Name: הדמית פליטת אור של neuroinflammation בעכברים טרנסגניים לאחר היקפיים הרכבה של אלפא-Synuclein סיבים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: למד הדמיית ביולומינסנציה לכימות נוירואינפלמציה במערכת העצבים המרכזית בעכברים טרנסגניים לאחר הזרקה היקפית של סיבי אלפא-סינוקלאין. שיטה זו מאפשרת מעקב לא פולשני לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים אולגה שארמה, תרזה Hundt, והצוות של מתקני מיקרוסקופיה ובעלי חיים DZNE לקבלת תמיכה טכנית.

כל הנהלים כולל חיות בוצעו באישור ועדת הגנה על בעלי חיים של הסוכנות להגנת הסביבה נורדריין וסטפליה המדינה (LANUV). בעלי חיים שוכנו ומטופל בהתאם לתנאים סטנדרטיים עם אור 12 h / מחזור כהה גישה חופשית למזון ומים. 1. מודל חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Intercross hemizygous Tg (GFAP -luc +/-) עכברים עם hemizygous Tg (M83 +/-) עכברים כדי ליצור hemizygous bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) בעכברים 15, 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גנוטיפ הצאצאים עם PCR בזמן אמת עבור נוכחות של אלפא-synuclein האנושי קידוד transgene ועם PCR תקן גחלילית בלוציפראז 12, 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן את בעלי החיים בגיל שישה עד שמונה שבועות. </li></ol> 2. הכנת בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן moאלפא-synuclein אנושי רקומביננטי nomeric עם המוטציה A53T מלוחים שנאגרו טריס (TBS) מאגר המכיל 150 מ&quot;מ NaCl ב 20 mM Tris-HCl (pH 7.2) כפי שתואר קודם לכן 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אלפא-synuclein סִיבִי לצורך חיסונים על ידי התססה 3 מיקרוגרם / μL של synuclein-אלפא אנושי רקומביננטי monomeric ב שייקר מסלולית ב 800 סל&quot;ד ו 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל מכלולים הפיברילות ב פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) כדי להגיע לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / μL עבור intraperitoneal או 2 מיקרוגרם / μL עבור חיסונים intraglossal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבר את סיבי synuclein-אלפא עם sonicator מוט עבור 1 דק &#39;(40 פולסים של משך s 0.5 עם הפסקה של שנייה אחת בין כל דופק ואת משרעת מוגדרת 50%) על קרח. כדי למנוע זיהום על ידי זריעת צלב. להשתמש בדיקות sonication נקיות להכין בידוד שונה. </li></ol> 3. זריקות Intraglossal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חיות עם intrapeהזרקת ritoneal של 100 מ&quot;ג / ק&quot;ג קטמין 10 מ&quot;ג / ק&quot;ג xylazine. לצבוט את הבוהן של החיה ולאשר שזה לא לסגת hindlimb שלה כדי להבטיח הרדמה תקין. השתמש במשחת וטרינר על העיניים של החיה כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן חיות מסוממות בזהירות עם דבק על גבי צלחת חימום בעמדת גב שכיבה עם ראשם פונה לכיוון החוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מזרק חד פעמי 27 G עם 5 μL של סיבים-synuclein אלפא sonicated או PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחי אגודל פחוסת-חוטם אחד עם טיפים משוננים להחזיק את הפה של החיה פתוחה, וזוג נוסף קטן יותר של מלקחיים בזהירות לשלוף את הלשון כדי להפוך את הצד התחתון של הלשון נגישה עבור הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את המחט של המזרק לתוך הצד התחתון הימני או השמאלי של הלשון בסמיכות העצבה תת-הלשון. לאט לאט להזריק את הבידוד אחרי 5 ימים. לאט לאט חוזר בי את המחט לאחר 5 ימים כדי להבטיח כי הבידודחדרה הרקמה והוא לא איבד תוך שמבטלת את המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את החיה מן הקיבעונות שלו ולהשאיר אותו על צלחת חימום תת ניטור מתמיד עד להחלמה מלאה. </li></ol> 4. זריקות intraperitoneal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זריקות intraperitoneal, לְהַרְדִים החיות בקרוב תא הרדמה משאיפת עם חמצן isoflurane / באמצעות קצב הזרימה של 2 ליטר / דקה ו מאדה מוגדר 2%. לצבוט את הבוהן של החיה ולאשר שזה לא לסגת hindlimb שלה כדי להבטיח הרדמה תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מזרק חד פעמי 27 G עם 50 μL של סיבים-synuclein אלפא sonicated או PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישירות להזריק לתוך הצפק של עכבר ולהימנע חודר למעי או cecum קטן הממוקם מאחורי קיר הבטן על ידי החזקת החיה בעמדה הגב עם הראש מול הרחק החוקר וכלפי מטה על כ 45 °. מעקב אחר בעלי חיים עד שהם התאוששומן ההרדמה. </li></ol> 5. הדמיה פליטת אור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tg תמונה (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים כל 2-4 שבועות באמצעות מערכת הדמיה פליטת אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההדמיה בקרוב להרדים עכברים בתא isoflurane / חמצן עם קצב זרימה של 2 ליטר / דקה ו מאדה מוגדרת 2%. לצבוט את הבוהן של החיה ולאשר שזה לא לסגת hindlimb שלה כדי להבטיח הרדמה תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גילוח את שער ראשי העכברים עם קרם מקריח. צבע את האוזניים בשחורות בטוש לא מעצבן לחסום פליטת אור נוקבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל מלח אשלגן D-luciferin, המצע של luciferase, ב PBS פתרון המניות 30 מ&quot;ג / מ&quot;ל. בחנות זו ב 1 aliquots מ&quot;ל ב -20 ° C. הגנו על D-luciferin מומס מחשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את החיות לפני ההזרקה. חשב את נפח המדויק של D-luciferin עבור הזרקה של 150 מ&quot;ג / ק&quot;ג משקל גוף. Intraperitoneally להזריק D-luciferin ולהחזיר את בעל החיים בתא הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנת ההדמיה. לאחר מערכת ההדמיה הגיעה טמפרטורת ההפעלה שלה לאתחל את המערכת על ידי לחיצה על הכפתור &quot;האתחול&quot; בלוח הבקרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את &quot;אור פלורסנט&quot; ו &quot;צילום&quot; הכפתורים. קבע את זמן החשיפה כדי 60 s, binning אל &quot;בינונית&quot;, ה- F / Stop ל &quot;1&quot;, ואת רווח EM ל &quot;כבוי&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא מסנן עירור מוגדר &quot;בלוק&quot; ואת מסנן פליטה ל&#39;פתח &#39;, ולהגדיר את גובה בכפוף 1.50 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עשר דקות לאחר הזרקה עם D-luciferin, למקם את החיות לצלחת החימום בחדר ההדמיה ולהבטיח כי חרטומם ממוקם כראוי לשקע ההרדמה. סגור את זרימת isoflurane / חמצן מבית הבליעה שאיפה לפתוח את הזרימה עבור חדר ההדמיה עם קצב זרימה של 0.25 L / min ו אידוי של 2%. סגור את הדלת של יחסי ציבור לחדר ההדמיהoperly. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;רוכש את&quot; כדי למדוד את פליטת האור, אשר לוקח 60 s. עצור את זרימת isoflurane ולנטר את החיות עד שהם התאוששו לחלוטין לאחר שחזר אותם בחזרה לכלובים שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת ההדמיה לכמת את פליטת האור. בעמוד התווך &quot;Palette Tool&quot; לבחור &quot;כלים ROI&quot;. תחת &quot;סוג&quot; בתוך &quot;כלי ROI&quot; בחר &quot;ROI המדידה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעמוד התווך &quot;כלים ROI&quot; על הכלי &quot;המעגל&quot; ובחר את מספר ROIs לצייר מהתפריט לנתץ - אידיאלי &quot;3&quot; במשך שלושה עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתמונה, לחיצה ימנית על כל ROI ותחת &quot;מאפיינים&quot; להתאים את הרוחב והגובה של 1.25 ס&quot;מ. מיקום כל ROI על האזור במוח היא לכמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפינה הימנית העליונה של התמונה, להגדיר בלוח יחידות &quot;זוהר (פוטונים)&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעמוד התווך &quot;Palette Tool&quot;, ובחר &quot;תמונה כוונן&quot; ולהתאים את המינימוםהמקסימום של &quot;סולם צבעים&quot;, למשל, מן 0.20e6 כדי 1.00e6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;קובץ&quot; לשמור את הנתונים עם &quot;שמור&quot;. </li></ol> 6. ניתוח ביוכימיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את המוח ואת מיתרי השדרה פי פרוטוקולים הוקמה 18, 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize כולו מוח ודגימות חוט השדרה כולו בנפרד PBS בנוכחות מעכבי פרוטאז ו phosphatase (מדולל ל X 1 ב PBS) בשני 30 מחזורים של עם 6000 סל&quot;ד ב homogenizer רקמות. ודא כי המוח ודגימות וחוט השדרה הומוגני לריכוז סופי של 20% (wt / כרך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate דגימות פעמיים תוך שמירה על אותם על הקרח עם דופק קבוע של 10 s ו משרעת מוגדר 50%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את homogenates כדי 10% ב PBS ו 750 מ&quot;מ NaCl ידי דילול אותם 1: 1 עם 1.5 M NaCl ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפריד את הפסולת התאית, צנטריפוגות homogenates ב 1000 XG במשך 5 דקות ב4 ° C. שמור את supernatants לקראת השלבים הבאים וזורקים כדורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז החלבון homogenates באמצעות חומצה bicinchoninic assay (BCA) על פי הוראות היצרן. דגירה 1.0 מ&quot;ג של חלבון סך homogenates המוח או 0.8 מ&quot;ג מן homogenates חוט השדרה ב N-laurylsarcosyl בריכוז סופי של 10% (wt / כרך) במשך 15 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את homogenates על כרית סוכרוז 3 מ&quot;ל של 10% (wt / כרך) במים מזוקקים ultracentrifuge אותם 465,000 XG עבור 1 ש &#39;ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורי במאגר המכיל סולפט dodecyl 4% נתרן (SDS), 2% β-mercaptoethanol, 192 גליצין מ&quot;מ, 25 מ&quot;מ טריס, ו 5% (wt / כרך) סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיח את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דק &#39;ומעלה אותם על ג&#39;ל SDS-polyacrylamide אלקטרופורזה בתוך חומצת morpholineethanesulfonic מערכת חיץ (MES). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלבונים מופרדים כדי polyvinylidene difluoride (PVDF) ממברנות בתוך SEMidry סופג מערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ממברנות ב 0.4% (כרך / כרך) פתרון פורמלין PBS עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר על הרוטור עם 35 סל&quot;ד כדי צולבות הקישור החלבונים עם הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את ממברנות ב TBS חיץ המכיל 0.05% (כרך / כרך) Tween 20 ו 5% (wt / כרך) חלב 1 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כתם עם הנוגדן הראשוני חסימת חיץ בין הלילה ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את ממברנות שלוש פעמים TBS חיץ דגירה אותם עם נוגדנים משני peroxidase- או fluorophore מצומדות ב TBS עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את הנוגדנים משני מחויב chemiluminescence או פלואורסצנטי פי פרוטוקולים הוקמו 20. </li></ol> 7. ניתוח Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים את המוח גזור מיתרי השדרה בתחנת עיבוד רקמות ולהטביע אותם פרפין באמצעות תחנת פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את TIS פרפין-מוטבעתובעת עם microtome ב 8 חלקי העטרה עבים מיקרומטר ו הר בסעיפים בשקופיות זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparaffinize בסעיפי הרקמות ידי דוגרים להם שתי אמבטיות xylol נפרדות במשך 5 עד 10 דקות ו רעננותם אותם באמצעות סדרה של אמבטיות אתנול מדורגים (100%, 90%, 70%, 50%) ולבסוף עם H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת מקטעי חיץ ציטראט 0.01 M (pH 6.0) עבור 5 דקות בטמפרטורת חדר ובנוסף להרתיח אותם 10 דקות במיקרוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנו חלקים להתקרר לטמפרטורת החדר דגירה אותם עם פתרון חמצן 3% עבור 30 דקות כדי לעכב peroxidases אנדוגניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הסעיפים רקמה על ידי הדגירה עם 20% (כרך / כרך) בסרום עז נורמלי, 1% (כרך / כרך) אלבומין בסרום שור (BSA), ו 0.5% טריטון X-100 ב PBS עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה החלקה עם הנוגדן העיקרי מדולל 1% (כרך / כרך) בסרום עז נורמלי, 1% (כרך / כרך) BSA, ו 0.25% Triton X-100 ב PBS הלילה בשעה C ° 4. </li> &lt;li&gt; לשטוף את הסעיפים פעמיים עם 0.25% (כרך / כרך) טריטון X-100 ב PBS ופעם עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם בסעיפים עם נוגדנים משני fluorophore מצומדות המקביל ואת DAPI צבע גרעיני מדולל 1% (כרך / כרך) בסרום עז נורמלי, 1% (כרך / כרך) BSA, ו PBS עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת פעמיים עם 0.25% (כרך / כרך) טריטון X-100 ב PBS ופעם עם PBS, coverslip השקופיות עם התקשורת הטבעה ולדמיין מכתים עם מיקרוסקופ סורק לייזר confocal. </li></ol>

<ol><li>Aguzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+Beyond+the+prion+principle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: Beyond the prion principle.</a> Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).</li>
<li>Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body-like+pathology+in+long-term+embryonic+nigral+transplants+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease.</a> Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5), 504-506 (2008).</li>
<li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+bodies+in+grafted+neurons+in+subjects+with+Parkinson%27s+disease+suggest+host-to-graft+disease+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation.</a> Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).</li>
<li>Hansen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+propagates+from+mouse+brain+to+grafted+dopaminergic+neurons+and+seeds+aggregation+in+cultured+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells.</a> J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).</li>
<li>Masuda-Suzukake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+spreading+of+pathological+alpha-synuclein+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain.</a> Brain. 136 (4), 1128-1138 (2013).</li>
<li>Holmqvist, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+Parkinson+pathology+spread+from+the+gastrointestinal+tract+to+the+brain+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats.</a> Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338 (6109), 949-953 (2012).</li>
<li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+CNS+alpha-synuclein+pathology+by+fibrillar+and+non-amyloidogenic+recombinant+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathol Commun. 1, 38(2013).</li>
<li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+injection+of+alpha-synuclein+induces+CNS+alpha-synuclein+pathology+and+a+rapid-onset+motor+phenotype+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).</li>
<li>Mougenot, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+acceleration+of+a+synucleinopathy+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model.</a> Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).</li>
<li>Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prion+neuroinvasion+following+tongue+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Rapid prion neuroinvasion following tongue infection.</a> J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).</li>
<li>Tamgüney, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+prions+by+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Measuring prions by bioluminescence imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).</li>
<li>Watts, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+multiple+system+atrophy+prions+to+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).</li>
<li>Breid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinvasion+of+alpha-Synuclein+Prionoids+after+Intraperitoneal+and+Intraglossal+Inoculation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation.</a> J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).</li>
<li>Giasson, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+alpha-synucleinopathy+with+severe+movement+disorder+in+mice+expressing+A53T+human+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein.</a> Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+imaging+of+GFAP+expression+after+neuronal+damage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice.</a> Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).</li>
<li>Bernis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+propagation+of+human+brain-derived+alpha-synuclein+in+transgenic+mice+expressing+human+wild-type+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75(2015).</li>
<li>Gunther, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+testing+and+spinal+cord+removal+in+a+mouse+model+for+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS).</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+MPTP+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease.</a> Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).</li>
<li>Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+systems+for+westerns%3A+chemiluminescence+vs.+infrared+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection.</a> Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+bacterial+endotoxin+generates+a+distinct+strain+of+alpha-synuclein+fibril%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril.</a> Sci Rep. 6, 30891(2016).</li>
<li>Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+pathogenesis%3A+disease+onset+is+characterized+by+marked+induction+of+GFAP+in+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells.</a> Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).</li>
<li>Stöhr, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+synthetic+Abeta+prion+strains+producing+different+amyloid+deposits+in+bigenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+inoculation+of+pathological+alpha-synuclein+initiates+a+rapidly+progressive+neurodegenerative+alpha-synucleinopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice.</a> J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).</li>
<li>Recasens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body+extracts+from+Parkinson+disease+brains+trigger+alpha-synuclein+pathology+and+neurodegeneration+in+mice+and+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys.</a> Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).</li>
<li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+CNS+alpha-synuclein+pathology+by+fibrillar+and+non-amyloidogenic+recombinant+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38(2013).</li>
<li>Peelaerts, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+strains+cause+distinct+synucleinopathies+after+local+and+systemic+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration.</a> Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).</li>
</ol>

החוקרים אין לחשוף.

הזרקה היקפית של סיבים-synuclein אלפא לתוך הצפק של Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים מייצגים שיטה קלילה כדי לגרום פגיעה עצבית מלווית neuroinflammation לשחזר מאפיינים חשובים של synucleinopathies. באופן דומה, הזרקת הלשון מייצגת נתיב אחר neuroinvasion ידי prionoids-synuclein אלפא בעכברים טרנסגניים אבל הוא פחות יעיל. בחרנו לסיים את הניסויים שלנו בכתובת 420 ימים לאחר הזרקה ואנחנו לא יכולים לשלול את האפשרות כי יותר או כל העכברים שהוזרקו הפיברילות עשוי פתחה...

יש ראיות הולכות ומצטברים כי-synuclein אלפא יש מאפיינים דומים לאלו של חלבון הפריון, במיוחד ביכולתה-זרע עצמי להפיץ misfolding בין תאים לאורך מסלולים עצביים. מאפיין זה של synuclein אלפא גם נקרא &quot;פריון דמוי&quot; או &quot;prionoid&quot;, והוא נתמך על ידי תצפיות וניסויים להשתלה, אשר מצביעים על ההדבקה של synuclein אלפא misfolded מנוירונים חולה כדי הושתל נוירונים בריאים 1, 2 , 3, 4. כמו כן הזרקה ישירה של-synuclein אלפא misfolded לתוך המוח או בפריפריה, למשל בשריר hindlimb או לדופן המעי, התוצאות התפשטות פתולוגיה אלפא-synuclein לחלקים הדיסטלי של 5 CNS, 6, 7, &lt;sup class = &quot;Xref&quot;&gt; 8, 9, 10. ניתחנו העברת prionoids-synuclein אלפא באמצעות מסלולים היקפיים בפירוט יותר התייחס לשאלה האם-synuclein אלפא misfolded עשויה neuroinvade העצבים המרכזית לאחר intraglossal יחיד או זריקה intraperitoneal, תכונה שבעבר הוכח עבור פריונים אבל לא עבור אלפא misfolded synuclein. לאחר ההזרקה של פריונים לתוך הלשון, neuroinvasion של CNS מושג באמצעות התפשטות לאורך העצב תת-הלשון של הלשון שמובילה את הגרעין של עצב תת-לשון, הנמצא בגזע המוח 11. כמו במודל של עכברים בחרנו Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים כי ביטוי יתר של מוטציה A53T של synuclein אלפא האדם מן האמרגן הפריון, ו גחלילית בלוציפראז בשליטה של האמרגן GFAP לפקח ההפעלה astrocytic ידי פליטת אור, כמו בעבר הראו במוח שלפריון נגוע עכברים 12. בידיים שלנו bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים לא לפתח מחלת עד 23 חודשים של גיל כפי שהוכח על ידי אחרים 13. זריקה אחת של סיבי-synuclein אלפא האנושי דרך intraglossal או מחלה נוירולוגית הנגרמת המסלול intraperitoneal עם פתולוגיה במוחם ואת מיתרי השדרה של Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים תומכים בהשערה כי prionoids-synuclein אלפא אפיונים חשובים עם פריונים 14.

<table><tbody><tr><td>נוגדן נגד אקטין</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד אלפא-סינוקלאין, נוגדן פוספו S129 [pSyn#64]</td> <td>Wako</td><td>015-25191</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אלפא-סינוקלאין, נוגדן פוספו S129 [EP1536Y]</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334 01</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד IBA-1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד Sequestosome-1 (p62)</td><td>Proteintech</td><td>18420-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד יוביקוויטין [Ubi-1]</td> <td>Merck Millipore</td><td>MAB1510</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>קטמין&nbsp;</td><td>רציופארם</td><td></td><td>100 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>רציופארם</td><td></td><td>10 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>מזרק 27 גרם</td><td>VWR</td><td>613-4900</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן&nbsp;</td><td>Piramal Healthcare</td><td>PZN&nbsp; קרם</td> אפילציה 4831850 <td></td></tr><tr><td></td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secureline סמן מעבדה&nbsp;</td><td>Neolab</td><td>25040</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin מלח אשלגן</td><td>Acris</td><td>LK10000</td><td>30 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5776671</td><td></td></tr><tr><td>Sonopuls Mini20 סוניקטור</td><td>Bandelin</td><td>3648</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II מערכת הדמיה</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image 3.0 תוכנת</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עכברי Tg(M83+/-) או B6; עכברי C3-Tg (Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>004479</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים דפוס סטנדרטי</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11000-16</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים בתבנית צרה</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>N-laurylasarcosyl</td><td>Sigma</td><td>L5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP אולטרה-צנטריפוגה&nbsp;</td>רוטור <td>בקמן קולטר</td><td></td><td>TLA-110&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות פוליקרבונט עבי דופן</td><td>בקמן קולטר</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi ג'ל חלבון</td><td>תרמו פישר Scientific</td><td>WG1401BOX</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן מצומד HRP</td><td>קיימן</td><td>קיימן10004301-1</td><td></td></tr><tr><td>IR צבע 680 נוגדן מצומד&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura מצע משך מורחב</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיה Stella 3200 מערכת הדמיה</td><td>Raytest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey מערכת הדמיה אינפרא אדום&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SA/T8787</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF ממברנה</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma</td><td>Roth</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>Sigma</td><td>SA/00216763/000500</td><td>תמיסת עבודה 3%</td></tr> <tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3294-100G</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>דילול עבודה 1:50,000</td></tr><tr><td>Fluoromount media&nbsp;</td><td>Omnilab</td><td>SA/F4680/000025</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מעכבי פרוטאז ופוספטאז HALT</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10516495</tr><tr><td>Precellys 24-Dual הומוגנייזר&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>91-PCS24D</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 נוגדן מצומד</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31619</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 נוגדן מצומד</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&nbsp; חומצות אמינו מסועפות שרשרת&nbsp; חלבון&nbsp; בדיקה&nbsp; ערכת</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>10741395</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום RM2255</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי</td><td>קארל זייס</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הדמית פליטת אור של neuroinflammation בעכברים טרנסגניים לאחר היקפיים הרכבה של אלפא-synuclein סיבים

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

כדי ללמוד את ההתנהגות כמו-הפריון של synuclein אלפא misfolded, מודלי עכבר נדרשים המאפשרים שידור מהיר ופשוט של prionoids אלפא-synuclein, אשר גורם בנוירופתולוגיה בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מתארים כי intraglossal או זריקה intraperitoneal של הסיבים-synuclein אלפא לתוך bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים, אשר ביטוי יתר אלפא-synuclein אדם עם מוטציה A53T מן האמרגן חלבון הפריון ו גחלילית בלוציפראז מ האמרגן עבור חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP), מספיקה כדי לגרום למחלה neuropathologic. בהשוואה הומוזיגוטיים Tg (M83 + / +) בעכברים כי לפתח סימפטומים נוירולוגיים חמורים מתחיל בגיל של 8 חודשים, הטרוזיגוטיים Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) חיות להישאר חופשי של המחלה ספונטנית עד שהם יגיעו בגיל 22 חודשים. מעניין, הזרקה של סיבי synuclein-אלפא באמצעות intraperitoneאל מסלול מושרה מחל נוירולוגית עם שיתוק בארבעה מתוך חמש Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים עם זמן דגירה החציוני של 229 ± 17 ימים. חיות נושאים מחלות הראו פיקדונות חמורים-synuclein אלפא פוספורילציה במוחם וחוטי שדרה. הצטברויות של synuclein אלפא היו sarkosyl-מסיסות ו colocalized עם היוביקוויטין ו p62, ולוו תגובה דלקתית וכתוצאה מכך דבק astrocytic ו microgliosis. באופן מפתיע, חיסון של סיבי synuclein-אלפא לתוך הלשון היה פחות יעיל בגרימת מחלה עם רק אחד מחמש חיות מוזרקות מראות פתולוגיה-synuclein אלפא לאחר 285 ימים. הממצאים שלנו מראים כי חיסון באמצעות המסלול intraglossal ועוד זאת דרך המסלול intraperitoneal מתאים לגרום מחלה נוירולוגית עם סימני ההיכר הרלוונטיים synucleinopathies ב Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) בעכברים. זה מספק מודל חדש לחקר הפריון דמוי בפתוגנזה לגרוםפ לפי prionoids-synuclein אלפא ביתר פירוט.

הזרקה היקפית של prionoids-synuclein אלפא באמצעות הלשון או בנוירופתולוגיה מושרה הצפק ב CNS של bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים (לוח 1 ואיור 1). לאחר הזרקת intraperitoneal יחידה עם סיבים-synuclein אלפא, ארבעה מתוך חמישה עכברים פתחו מחל נוירולוגית עם זמן דגירה החציוני של 229 ± 17 ימים. באופן מפתיע, רק אחד מחמישה עכברים פיתחו מחלת CNS לאחר הזרקת intraglossal עם הסיבים-synuclein ...

הזרקה היקפית של סיבים-synuclein אלפא לתוך הצפק או הלשון של Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים, המבטאים אלפא-synuclein אדם עם מוטצית A53T משפחתית בלוציפראז גחלילית, יכול לגרום בנוירופתולוגיה, כולל neuroinflammation , במערכת העצבים המרכזית שלהם.

הדמית פליטת אור של neuroinflammation בעכברים טרנסגניים לאחר היקפיים הרכבה של אלפא-Synuclein סיבים

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

המטרה הכללית של שיטת הדמיית הביולומינסנציה זו היא לכמת נוירו-דלקת (neuroinflammation) במערכת העצבים המרכזית של מודל עכברים למחלת הפרקינסון לאחר הזרקה היקפית של סיבי alpha-synuclein. שיטה זו יכולה לסייע בקביעת המועד והמידה שבה מתרחשת נוירו-דלקת במודלים של עכברים למחלות ניווניות של מערכת העצבים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לנטר את הנוירו-דלקת באופן לא פולשני ובחוזר עד שחלק מהעכברים יפתחו מחלה נוירולוגית.המשמעות של טכניקה זו היא אבחון של מחלה נוירולוגית בשעה העשירית, כיוון שעלייה בביולומינסנציה עקב דלקת עצבית לא רק מלווה את המחלה הנוירולוגית, אלא לעיתים קרובות מקדימה אותה. התחל בהרדמה נאותה של בעל החיים לצורך הניתוח. בצע צביטה בבהו של בעל החיים ואשר כי הוא אינו מושך את הגפה, דבר המעיד על הגעה למישור הרדמה כירורגי.מרחו משחה עינית למניעת התייבשות בזמן ההרדמה. השתמשו בסרט דביק כדי לקבע בזהירות את בעל החיים על פלטת חימום בתנוחה גבית (dorsal recumbent), כאשר הראש פונה לעבר החוקר. לאחר מכן, מלאו מזרק תת-עורי חד-פעמי בכיול 27 gauge בחמישה microliters של סיבי alpha-synuclein שעברו סוניקציה.בשלב הבא, השתמשו בזוג פינצטות בעלות קצה קהה כדי להחזיק את פיו של בעל החיים פתוח, והשתמשו בזוג הפינצטות הקטן יותר כדי למשוך בזהירות את הלשון החוצה, כך שהחלק התחתון של הלשון יהיה נגיש להזרקה. הכניסו את מחט המזרק לצדו התחתון הימני או השמאלי של הלשון, בסמיכות לעצב ההיפוגלוסלי (hypoglossal nerve). לאחר חמישה שניות, הזריקו את האינוקולום באיטיות.השאירו את המחט במקומה למשך חמש שניות נוספות כדי להבטיח שהאינוקולום יחדור לרקמה, ולאחר מכן הוציאו את המחט בזהירות. לאחר ההזרקה, שחררו את בעל החיים והשאירו אותו על פלטת החימום תחת ניטור מתמיד עד להחלמה מלאה. עבור הזרקות תוך-peritoneum, הרדימו את בעלי החיים לזמן קצר בתא הרדמה עם isoflurane.שוב, צבטו את בהו של בעל החיים ואשרו כי הוא אינו מסוגל להסיט את הגפה האחורית כדי לוודא הרדמה תקינה. מלאו מזרק היפודרמי חד-פעמי בכיול 27 ב-50 µL של סיבי alpha-synuclein שעברו סוניקציה, או PBS. החזיקו את בעל החיים במנח גבי (dorsal) כאשר הראש פונה הרחק מהחוקר ולמטה בזווית של כ-45 מעלות.הזריק ישירות לחלל הפריטונאום (peritoneum) של העכבר, תוך הקפדה שלא לחדור למעי הדק או למעי העיוור הנמצאים מאחורי דופן הבטן. עקב את בעלי החיים עד להתאוששותם מההרדמה. לפני הדימות, גלח והסר שיער מהראשים של עכברים שהורדמו באמצעות isoflurane.צבעו את האוזניים בשחור באמצעות טוש שאינו גורם לגירוי כדי לחסום ביולומינצנציה לא ספציפית. שקלו את בעלי החיים לפני ההזרקה. לאחר מכן, חשבו את הנפח המדויק של D-Luciferin להזרקה במינון של 150 milligrams per kilogram של משקל גוף.הזריק באופן תוך-peritonium (intraperitoneally) את הנפח המחושב של D-Luciferin, ולאחר מכן החזר כל חיה לתא ההרדמה. הפעל את תוכנת ההדמיה. לאחר שמערכת ההדמיה תגיע לטמפרטורת העבודה שלה, אתחל את המערכת על ידי לחיצה על כפתור ה-Initialize בלוח הבקרה.לאחר מכן בחרו בכפתורי Luminescent ו-Photograph. הגדירו את זמן החשיפה ל-60 seconds, את ה-Binning ל-medium, את ה-F/Stop ל-one, ואת ה-EM gain ל-off. בחרו ב-Block ולאחר מכן ב-Open.לאחר מכן, תחת הלשונית subject height, בחרו 1.50 מהתפריט הנפתח. עשר דקות לאחר ההזרקה של D-Luciferin, הניחו את בעלי החיים על לוח החימום בתא ההדמיה, וודאו ששריריהם ממוקמים נכון בפתח ההרדמה. העבירו את זרימת האיסופלורן מתא השאיפה לתא ההדמיה, וסגרו כראוי את דלת תא ההדמיה.לחצו על כפתור ה-acquire כדי למדוד את הביולומינסנציה, פעולה הנמשכת 60 שניות. הפסיקו את זרימת האיסופלורן, ולאחר מכן החזירו את בעלי החיים לכלוביהם. השתמשו בתוכנת ההדמיה כדי לכמת את הביולומינסנציה על ידי פתיחת תפריט לוח כלי העבודה (tool palette) ובחירה ב-ROI Tools.תחת type, בחרו ב-Measurement ROI. בתוך ROI Tools, לחצו על כלי העיגול ובחרו את מספר ה-ROIs לשרטוט מהתפריט הנפתח. באופן אידיאלי, שלושה עבור שלושה עכברים.בתמונה, לחצו לחיצה ימנית על כל ROI ובתפריט המאפיינים (properties), התאימו את הרוחב והגובה ל-1.25 centimeters. מקמו כל ROI מעל אזור המוח הנמדד. בפינה השמאלית העליונה של התמונה, הגדירו בלוח היחידות את הערך radiance in photons.לאחר מכן פתחו את תפריט לוח כלי העבודה. בחרו בתיקון תמונה (image adjust) וכווננו את המינימום והמקסימום של סולם הצבעים. לדוגמה, מ-200,000 למיליון אחד.לבסוף, תחת תפריט קובץ (file), לחצו על שמירה (save) כדי לשמור את הנתונים. כפי שמוצג כאן, לאחר הזרקה תוך-peritoneal של סיבי alpha-synuclein, ארבעה מתוך חמישה עכברים טרנסגניים מסוג A53T synuclein GFAP luciferous reporter פיתחו מחלה נוירולוגית בתוך 229 ימים, כפי שמוצג על ידי הריבועים הסגולים. עם זאת, רק אחד מחמישה עכברים שהוזרקו בדרך ה-interglossal פיתח מחלה נוירולוגית בתוך 285 ימים, כפי שמוצג על ידי העיגולים הירוקים.דימוי ביולומינצנציה חשף כי העכברים הטרנסגניים פלטו ביולומינצנציה מוגברת מהמוח ומחוט השדרה שלהם, זמן קצר לפני שהופיעו בהם סימנים למחלה נוירולוגית. ביולומינצנציה זו הייתה בולטת יותר לאחר הזרקה תוך-peritoneal ולא נצפתה לאחר הזרקת PBS, מה שמעיד על היעדר גליוזיס אסטרוציטית. איור זה מציג את הביולומינצנציה במוחות של עכברים טרנסגניים לאורך זמן לאחר הזרקה תוך-peritoneal של סיבי alpha-synuclein.כפי שמוצג על ידי העיגולים הכחולים, הירוקים, החומים והכתומים. רמות מוגברות של ביולומינסנציה מעל סף של 2 מיליון פוטונים לשנייה לסנטימטר רבוע לסטראדיאן נצפו מספר שבועות לפני שארבעת העכברים האינדיבידואליים הללו פיתחו סימנים נוירולוגיים של מחלה. אחת מחמשת בעלי החיים הראתה גם רמות מוגברות של ביולומינסנציה זמן קצר לפני מותה, 285 ימים לאחר הזרקה תוך-לשונית של סיבי alpha-synuclein.לעומת זאת, עבור עכברי ביקורת בריאים שהוזרק להם PBS, ועבור בעל חיים אחד שלא פיתח את המחלה לאחר הזרקה תוך-peritoneal, כאשר סיבי alpha-synuclein מסומנים בעיגולים אדומים, אות הביולומינצנציה נותר מתחת לסף במהלך תקופת התצפית. צביעה אימונופלואורסצנטית של חתכי מוח מבעלי חיים חולים באמצעות נוגדנים נגד GFAP ו-Iba1 איששה נוירו-דלקת עם מיקרוגליאוזיס ואסטרוציטים ריאקטיביים באזורים עם משקעי alpha-synuclein. בעלי חיים בריאים שלא הצטברו אצלם משקעי alpha-synuclein הראו צביעה מועטה ל-GFAP ו-Iba1.ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן לבצעה בפחות משעה אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הניוּרו-דגנרציה לחקור באופן לא פולשני דלקת עצבית במערכת העצבים המרכזית של עכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מזריקים פריברילים של alpha-synuclein באופן היקפי לעכברים, וכיצד לבצע דימוי ביולומינצנציה כדי לנטר דלקת עצבית ב-CNS.המטרה הכוללת של הפרוצדורה היא להשרות פריפריאלית מחלה נוירולוגית באמצעות הזרקה תוך-לשונית או תוך-פריטונית של סיבי alpha-synuclein, ולבצע דימות לא פולשני של השראת הנוירו-דלקת לאורך זמן.

bioluminescence-imaging-neuroinflammation-transgenic-mice-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים שיטה שוב ושוב לדמיין microglia Murine והפצת...

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

מחלת פרקינסון כבר קשור לחשיפה לחומרי הדברה. כאן אנו מציגים שיטה כדי לספק חומרי הדברה באמצעות צינור קיבה בריכוז הרצוי שיטה לנתח את ההשפעה שלהם הצטברות אלפא synuclein במערכת העצבים enteric.

אוראלית של Rotenone באמצעות Gavage וניתוח מקדימה של Alpha-synuclein תכלילים במערכת העצבים enteric

שימוש בלוציפראז ובמערכות הדמית vivo (IVIS) כרומן האמצעי לזיהוי נקודתי קצה מחלה לפני התפתחויות קליניות להתרחש. IVIS אפשר לנו לחזות בזמן אמתו את הפלישה של וירוסי אנצפליטיים מעל ימים מרובים, מתן מודל מחלה מדויקת יותר למחקר עתידי. זה גם אפשר לנו לזהות את התכונות המגנות הפוטנציאליות של תרופות אנטי וחיסונים מהר יותר ממודלים של בעלי חיים מנוצלים כיום. היכולת לנצל חיות בודדות מעל נקודתי זמן מרובות מבטיחה דרישות מופחתות בבעלי חיים, עלויות ותחלואה הכוללת לבעלי החיים מנוצלים להבטיח אמצעי הומני יותר ויותר...

איתור vivo מערכות הדמיה (IVIS) של וירוס אנצפליטים נוירו פולשנית

סרטון זה מדגים הזרקה של סיבי אלפא-סינוקלאין לעכבר כדי לגרום לדלקת עצבית. הסיבים מוזרקים תוך צפקית לעכבר מהונדס המבטא חלבוני אלפא-סינוקלאין שעברו מוטציה. עם הגעתם למערכת העצבים המרכזית, הסיבים נכנסים לנוירונים וגורמים לצבירה של החלבונים שעברו מוטציה. הצברים התפשטו לתאי עצב שכנים, מיקרוגליה ואסטרוציטים. זיהוי הצברים מעורר תאי מיקרוגליה לגרום לדלקת עצבית, ולפגוע בנוירונים.

השראת דלקת עצבית בעכברים באמצעות הזרקת סיבי אלפא-סינוקלאין

מקור: Breid, S., et. al. הדמיה ביולומינסנציונית של דלקת עצבית בעכברים טרנסגניים לאחר חיסון היקפי של סיבי אלפא-סינוקלאין. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את הדמיית הביולומינסנציה של דלקת עצבית בעכברים טרנסגניים, ומציג תגובות לוציפראז-לוציפרין באסטרוציטים פעילים. הפרוטוקול מאפשר כימות לא פולשני של הפעלה אסטרוציטית, ומסייע למחקרים על דלקת במערכת העצבים המרכזית ויעילות טיפולית.

הדמיה ביולומינסנציה של דלקת עצבית בעכבר טרנסגני

מקור: בוסקו, א., .  In vivo דינמיקה של הפעלת מיקרוגליה ברשתית במהלך ניוון עצבי: הדמיה אופטלמוסקופית קונפוקלית ומורפומטריית תאים בגלאוקומה של עכברים. J. Vis. Exp. (2015)} סרטון זה מדגים הדמיה in vivo של מיקרוגליה ברשתית במודל עכבר של גלאוקומה. עכבר טרנסגני עם מיקרוגליה ברשתית המבטאת חלבון פלואורסצנטי ממוקם מתחת לאופטלמוסקופ. תאורת אינפרא אדום משמשת לאיתור ראש עצב הראייה (ONH), ומישור המוקד נוצר באמצעות כלי דם ברשתית כציוני דרך. לאחר מכן משתמשים בהדמיה פלואורסצנטית כדי להמחיש את המיקרוגליה...

הדמיה in vivo של מיקרוגליה ברשתית במודל עכבר של גלאוקומה

מקור: Schmitz, K., et al., bioluminescence והדמיה קרובה לאינפרא אדום של דלקת עצב הראייה ודלקת מוחית במודל EAE של טרשת נפוצה בעכברים. J. Vis. Exp. (2017).סרטון זה מדגים את השיטה להמחשה וניטור של דלקת מוח אוטואימונית ניסיונית או דלקת הנגרמת על ידי EAE בעצב הראייה באמצעות הדמיית ביולומינסנציה. זה כולל מיקום העכבר, הזרקת ריאגנטים ולכידת תמונות עוקבות כדי לנטר שינויים בביולומינסנציה לאורך זמן.

הדמיית ביולומינסנציה במודל עכבר EAE

אנו מתארים שיטת הדמיה לא פולשנית להבחנה שלבים דלקתיים. משלוח מערכתי של לומינול מגלה תחומים של דלקת חריפה תלויות על פעילות MPO בנויטרופילים. לעומת זאת, הזרקה של lucigenin מאפשרת הדמיה של דלקת כרונית תלויה בפעילות phox במקרופאגים.

בשיטת ההדמיה vivo להבחין דלקת אקוטית וכרונית

אנו מציגים טכניקה פליטת אור in vivo חי קרוב אינפרא אדום הדמיה של בעצב הראייה דלקת המוח של encephalomyelitis אוטואימוניות הניסוי (EAE) מודל לטרשת נפוצה בעכברים SJL / J.

הדמית פליטת אור קרוב אינפרא אדום של אופטיק בעצב המוח דלקת במודל EAE של טרשת נפוצה בעכברים

פרוטוקול זה מתאר איך ברזולוציה גבוהה טכניקות הדמיה כגון טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי, סריקת לייזר ophthalmoscopy יכול להיות מנוצל מכרסמים קטנים, באמצעות מערכת פלטפורמה אופטלמולוגיות הדמיה, כדי לקבל מידע על עובי רשתית, microglial תא הפצה, בהתאמה.

אין ויוו הדמיה של עכברים כתב Cx3cr1gfp/gfp עם תחומים הספקטרום טומוגרפיה אופטית קוהרנטית, סריקת לייזר Ophthalmoscopy

המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק מערכת מבוססת תא משכפל היווצרות של אלפא-synuclein אגרגטים ויוו. תכלילים תאיים אלפא-synuclein הם זרועה בנוירונים הראשי על-ידי הפנמת האמונה, הפצת אקסוגני מנוהל אגרגטים מקורי microsomes-הקשורים אלפא-synuclein מבודד מן העכברים הטרנסגניים חולה אלפא-synuclein.

הממשל אקסוגני של אלפא-synuclein Microsomes-הקשורים אגרגטים כדי נוירונים העיקרי כמודל תא עוצמה היווצרות הסיבים

למד הדמיית ביולומינסנציה לכימות נוירואינפלמציה במערכת העצבים המרכזית בעכברים טרנסגניים לאחר הזרקה היקפית של סיבי אלפא-סינוקלאין. שיטה זו מאפשרת מעקב לא פולשני לאורך זמן.

הדמית פליטת אור של neuroinflammation בעכברים טרנסגניים לאחר היקפיים הרכבה של אלפא-Synuclein סיבים

גלה סרטונים נוספים