Mta2 מראה שני שיאים המעידים על שני קומפלקסים נפרדים. חלק מיחידות ה-NuRD מראות דפוס דומה, עם שפע מרבי במבנה בעל המשקל המולקולרי הנמוך יותר.לעומת זאת, תתי-יחידות אחרות של NuRD נפוצות יותר במכלול ה-NuRD בעל המשקל המולקולרי הגבוה יותר. מצד שני, האינטראקטור של Mta2, שנקרא Cdk2ap1, נמצא רק במכלול ה-NuRD בעל המשקל המולקולרי הגבוה יותר. לאחר ששולטים בטכניקה זו, ניתן לבצעה בתוך יומיים וחצי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור את כל הדגימות והריאגנטים על קרח כדי למנוע דיסוציאציה של קומפלקסים חלבוניים. ניתן להחיל פרוצדורה זו על כל חלבון רצוי, בתנאי שניתן לבחון אותו מהמדיום האפיני באמצעות אלוציה תחרותית בתנאים טבעיים (native). לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון co-immunoprecipitation הפוכה או סדרתית, כדי לתקף את תת-הקומפלקסים שזוהו.

resolving-affinity-purified-protein-complexes-blue-native-page

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בסרטון זה, אנו מתארים את האפיון של מתחמי multiprotein (MPCs) על ידי כחול אלקטרופורזה בג'ל יליד polyacrylamide (BN-PAGE). במימד ראשון, lysates הסלולר dialyzed מופרדים על ידי-BN לזהות MPCs בודדים. במימד השני SDS-PAGE, MPCs עניין מחולקים נוספת לנתח בוחריהם ידי immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח...

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

סרטון זה מדגים טיהור זיקה טנדם – טכניקה לטיהור קומפלקסים חלבוניים מתאים איקריוטים כדי לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון. הקומפלקס מכיל שני חלבונים המסומנים בתגי אפיטופ שונים. עם טיהור המתחם באמצעות שני שרפים בעלי זיקה לשני התגים השונים באופן רציף, נוכחותם של שני החלבונים באלוטה מאשרת את האינטראקציה בין השניים.

בדיקת טיהור זיקה טנדם לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

חלבונים מתקשרים זה עם זה ואינטראקציות אלה קובעות במידה רבה את תפקודיהם. ניתן לזהות שותפים לאינטראקציה עם חלבונים בתפוקה גבוהה in vivo באמצעות בדיקת כושר שמרים המבוססת על בדיקת השלמת שבר חלבון דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לשבש בתאי יונקים ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורה קריוגני, לייצר תמצית התא מן אבקת התא וכתוצאה מכך, ולבודד קומפלקסים חלבונים של עניין על ידי לכידת זיקה על חרוזים פאראמגנטיים בקנה מידה מיקרון מצמידים נוגדנים.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

שיטה לייצוב ומפריד קומפלקסי חלבוני ילידים מן lysate ללא שינוי הרקמות באמצעות אמין-reactive protein צולב מקשר מצמיד את ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו ממדי רומן (עמוד) מערכת מוצגת.

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

הפרוטוקול BN-MS רב-תכליתי באמצעות מיקרוטומה מוצג ברזולוציה גבוהה complexome פרופיל.

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

מאמר זה מספק הליך לטיהור זיקה של חלבון רקומביננטי אנושי, דש אנדונוקלאז 1 (FEN1), אשר תויג בתג 6X-היסטידין. הפרוטוקול כולל שימוש בשני עמודי יונים מתכתיים משותקים נפרדים לטיהור החלבון המתויג.

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר 

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לכידה וזיהוי של אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות למחלה מתאים ורקמות מקומיות באמצעות בדיקות כימיות וספקטרומטריית מסה. מערכי הנתונים של האינטראקציה המתקבלים מנותחים באמצעות פלטפורמה ייעודית מבוססת אינטרנט כדי לחשוף ליקויים דינמיים ברשת ושינויים במסלול הקשורים למחלות.

מיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא מתפקדות במחלה

למדו פרוטוקול לטיהור מתחמי חלבון באמצעות Blue Native PAGE וספקטרומטריית מסה. השיטה מספקת רזולוציה גבוהה לניתוח אינטראקציות חלבוניות בקנה מידה גדול.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

גלה סרטונים נוספים