מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להשוות בין שתי שיטות המשמשות לבידוד DNA אורגנלרי באיכות גבוהה, הן DNA פלסטיד והן דנ"א מיטוכונדריה מרקמת עלה צמח המתאימה לריצוף הדור הבא. שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של הצמח כגון היקף המגוון האורגני על פני טקסונים וכיצד שינויים ברצף או במבנה הגנום האורגני משפיעים על ההתפתחות ותגובת הלחץ. נשווה שתי טכניקות, שיטת הצנטריפוגה הדיפרנציאלית המעשירה עבור סוג אבן-אורגני ספציפי אחד וטכניקת המטא-פרקציה המשחזרת את סך ה-DNA האברגנלרי מדגימות רקמה קפואות קטנות יותר.

הנוהל המקובל לגידול שתילי חיטה, הוא לשתול זרעים בוורמיקוליט, בעציצים מרובעים עם ארבעה עד שישה זרעים בכל פינה. העבירו את הסירים לחממה עם מחזור אור של 16 שעות. השקה את הצמחים כל יום.

דשן את הצמחים ברבע כפית דשן גרגירי 20-20-20 MPK עם הנביטה, ושוב שבעה ימים לאחר הנביטה. להערצה של שתילי חיטה, זרעי שתילה וטיפול בצמחים כמו בהליך הסטנדרטי. אבל הניחו את העציצים בתא גידול חשוך.

אלטרנטיבה לגידול שתילים אלה בתא גידול חשוך היא לכסות את הצמחים בחממה אך באוורור מתאים. השלב הראשון בהליך זה הוא בידוד האברונים. קצרו חמישה גרם של טישו טרי ושטפו אותו במים קרים וסטריליים בכוס צוננת על קרח.

בעזרת מספריים, חותכים את רקמת העלה לחתיכות של כסנטימטר אחד ישירות לתוך צינור מקורר מראש של 50 מילימטר המכיל שני גלילי שחיקה קרמיים. שמור את הדגימות על קרח לאורך כל ההליך. כדי למנוע זיהום צולב, חשוב להחליף את המספריים בין הדגימות.

קח את הדגימות למכסה האדים והוסף 20 מיליליטר של מאגר STE לכל צינור של 50 מיליליטר. הנח את הדגימות לתוך גושי שחיקה קריוגניים מקוררים מראש במנגנון טחינת רקמות וטחן את הדגימות למשך 30 שניות ב-1,750 סיבובים לדקה. מניחים את הדגימות על קרח למשך כדקה.

סובב את עמדות הדגימה וטחן עוד 30 שניות ב-1,750 סיבובים לדקה. החזר את הדגימות לדלי הקרח. עבור כל דגימה, הכנס משפך לצינור נקי של 50 מיליליטר המונח בקרח והנח שכבה אחת של בד סינון לתוך המשפך.

הרטיבו מראש את מטלית הסינון עם חמישה מיליליטר של מאגר STE וחסכו את הזרימה. שופכים את הרקמה ההומוגנית למשפך. שטפו את צינור הטחינה עם 15 מיליליטר מאגר STE, מכסים והופכים את הצינור כדי לשטוף קירות ומכסה ולשפוך את תכולתו למשפך.

הסר בזהירות את אבני הקרמיקה ולאחר מכן סחט וסחט את בד הסינון לתוך המשפך. כדי למנוע זיהום צולב, החלף כפפות בין הדגימות. עטפו את מכסי הצינור בניילון פרפין כדי למנוע שפיכה.

צנטריפוגה ב -2, 000 x G, בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, השתמש בפיפטה סרולוגית כדי לשאוב בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה ולהניח אותה בצינור צנטריפוגה מהיר של 50 מיליליטר עם אטם איטום הדוק. הניחו קרח קטנה על מאזניים, קרעו את המשקל ושקלו כל סופרנטנט.

השתמש במאגר STE כדי לאזן את הצינורות לטווח של 0.1 גרם ולאחר מכן צנטריפוגה ב-18,000 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר השלמת הצנטריפוגה, החזירו דגימות למכסה האדים והשליכו את הסופרנטנט. הוסף מיליליטר אחד של מאגר ST לגלולה והשהה מחדש בעדינות באמצעות מברשת צבע רכה.

הוסף 24 מיליליטר של מאגר ST כדי לקבל נפח סופי של 25 מיליליטר. סובב בעדינות את המברשת בתרחיף כדי לערבב, ולאחר מכן לחץ על המברשת בצד הצינור כדי להסיר את כל הנוזלים לפני הסרת המברשת. לאחר איזון הצינורות, צנטריפוגה ב-18,000 x G בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

במהלך צנטריפוגה זו, הכינו את תמיסת ה-DNA 1 כמתואר בפרוטוקול הטקסט וציינו 200 מיקרוליטר לצינור של 1.5 מיליליטר לדגימה. לאחר השלמת הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט וכתמו את הצינור. לכל צינור צנטריפוגה במהירות גבוהה, הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר STE והשהה מחדש את הגלולה באמצעות מברשת צבע רכה.

הנח את מברשת הצבע בצינור 1.5 מיליליטר שהוכן קודם לכן המכיל 200 מיקרוליטר של תמיסת DNA 1 וסובב את מברשת הצבע כדי להסיר כל כדור שאריות שנתקע במברשת. הכניסו את תמיסת ה-DNA 1 לתוך צינור הצנטריפוגה המהיר וערבבו בעדינות לערבוב. עטפו את סרט הפרפין סביב החלק העליון של כל צינור ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 30 דקות.

במהלך הדגירה מערבבים בעדינות על ידי מערבולת. בעזרת קצה פיפטה עם פתח רחב, הוציאו בעדינות את תערובת הגלולה מהצינור והניחו אותה בצינור קשירה נמוך של 1.5 מיליליטר. הוסף 500 מיקרוליטר של 400 מילי-מולרי EDTA, pH 8.0 לצינור הצנטריפוגה המהיר.

פיפטה בעדינות כדי להסיר לחלוטין את הגלולה הנותרת ולהעביר את ה-EDTA לצינור הקישור הנמוך המכיל את תערובת הגלולה. מערבבים בעדינות על ידי היפוך. צנטריפוגה ב 18, 000 x G, בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר מכן, השליכו את ה-supernatant, סמנו כל צינור והשתמשו בגלולה מיד לבידוד ה-DNA. בשיטה זו, DNA אורגנלרי מועשר מ-DNA גנומי כולל שחולץ באמצעות עמודות מיצוי DNA מסחריות. הכן את הכמות הנדרשת של חרוזים מגנטיים הקשורים לחלבון MBD2 FC, לפי הוראות היצרן וקנה מידה של התגובות לשימוש בין מיקרוגרם אחד לשני מיקרוגרם של DNA קלט כולל.

בהדגמה זו נדרשים 160 מיקרוליטר חרוזים עבור מיקרוגרם אחד של DNA קלט כולל. כדי ללכוד DNA גרעיני שעבר מתיליזציה, הוסף מיקרוגרם אחד של DNA קלט לצינור המכיל 160 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים קשורים MBD2 לכל דגימה בודדת ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה עם קצה קדח רחב. הוסף את הנפח המתאים של מאגר כביסה 5x לריכוז סופי של 1x ופיפטה את הדגימה למעלה ולמטה עם קצה קדח רחב, כמה פעמים לערבוב.

סובב את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. להצלחת המשיכה, חשוב לערבב היטב את החרוזים במהלך הדגירה, במיוחד אם יש גוש חרוזים משמעותי. כדי למנוע גוש חרוזים וכדי להבטיח משיכה כלפי מטה של ה-DNA המתילי, פיפטה בעדינות את הדגימות עם קצה פיפטה רחב והעבירו את הדגימות פעמיים עד שלוש במהלך הדגירה.

סובב בקצרה את הצינורות המכילים את תערובת ה-DNA והחרוזים המגנטיים. הנח את הצינורות על מתלה מגנטי למשך חמש דקות לפחות כדי לאסוף את החרוזים לצד הצינורות. התמיסה צריכה להיראות ברורה, היא מכילה DNA מועשר באורגניזציה ללא מתיל.

בעזרת קצות קדח רחבים, הסר בזהירות את הסופרנטנט הנקי מבלי להפריע לחרוזים והעביר את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי ונמוך של שני מיליליטר. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של 20 או 80 מעלות צלזיוס. בדיקת PCR חריפה שימשה כדי להעריך את השפע היחסי של שלושה השלכות ספציפיות לאברונים ב-DNA הגנומי הכולל ובמקטע ה-DNA האברגנלי שהתקבל משתי השיטות.

בסך הכל, הנתונים מצביעים על כך ששיטת הצנטריפוגה הדיפרנציאלית, מעשירה באופן מועדף את המיטוכונדריה. החלק הלא מתילי של ה-DNA הגנומי הכולל של המתיל-פרק, מראה העשרה משמעותית של שני הרמיזות האורגנלריות. אחוזי הקריאות הממופים לגנום הייחוס של האביב הסיני של המיטוכונדריה או הכלורופלסט והחיטה המתורבתת של כריס עולים בקנה אחד עם תוצאות ה-QPCR.

צנטריפוגה דיפרנציאלית מניבה DNA מועשר יותר ב-DNA מיטוכונדריה ומתיל-פרקציה מניבה DNA המשקף ככל הנראה את השפע הטבעי של שני הגנומים האברגנלרים. תוויות לדוגמה כולל E, מציינות דגימות אידיליות ו-NE מציינות דגימות לא אידיליות. מעניין שהאידיליה לא שינתה את שפע האורגנלרים.

בשתי השיטות, הכיסוי התיאורטי של הגנום המוזכר במיטוכונדריה או בכלורופלסט, עולה על כיסוי של פי 100, גם כאשר 12 ספריות מוכפלות. ה-DNA הגנומי הכולל נודד כמריחה מפוזרת באלקטרופורזה של ג'ל לאחר השדה ועולה על 50 קילו-בסיסים. השבר הגרעיני לאחר מתיל-פרקציה פוחת בגודלו, אך נשאר מרוכז סביב 50 קילו-בסיסים, מה שמרמז על כך ש-DNA מתיל-פרקטיואנט מתאים ביותר לריצוף קריאה ארוכה.

לאחר השליטה, ניתן לבצע את שתי טכניקות מיצוי ה-DNA האורגניות תוך יום עד יומיים, מאיסוף הדגימות ועד להערכת המוצר הסופי, אם הן מבוצעות כראוי. לטכניקת המתיל-פרקציה יש פוטנציאל להרחיב מאוד את טווח מחקרי ה-DNA האברגנלרי לדגימות נדירות וקשות, מכיוון שתשומות הרקמות נמוכות ביותר. עם זאת, צנטריפוגה דיפרנציאלית עדיין עשויה להיות עדיפה כאשר נדרש אך ורק DNA מיטוכונדריה למחקרים במורד הזרם.

כמו כן, צעדי צנטריפוגה עשויים להיות מותאמים כדי לחלץ DNA פלסטיד מועדף אם תרצה. שתי שיטות מיצוי ה-DNA האורגנלריות, מניבות DNA המתאים לריצוף הדור הבא, אך מתילפרקציה מניבה DNA בקצב מולקולרי גבוה שהוא אידיאלי לריצוף קריאה ארוכה.