Name: CAPRRESI: כימרה האסיפה על ידי פלסמיד השחזור והגבלת אנזים האתר הכנס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: למד את שיטת CAPRRESI להרכבת גנים כימריים ביעילות ובעלות נמוכה באמצעות הכנסת אתרי אנזימי הגבלה לרצפי DNA נרדפים. שיטה זו מייעלת מחקר בביוטכנולוגיה וביולוגיה מולקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, México (מענק מס &#39;154833) ו- Universidad Nacional Autonoma de México. המחברים מבקשים להודות לוויקטור גונזלס, לרוזה א. סנטומריה, לפטרישיה בוסטוס ולסולדדאד יוארז על עצהם המינהלית והטכנית.

<ol><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li>
<li>Vos, M. J., Kampinga, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR+amplification+strategy+for+unrestricted+generation+of+chimeric+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes.</a> Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).</li>
<li>Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Precise+GFP+Fusions+in+Plasmids+Using+Yeast+Homologous+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination.</a> Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase%3A+The+universal+reagent+for+genome+tailoring%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+improved+M13+vectors+using+oligodeoxynucleotide-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis.</a> Gene. 26 (1), 101-106 (1983).</li>
<li>Gruber, T. M., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sigma+subunits+and+the+partitioning+of+bacterial+transcription+space%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space.</a> Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUSCLE%3A+multiple+sequence+alignment+with+high+accuracy+and+high+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput.</a> Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).</li>
<li>Macrogen Inc. , Seoul, Rep. Of Korea. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://dna.macrogen.com/eng/index.jsp">http://dna.macrogen.com/eng/index.jsp</a> (2016).</li>
<li>Chevreux, B. MIRA: an automated genome and EST assembler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.chevreux.org/thesis/index.html">http://www.chevreux.org/thesis/index.html</a> 1-161 (2005).</li>
<li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sequence+alignment+using+ClustalW+and+ClustalX%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 2 (Unit 2.3) 1-22 (2002).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.molecularcloning.com/">Molecular Cloning: A laboratory manual.</a> CSHLP. , (2001).</li>
<li>Rutherford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artemis%3A+sequence+visualization+and+annotation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Artemis: sequence visualization and annotation.</a> Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

CAPRRESI תוכנן כחלופה ל- PRM 2 . PRM המקורי הוא טכניקה חזקה; זה מאפשר את היתוך של רצפי DNA לאורך כל חלק של הגנים שנבחרו. עבור PRM, גנים wildtype צריך להיות משובטים לאותו פלסמיד. לאחר מכן, oligonucleotides נועדו בתוך wildtype ואנטיביוטיקה גנים ההתנגדות נמצא על הפלסמיד. שיבוש פלסמיד מושגת על ידי PCR באמצעות פולימרס DNA, בוטה- DNA, נאמנות גבוהה מתוכננת בעבר oligonucleotides. קשירה של מוצרים משלימים PCR מרכיב גנים chimeric ומשחזר את הקלטת התנגדות אנטיביוטיקה, ו...

הרכבה גנטית Chimeric כבר בשימוש נרחב בביולוגיה מולקולרית כדי להבהיר פונקציה חלבון ו / או למטרות ביוטכנולוגיות. קיימות שיטות שונות עבור גנים התכה, כגון חפיפה PCR הגברה המוצר 1 , התאוששות פלסמיד 2 , רקומבינציה הומולוגיים 3 , CRISPR-Cas9 מערכות 4 , מכוונת רקומבינציה 5 , ו Gibson הרכבה 6 . כל אחד מהם מציע יתרונות טכניים שונים; לדוגמה, את הגמישות של עיצוב PCR חופפים, את הבחירה vivo של קונסטרוקציות במהלך התאוששות פלסמיד, או היעילות הגבוהה של מערכות CRISPR-Cas9 ו גיבסון. מצד שני, כמה קשיים יכולים להתעורר בעת ביצוע כמה שיטות אלה; לדוגמה, שתי הגישות הראשונות מסתמכות על שברי דנ&quot;א קהים, ו קשירה של סוגים אלה של מוצרים יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית לעומת sticKy- הסתיים קשירת. ריאקומבינציה מכוונת אתר יכולה להשאיר עקבות של רצפי DNA נוספים (scars) על המקור, כמו במערכת CreloxP 5 . CRISPR-Cas9 יכול לפעמים לשנות אזורי גנום אחרים בנוסף לאתר היעד 4 . כאן, אנו מציגים את ההרכבה של כימאים על ידי התאוששות פלסמידית והגבלת כניסה לאנזימים באתר (CAPRRESI), פרוטוקול להרכבת גנים המקודדים חלבונים המשלבים את שיטת ההתאוששות הפלסמידית (PRM) עם החדרת אתרי אנזים מגבילים על רצפי DNA נרדפים, . כדי להבטיח שלמות חומצות אמינו רצף, אתרי אנזים הגבלה מוכנסים על רצף דנ&quot;א נרדף מתיחה. בין היתרונות של CAPPRESI ניתן לעשות זאת באמצעות ריאגנטים רגילים של מעבדה / כלים ( למשל , אנזימים, תאים מוסמכים, פתרונות, ו thermocycler) וכי הוא יכול לתת תוצאות מהירות (כאשר האנזימים המתאימים משמשים). הסתמכות על הגבלהאתרי האנזים המגיעים מרצפי DNA נרדפים יכולים להגביל את הבחירה של נקודות ההיתוך המדויקות בתוך החלבונים המעניינים. במקרים כאלה, גנים היעד צריך להיות התמזגו באמצעות oligonucleotides חופפים, אתרי הגבלת אנזים צריך להיות מוכנס אל הגן ההתנגדות של וקטור. CAPRRESI מורכב שבעה שלבים פשוטים ( איור 1 ): 1) הבחירה של וקטור שיבוט, pUC18 או pUC19 6 ; 2) בניתוח סיליקו של sequtyences wildtype להיות התמזגו; 3) בחירה של אזורים שבירת הרכבה כימרה ו הפרעה פלסמיד; 4) בדור סיליקו של רצפי דנ&quot;א נרדפים המכילים אתרי אנזים מגבילים; 5) שיבוט עצמאי של הגנים wildtype לתוך הפלסמיד הנבחר; 6) הפרעה פלסמיד ידי PCR, ואחריו הגבלת אנזים אכול; ו 7) התאוששות פלסמיד באמצעות קשירת דנ&quot;א שינוי בקטריאלי. גנים Chimeric המיוצרים על ידי טכניקה זו צריך להיות מאומת wIth רצף. PUC18 / 19 וקטורים מציעים יתרונות טכניים עבור שיבוט ו כימרה הרכבה, כגון גודל קטן ( כלומר, 2,686 זוגות זוג), מספר עותק גבוה, תכונות תגובה רצף יתרון, וזמינות מסחרית 7 . כאן, המארח Escherichia coli שימש כדי להרכיב ולטפל chimeras כי תרבויות חיידקים זולים לגדול מהר. בהתחשב בכך, שיבוט הבאים של שברי היתוך לתוך פלסמידים היעד הסופי יהיה צורך ( למשל, וקטורים ביטוי כמו pRK415 בחיידקים או pCMV בתאי יונקים). CAPRRESI נבדק עבור מיזוג שני גנים עיקריים גורם sigma: E. colirpoD ו Rhizobium etlisigA . גורמי סיגמא ראשוניים הם יחידות RNA פולימראז האחראיות ליזום שעתוק, והם מורכבים מארבעה תחומים ( כלומר , σ1, σ2, σ3 ו- σ4) 8 . רצף חומצות האמינו lengtH של חלבונים המקודדים על ידי rpoD ו sigA הם 613 ו 685, בהתאמה. RpoD ו SigA לשתף 48% זהות (98% כיסוי). גורמי הסיגמא העיקריים הללו נחלקו לשני חלקים משלימים בין אזורים σ2 ו- σ3. שני גנים chimeric התאספו על פי עיצוב זה: כימרה 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) ו chimera 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). מוצרים היתוך דנ&quot;א אומתו על ידי רצף.

<table><tbody><tr><td>פלטינום טאק DNA פולימראז High Fidelity</td><td>Thermo Fisher</td><td>11304011</td><td>מייצר תערובת של מוצרי PCR קהים/3'-A תלויים</td></tr><tr><td>ערכת בידוד פלסמיד טהורה גבוהה</td><td>Roche</td><td>11754785001</td><td>משמש לכל תגובות טיהור הפלסמיד</td></tr><tr><td>ערכת טיהור מוצר PCR טהור גבוה</td><td>Roche</td><td>11732676001</td><td>משמש לכל תגובות טיהור PCR מג'ל</td></tr> <tr><td>אגרוזאנזים הגבלת AflII</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0520L</td><td>מזהה את רצף 5'-CTTAAG-3' וחותך ב-37 מעלות; </td></tr><tr><td>אנזים הגבלה C KpnI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3142L</td><td>מזהה את רצף 5'-GGTACC-3' וחותך ב-37 מעלות; </td></tr><tr><td>אנזים הגבלת C SpeI-HF</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R3133L</td><td>מזהה את רצף 5'-ACTAGT-3' וחותך ב-37 מעלות; </td></tr><tr><td>אנזים הגבלה C XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145L</td><td>מזהה את רצף 5'-TCTAGA-3' וחותך ב-37 מעלות; C</td></tr><tr><td>Ampicillin נתרן מלח</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>חומצה Nalidixic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878-5G</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625-1KG</td><td>תרבית תאי חיידקים</td></tr><tr><td>קזאין פפטון</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>70171-500G</td><td>תרבית תאי חיידקים</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td>נתרן כלורי</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05040-1KG</td><td>תרבית תאי חיידקים</td></tr><tr><td>XbaI אנזים הגבלה</td><td>תרמו פישר</td><td>FD0684</td><td>עיכול מהיר XbaI אנזים</td></tr><tr><td>KpnI אנזים הגבלה</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0524</td><td>עיכול מהיר KpnI enzyme</td></tr><tr><td>ערכת קשירה מהירה</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M2200S</td><td>ערכת קשירת DNA מהירה</td></tr><tr><td>AflII אנזים הגבלה</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0834</td><td>עיכול מהיר AflII enzyme</td></tr><tr><td>SpeI אנזים הגבלה</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD1253</td><td>עיכול מהיר SpeI enzyme</td></tr></tbody></table>

caprresi: כימרה האסיפה על ידי פלסמיד השחזור והגבלת אנזים האתר הכנס

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

כאן, אנו מציגים כימרה הרכבה על ידי התאוששות פלסמיד והגבלה אנזים האתר הכניסה (CAPRRESI). יתרונות CAPRRESI מכוחות רבים של שיטת ההתאוששות הפלסמידית המקורית ומציג עיכול אנזים הגבלה כדי להקל על תגובות קשירת DNA (נדרש הרכבה כימרה). עבור פרוטוקול זה, משתמשים שיבוט wildtype גנים לתוך פלסמיד זהה (pUC18 או pUC19). לאחר הבחירה סיליקו של רצף חומצות אמינו אזורים שבהם chimeras צריך להיות התאספו, משתמשים לקבל את כל רצפי DNA נרדף לקודד אותם. אד סקריפטים Perl לאפשר למשתמשים לקבוע את כל רצפי DNA נרדף. לאחר שלב זה, עוד סקריפט Perl מחפש אתרי אנזים הגבלה על כל רצפי DNA נרדף. זה ניתוח סיליקו מבוצע גם באמצעות הגן עמיד ampicillin ( ampR ) נמצא על pUC18 / 19 פלסמידים. משתמשים בעיצוב oligonucleotides בתוך אזורים נרדפים לשבש wildtype ו ampR גנים על ידי PCR. לאחר קבלתAining ו טיהור שברי דנ&quot;א משלימים, עיכול אנזים הגבלה הושלמה. כימרה הרכבה מושגת על ידי ligating מתאים משברים דנ&quot;א משלימים. PUC18 / 19 וקטורים נבחרים עבור CAPRRESI כי הם מציעים יתרונות טכניים, כגון גודל קטן (2,686 זוגות זוג), מספר עותק גבוה, תכונות תגובה רצף יתרון, וזמינות מסחרית. השימוש אנזימים הגבלת הרכבה כימרה מבטלת את הצורך פולימרים DNA המניבים מוצרים קהה- End. CAPRRESI היא שיטה מהירה וזולה עבור מיזוג גנים המקודדים חלבונים.

איור 1 מתאר את CAPRRESI. באמצעות שיטה זו, שני גנים chimeric התאספו על ידי החלפת תחומים של שני גורמי סיגמא עיקרי חיידקי ( כלומר, E. coli RpoD ו R. etli SigA). רצפי ה- DNA של גנים rpoD ו sigA התקבלו באמצעות דפדפן Genome Genem 14 מ GenBank קבצים הגנום NC_000913 ו NC_007761, בהתאמה. רצף ה- DNA של וקטור pUC18 התקבל ממסד הנתונים nucleotide של שרת NCBI. בניתוח סיליקו של ...

כאן, אנו מציגים כימרה הרכבה על ידי התאוששות פלסמיד והגבלת אנזים האתר הכניסה (CAPRRESI), פרוטוקול המבוסס על החדרת אתרי אנזים הגבלה לתוך רצפי DNA נרדף התאוששות פלסמיד פונקציונלי. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה בעלות נמוכה עבור מיזוג גנים מקודדים חלבונים.

CAPRRESI: כימרה האסיפה על ידי פלסמיד השחזור והגבלת אנזים האתר הכנס

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

סרטון זה מדגים הליך הנקרא הרכבת כימרה על ידיהשגת פלסמיד והחדרת אתר אנזים הגבלה, או CAPRRESI, שבו נוצרים שני גנים כימריים על ידי החדרה של אתרי אנזים הגבלה ספציפיים לתוך DNA סינונימי, ולאחר מכן חיתוך והחלפה של רצפי ה-DNA. בשיטת CAPRRESI, הגנים מסוג הפרא הרלוונטיים מוחדרים תחילה לאתרי השבט המרובים של אותו וקטור. לאחר מכן, נבחרים אזורי שבירה עבור כל גן עם אותה רצף חומצות אמינו, ונבחר אזור השבירה עבור הגן לעמידות לאמפיסילין.סקריפטים של Perl משמשים לקביעת רצפי מילים נרדפות (synonym sequences) המכילים אתרי הגבלה עבור כל אזור שבירה. באמצעות אוליגו-נוקלאוטידים שתוכננו במיוחד, מבוצע PCR להפקת ארבעה חלקים משלימים המכילים DNA סינונימי עם אתרי אנזימי ההגבלה הרצויים. תוצרי ה-PCR המתקבלים מטוהרים, עוברים עיכול ולאחר מכן נחברים (ligated) להפקת רצף כימרי.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מקלה על ביצוע היתוכי גנים (gene fusions). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה המולקולרית, כגון, מהם התפקודים של הפרוטאין-אנזים שלנו. התחילו את הפרוצדורה כאשר הגנים הרלוונטיים כבר מוחדרים לאתרי השכפול המרובים (multiple cloning sites) של הווקטורים.כאן, הגנים rpoD ו-sigA, המקודדים לגורמי אות בקטריאליים הדרושים להפעלת סינתזת RNA, שוכפלו כל אחד לתוך pUC18 כפי שפורט בטקסט הנלווה. כדי לתכנן את האוליגונוקלאיד לייצור החלבון הכימרי, ראשית, הפעילו את סקריפט ה-perl בשם translate. pl כדי לקבל את רצף החומצות האמינו של הגנים rpoD, sigA ו-ampR.לאחר מכן, באמצעות שרת הרשת muscle, יישרו את רצפי חומצות האמינו של rpoD ו-sigA. עבור כל רצף, בחרו אזור שבירה בעל רצף זהה של שלושה עד שישה חומצות אמינו. שמרו את הרצפים בקובץ regions.fas.כעת, בחרו רצף של שלושה עד שישה חומצות אמינו בתוך הגן ampR, ושמרו רצף זה בקובץ regions.fas. כדי לקבוע את כל רצפי ה-DNA הסינונימיים, הפעילו את סקריפט ה-perl בשם synonym.pl. לאחר מכן, כדי למצוא אילו אנזימי הגבלה חותכים את הרצפים הסינונימיים, הפעילו את הסקריפט resynonym.pl.בשלב הבא, השתמשו ברצפי ה-DNA הסינונימיים כדי לתכנן אוליגונוקליאוטידים המטמיעים את אותו אתר להסמיג של אנזים הגבלה בתוך אזורי השבירה של rpoD ו-sigA. תכננו אוליגונוקליאוטיד לשיבוש של הגן ampR המטמיע אתר להסמיג שונה של אנזים הגבלה. האוליגונוקליאוטידים הקדמי וההפוך יחפיפו זה את זה במיקום אתר אנזים ההגבלה.אוליגונוקלאוטידים צריכים להיות באורך של 21 עד 27 נוקלאוטידים, להסתיים בציטוזין או גואנין ולהכיל אתר לחיתוך על ידי אנזים רסטריקציה. לאוליגונוקלאוטיד קדמי (forward) יש את אותה רצף כמו לאזור המטרה ב-DNA התבנית. אוליגונוקלאוטיד הפוך (reverse) הוא הרצף המשלים ההפוך של אזור המטרה ב-DNA התבנית.הזמינו את האוליגוניוקלאוטידים מספק סינתזת DNA. עם הגעת האוליגוניוקלאוטידים, השתמשו בהם לביצוע PCR תוך שימוש בבנייני pUC18 של rpoD ו-sigA כ-DNA תבנית. פעולה זו תייצר שני חלקים משלימים עבור כל בנייה.בעקבות ה-PCR, בצעו אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז כדי להפריד את תוצרי ה-PCR מה-DNA התבניתי. טיהור של חלקי פלסמיד משלימים הוא קריטי כדי למנוע זיהום של פלסמידים הוריים. ניתן להסיר את הפלסמידים ההוריים באמצעות טיהור ג'ל, כפי שאנו מדגימים כאן, או באמצעות עיכול באנזים ההגבלה dpn1, שיכול לשמש לפירוק הפלסמידים ההוריים.לאחר האלקטרופורזה, צבע את הג'ל בתמיסת אתידיום ברומיד. ויזואליזציה של הפסים תתבצע על ידי הנחת הג'ל הצבוע בתא UV באורך גל של 300 nanometer. הגבל את משך חשיפת הג'ל למינימום.לאחר מכן, גזרו את הפסים המכילים את תוצרי ה-PCR והעבירו אותם למבחנות מיקרו-צנטריפוגה. השתמשו בערכה לטיהור דגימות ה-DNA, ולאחר מכן, באמצעות אנזימי הגבלה מתאימים לעיכול מהיר (fast digest), בצעו עיכול כפול על כל מקטעי ה-DNA המשלימים. AFL2 ו-SPE1 משמשים לצורך חיבור של חלקים משלימים בפלסמיד.דגרו את תגובת העיכול ב-37 degree celsius למשך 15 דקות. לאחר מכן, נטרלו את אנזימי ההגבלה בהתאם להנחיות היצרן. לדוגמה, נטרלו את AFL2, SPE1 ב-80 degree celsius למשך 20 דקות.בשלב הבא, שלבו את מקטעי ה-DNA המתאימים עם תמיסת ליוגציה (ligation buffer), מים ו-T4 DNA ligase. השאירו את תגובת הליוגציה בטמפרטורה של 25 °C למשך 10 דקות. באופן זה, תוחזר השלמות של הגן ampR, ובכך ייווצר חלבון תפקודי.לאחר הליגציה, בצע טרנספורמציה ל-E.Coli DH5 alpha באמצעות 3 עד 5 µL מתגובת הליגציה של הרכבת הכימרה. זרע את התאים שעברו טרנספורמציה על צלחות LB ampicillin x-gal IPTG והדגר אותם למשך לילה ב-37 °C. למחרת, בחר מושבות לבנות של E.Coli שעברו טרנספורמציה והעבר אותן בשיטת מריחה לצלחת LB ampicillin חדשה.דגרו את הצלחות הטיפוח למשך לילה ב-37 degree celsius. כדי לבחור מועמדים לריצוף, בצעו colony PCR. ויזואליזציה של הפסים תבוצע על ג'ל agarose 2% (ביחס של אחד לאחד) באמצעות אלקטרופורזה כפי שבוצע בעבר.בחרו מושבות מועמדות המציגות פס DNA בגודל הנכון לצורך הזרקה לתרביות. למחרת, הפיקו מהן את ה-plasmid DNA באמצעות קיט. לאחר טיהור הפלסמיד, שלחו את הדגימות לריצוף.מבנים כימריים של rpoD sigA נוצרו כפי שפורט בסרטון זה. לאחר הריצוף, בוצע יישור (alignment) של הגנים מסוג הבר (wild type) והגנים הכימריים באמצעות תוכנת muscle. רצפי הגנים הכימריים הורכבו לאחר מכן באמצעות תוכנת mura כפי שמוצג כאן.רצפי סינונימים מופיעים בשחור ואתר AFL2 מופיע עם קו תחתון. נתוני רצף אלו מדגימים שימוש מוצלח בשיטת CAPRRESI ליצירת מבנים כימריים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם אפשרות טובה לחיבור מקטעי גנים.

caprresi-chimera-assembly-plasmid-recovery-restriction-enzyme-site

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה מהירה ויעילה לשלב דנ"א זר של עניין תוך מוכנות זנים נוטלים, המכונות משטח נחיתה זנים, מתואר. השיטה מאפשרת לאתר ספציפי לשילוב של הקלטת ה-DNA לתוך לוקוס משטח מהונדסים הנחיתה של זן מסוים, דרך הצמידה וביטוי integrase ΦC31.

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

ניתוח הכרומטין אינטראקציה ידי מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) היא...

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

ניתן להשתמש במתודולוגיות מיקוד גנים כדי ליצור עכברים טרנסגניים עם אללים נוק-אאוט, נוק-אין ומתויגים.  כאן, אנו מתארים שיטה משופרת של קומבינר מחדש ב-E. coli, שאנו מכנים 'תת-שיבוט פלוס הכנסה', שניתן להשתמש בה כדי ליצור וקטורים מכוונים לגנים מותאמים אישית במהירות.

Subcloning Plus ההכנסה (SPI) - Recombineering שיטה חדשה לבנייה המהירה של וקטורי גן המיקוד

סינתזה של פלסמידים מותאמים אישית גוזלת עבודה וזמן. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשיבוט הרכבה של גיבסון כדי להפחית את העבודה ומשך הליך שיבוט ה-DNA המותאם אישית. הפרוטוקול המתואר מייצר גם מבני חלבון מתויגים אמינים לביטוי יונקים בעלות דומה לשיבוט ה-DNA המסורתי של גזירה והדבקה.

דור של פלסמיד וקטורים לבטא חלבונים מתויג FLAG על פי תקנות ההסדרה של יזם אדם התארכות Factor-1α שימוש גיבסון עצרת

הכנסת שינויים גנומיים מרובים לציאנובקטריה היא כלי חיוני בפיתוח זנים למטרות מחקר תעשייתי ובסיסי. אנו מתארים מערכת ליצירת מוטציות לא מסומנות במיני המודל הציאנובקטריאליים Synechocystis sp. PCC6803 ומוטציות מסומנות ב-Synechococcus sp. PCC7002.

הדור של מסומנים מוטאנטים Markerless במודל כחוליות המינים

חלבונים הקשורים מבחינה מבנית להפעיל לעתים קרובות תפקודים ביולוגיים ברורים. ההחלפה של אזורים המקבילה של חלבונים אלה כדי ליצור חלבונים chimeric מהווה גישה חדשנית כדי לזהות אזורים קריטיים חלבון אשר אחראים על הבדלי הפונקציונלית שלהם.

זיהוי של חלבון פונקציונלי אזורים באמצעות חלבון Chimeric בנייה

מתוארים כאן היא שיטה ממוקדת, מרפבלי גנים מחיקה בקלמידיה trachomatis באמצעות קלטת מallelic exchange מוטזיס מוטציות, flaem.

מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מדריך מפורט, צעד אחר צעד להרכבת מבנים מרובי גנים באמצעות מערכת שיבוט מודולרית המבוססת על שיבוט שער הזהב. הוא גם נותן המלצות על צעדים קריטיים כדי להבטיח הרכבה אופטימלית המבוססת על החוויות שלנו.

הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי

מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר שולבו בתוכנית של שערים בוליאניים בשמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae). המעגלים הלוגיים הקטנים החדשים הראו ביצועים טובים והעמיקו את ההבנה של גורמי שעתוק מבוססי dCas9/dCas12a והתכונות של חלבונים אנטי-קריספר.

מעגלים דיגיטליים גנטיים המבוססים על מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר

ALIBi (ALIBi) היא שיטה חדשה שמופעלת אופטוגנטית שפותחה לתיוג וטיהור אוכלוסיות תת-תאיות של ריבוזומים לצורך ריצוף וניתוח פרוטאומי במורד הזרם וניתוח פרוטאומי.

בידוד תת-אוכלוסיות ריבוזום תת-תאיות בהתבסס על ביוטינילציה מוגברת במיקום ספציפי לתג פפטיד רקומביננטי - תאורה מוגבלת -

הרכבה in vivo היא שיטת שיבוט בלתי תלויה בקשירה המסתמכת על אנזימי תיקון DNA פנימיים בחיידקים כדי להרכיב שברי DNA על ידי רקומבינציה הומולוגית. פרוטוקול זה הוא גם חסכוני בזמן וגם בעלות יתר, מכיוון שנדרשים מעט ריאגנטים, ויעילות השיבוט יכולה להגיע עד 99%.

שימוש במכלול In Vivo לבניית פלסמיד ביעילות גבוהה

למד את שיטת CAPRRESI להרכבת גנים כימריים ביעילות ובעלות נמוכה באמצעות הכנסת אתרי אנזימי הגבלה לרצפי DNA נרדפים. שיטה זו מייעלת מחקר בביוטכנולוגיה וביולוגיה מולקולרית.

CAPRRESI: כימרה האסיפה על ידי פלסמיד השחזור והגבלת אנזים האתר הכנס

גלה סרטונים נוספים