איתור של הפנמת קולטן מצמיד חלבון G-מופעל ליגנד ידי מיקרוסקופי Confocal

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לספק שיטה יעילה וקלה לפירוש לאיתור לוקליזציה והפנמה תת-תאית של חלבוני היתוך GPCR מבוטאים בתאי יונקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח בתחום לוקליזציה של חלבונים תת-תאיים, כגון הפנמת קולטנים ומיחזורם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה בקלות וביעילות.

כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה בניטור ואיתור GPCRs. וזה יכול לחול גם על מערכות אחרות, כגון חלבון ציטופלזמי וגרעיני. לאחר התאוששות ומעבר תאי HEK293 על פי פרוטוקול הטקסט, כאשר התאים גדלו לכמעט מפגש, השליכו את מצע הגידול המאוזן, הוסיפו שני מיליליטר PBS וסובבו את הכלי כדי לשטוף את התאים.

השליכו את ה-PBS, והוסיפו מיליליטר אחד של טריפסין EDTA. כדי לעכל לחלוטין את התאים, סובבו בזהירות את המנה ושאבו מהתמיסה. לאחר מכן, הכניסו את המנה לאינקובטור C02 עם מעטפת מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.

בזמן שהתאים דוגרים, הכינו צלחת של שש בארות על ידי הוספת שני מיליליטר של מצע גידול מאוזן לכל באר. לאחר מכן, כאשר התאים התרוממו מתחתית המנה, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום גידול מאוזן לתבשיל. מערבבים על ידי פיפטינג ומעבירים מיד 0.1 מיליליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת שש הבארות המוכנה.

פיפטה בעדינות את התרחיף בבארות, ודגירה על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. למחרת, ודא שהתאים הם 85-95% מתלכדים. לאחר מכן, לשני צינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים, הוסף שלושה מיקרוגרם של DNA פלסמיד ו -100 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת לצינור אחד.

בינתיים, הוסף תשעה מיקרוליטר של מגיב אחד ו -100 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת לצינור אחר. דגרו את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. שלב את תערובת הפלסמיד המדוללת עם מגיב מדולל.

לאחר מכן, מערבבים בעדינות את התמיסה, ודוגרים אותה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. שאפו את המדיום של התאים והוסיפו 1.5 מיליליטר DMEM טרי ללא FBS. לאחר מכן, הוסיפו 215 מיקרוליטר של תערובת ריאגנטים של טרנספקציה DNA לכל באר, וערבבו בעדינות על ידי סיבוב הצלחת.

דגרו על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך ארבע עד שמונה שעות. לאחר מכן, החלף את המדיום ב-DMEM טרי עם 10% FBS. דגרו על התאים למשך 24 עד 48 שעות נוספות לפני ביצוע ניסויים כלשהם.

יעילות הטרנספקציה עשויה להשתנות מאוד בקווי תאים שונים. לכן, ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה של הישיבה והדקירה בתצהיר בהתאם לסוג התא הספציפי בו נעשה שימוש. הסר את מצע הגידול מצלחת התרבות של שש בארות.

לאחר מכן, השתמש במיליליטר אחד של PBS כדי לשטוף את שכבת התא החד-שכבתית. מוסיפים 0.5 מיליליטר טריפסין EDTA, מערבבים את המנה ושואבים מהתמיסה. לאחר מכן, דגרו את צלחת התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.

במהלך הדגירה, הכנס כיסויים סטריליים בקוטר 15 מילימטר לכל באר של צלחת 12 בארות. השעו מחדש את התאים בנפח קטן של מדיום גידול שלם טרי, והעבירו את מספר התאים הנדרש לצלחת 12 הבאר עם תלושי כיסוי. לאחר מכן, דגרו על התאים למשך 16 עד 24 שעות.

לאחר 16 עד 24 שעות של דגירה, כאשר התאים גדלו לכמעט מפגש, הוסיפו חמישה מיקרו-מולרים של שמיר בדיקת הממברנה לכל באר, והחזירו את התאים לאינקובטור למשך 30 דקות. הסר את מצע הגידול המאוזן והשתמש ב- PBS קר כדי לשטוף את התאים פעמיים. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של 4% PFA לכל באר, וערבבו את התאים למשך 15 דקות כדי לתקן את התאים.

בעזרת PBS יש לשטוף את התאים הקבועים פעמיים, ואז להוסיף 200 עד 300 מיקרוליטר DAPI לכל באר, ולדגור את הצלחת למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים עם PBS פעמיים, הסר בזהירות את הכיסויים מהצלחת, ונתף את המאגר העודף. הפוך את הכיסויים על שקופיות מיקרוסקופ טעונות בטיפה אחת של מדיום הרכבה.

לאחר מכן, הסר את אמצעי ההרכבה העודף מהשקופיות. באמצעות תאים שגדלו לכמעט מפגש, הסר את מצע הגידול המאוזן והוסף DMEM מחומם טרי. דגרו על התאים למשך שעה.

טפל בתאים בריכוזים שונים של ליגנד למשך 30 דקות. ולטפל בתאים עם 10 עד שלילי שש ליגנד טוחנת עבור הזמנים השונים המוצגים כאן. השתמש ב-PBS קר כדי לשטוף את התאים פעמיים, ולאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של 4% PFA ב-PBS לכל באר, לפני שתערבב בעדינות את התאים למשך 15 דקות.

לאחר שטיפת התאים פעמיים ב-PBS, הסר בזהירות את הכיסויים מבארות הצלחת, והרכיב אותם כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. כדי לבצע מיקרוסקופיה קונפוקלית, הפעל את החומרה של המיקרוסקופ הקונפוקלי, כולל כוח מנורת הכספית, מיקרוסקופ PC, סורק ולייזר. הפעל את התוכנה ולאחר מכן בדוק את התצורה ובחר את הלייזר.

הפעל את היחידות השונות של מערכת המיקרוסקופיה הקונפוקלית בהתאם להוראות. הנח שקופית מוכנה על המיקרוסקופ tagה, והשתמש ב-tagבקר כדי למקם את הדגימה מעל עדשת האובייקטיב. לעדשת טבילה בשמן, הוסף טיפה אחת של שמן ארז על הכיסוי, וכוון את השקופית עם כיסוי הפונה לעדשה.

תחת פלואורסצנטיות, מצא את התאים המעניינים, ולאחר מכן עבור למצב סריקה, ובחר את עוצמת הלייזר ואת הטווח הספקטרלי של פלואורופור הפליטה. צלם תמונות באיכות גבוהה על ידי כוונון עוצמת הלייזר ופרמטרים אחרים. איור זה ממחיש את הביטוי של pEGFP-N1 בתאי HEK293.

אות ה-GFP זוהה בציטופלזמה ובגרעין. הלוקליזציה התת-תאית בתאי HEK293 של קולטני הורמונים משחררי גונדוטרופינים מ-S-Japonica, או SjGnRHR, מוצגת כאן. קולטני EGFP הם בירוק, וצביעה של Dil, המדגישה את קרום התא, היא באדום.

הקולטנים נראים מתמקמים בקרום הפלזמה. כדי לדמיין את ההפנמה של SjGnRHRs, התאים טופלו בהורמון משחרר גונדוטרופין בריכוזים שונים. כפי שניתן לראות כאן, הפנמת הקולטנים התנהלה באופן תלוי מינון, והקולטן הופנם לחלוטין מפני השטח של התא עם הליגנד המולארי של 10 עד מינוס 6.

כאשר טופלו בליגנד מולארי של 10 עד מינוס שש לפרקי זמן שונים, ניתן היה לזהות SjGnRHRs מופנמים 10 דקות לאחר סימולציה אגוניסטית, והפנמה קיצונית התרחשה לאחר 60 דקות. כפי שהודגם בתאי HEK293, בשני הניסויים, חלבון ההיתוך הפלואורסצנטי SjGnRHR EGFP התמקם בעיקר בקרום הפלזמה, והופנם באופן דרמטי ומהיר לתוך התאים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על התאים בתנאים הנכונים ללא זיהום חיידקים, פטריות ומיקופלזמה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות כמו בדיקת תאים וקיבוע על מנת לענות על שאלות נוספות כמו השני במעבר V של קולטני החלבון. לאחר כל פיתוח, הטכנולוגיה סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה והביוכימיה של התא לחקור את הלוקליזציה וההפנמה של קולטנים טרנסממברניים בקווי תאים שונים.