רקומבינרינג ומיקוד גנים
אחד הכלים הנפוצים ביותר בביולוגיה המודרנית הוא שיבוט מולקולרי עם אנזימי הגבלה, היוצרים קצוות תואמים בין שברי DNA המאפשרים לחבר אותם יחד. עם זאת, טכניק…
שיבוט על ידי רקומבינציה הומולוגית, או רקומבינרינג מחדש, שיפר מאוד את יכולתם של החוקרים לבצע הנדסה גנטית בעלת תפוקה גבוהה. שיבוט מולקולרי קלאסי דורש עיכול של וקטורים ותוספות עם אותם אנזימי הגבלה כדי ליצור קצוות תואמים ל"רקומבינציה ", אך במיוחד כאשר מנסים לבודד אזור מרצף ארוך יותר, כגון מתיחה של DNA גנומי, לא תמיד יש אנזימי הגבלה שיחתוך באופן ייחודי סביב אזור העניין, ולא בתוך האזור או במקום אחר ברצף. על ידי הימנעות מהצורך באתרי הגבלה אלה, recombineering מספק דרך הרבה יותר יעילה וחסכונית לעשות מבנים הנדסה גנטית.
בסרטון זה, נציג את עקרונות רקומבינציה גנטית, נספק פרוטוקול כללי לשילוב מחדש של וקטור פילוח גנים, ונדון במספר יישומים של טכנולוגיות אלה.
ראשית, בואו נדון מהי רקומבינציה וכיצד ניתן ליישם אותה.
רקומבינציה גנטית כרוכה בחילופי מידע בין מולקולות דנ"א. ב"רקומבינציה הומולוגית", מוחלפים קטעים גדולים יחסית של רצפי דנ"א דומים או זהים. תאים משתמשים בתהליך זה כדי לתקן הפסקות גדיל כפולות, ואיחודים המתרבים מינית מבצעים זאת גם בין כרומוזומים הומולוגיים במהלך מיוזה כדי להגביר את המגוון הגנטי.
רקומבינציה הומולוגית נרתמה למספר מטרות ניסיוניות, כולל שינוי של loci אנדוגני ספציפי בתאים - המכונה "פילוח גנים". הוא חל גם על הנדסת מבנים גנטיים, תהליך הנקרא "recombineering", אשר שימושי במיוחד לביצוע שינויים בקטעים גדולים של DNA למיקוד לגנום של אורגניזם. כדי לעשות זאת, חוקרים יכולים לעשות שימוש ב"ספריות גנומיות", או קבוצות של וקטורים שכל אחד מהם מכיל שברי דנ"א גנומיים ארוכים. סוגים שונים של ספריות עם יכולות שונות, בדרך כלל מופצים שיבוטים חיידקיים, נוצרו וניתן להזמין ממאגרים מסחריים או מלכ"רים. אחד הסוגים הנפוצים ביותר של ספריה גנומית נקרא כרומוזום מלאכותי חיידקי או BAC, אשר יכול לשאת גודל הכנס בין 150-350 קילובסות.
על מנת להקים מחדש מבנה, מדענים זקוקים לאורגניזם שבו מתרחשת רקומבינציה הומולוגית. שמרים Saccharomyces cerevisiae הוא באופן טבעי "רקומבינציה-מוכשר" והוא יכול בקלות לבצע רקומבינציה הומולוגית בין וקטור ולהוספה. מערכת נוספת המיושמת בדרך כלל משתמשת בחלבונים "אדומים" מבקטריופאג ' למדה, אשר מחדש בחיידק E. coli. וקטורים יכולים להיות recombineered או בזני חיידקים מבוססים בעבר ביטוי אדום, או מרכיבי מערכת אדומה קידוד plasmid יכול להיות שיתוף פעולה עם מצעים recombineering לתוך החיידקים.
עכשיו, בואו נעבור על פרוטוקול כדי ליצור וקטור פילוח גנים על ידי קומבננרציה מחדש.
מטרת הפרוטוקול הזה היא ליצור עכבר מהונדס גנטית עם שינויים ממוקדים בגן מסוים. בקצרה, השינויים הרצויים בגן העניין נעשים ב- BAC; הרצף שהשתנה "מאוחזר" לווקטור מיקוד, והווקטור הזה מועבר לתאי גזע עובריים לצורך פילוח גנים. לאחר מכן ניתן להשתמש בתאי הגזע כדי ליצור את החיה מהונדסת גנטית. לקבלת הוראות על הליך סופי זה, אנא עיין בסרטון החינוך המדעי JoVE "הנדסה גנטית של אורגניזמים מודל".
בתור התחלה, שיבוט BAC המכיל את רצף העניין הגנומי מזוהה ומוזמן. לאחר מכן, זרועות ההומולוגיה, או אוליגונוקלאוטידים המכילים את 30-50 האזורים ההומולוגיים basepair, מתוכננים. אלה oligonucleotides משמשים פריימרים בתגובות PCR כדי ליצור את ה- DNA "קלטות" המשמש לשינוי גן העניין. קלטות אלה מכילות בדרך כלל, למשל, גנים עמידים לאנטיביוטיקה שיכולים לשמש כסמני בחירה, אשר ניתן להגביר בקלות מן plasmids זמין לציבור רבים. שיבוט חיידקי BAC משתנה לאחר מכן, למשל על ידי אלקטרופורציה, עם פלסמיד קידוד רכיבי המערכת האדומה, ואחריו קלטות המכילות זרוע ההומולוגית. החיידקים הם אז דגירה בטמפרטורה המתאימה כדי לגרום רקומבינציה.
כדי לשחזר את הרצף שהשתנה מה- BAC, וקטור "אחזור" הוא ליניארי ומוגבר באמצעות פריימרים המכילים זרועות הומולוגיה המכסות מספר קילובסות סביב אתר השינוי. עמוד השדרה הווקטורי הזה הופך לשיבוט חיידקי BAC, ושילוב מחדש מושרה שוב. הווקטור יהיה "תיקון פער" על ידי "אחזור" הרצף המתאים מן BAC. התוצאה היא וקטור פילוח גנים המכיל את רצף העניין שהשתנה, כמו גם אזורים הומולוגיים לדנ"א גנומי סביב הרצף שהשתנה. לאחר מכן ניתן לטהר וקטור זה, ליניארי ולהכניסו לתאי גזע עובריים שבהם מכונות רקומבינציה הומולוגית אנדוגנית יכוונו לרצף שהשתנה אל הלוקוס המתאים, ובכך ישנו את הגנום המארח.
בואו עכשיו נסתכל על כמה יישומים של טכניקות הנדסיות מבוססות רקומבינציה.
ראשית, חוקרים יכולים להשתמש רקומבינרינג כדי להנדס במהירות ובקלות את הגנום החיידקי, למשל, כדי לחקור קומפלקסים של חלבון. כאן, קלטת קידוד תג זיקה פפטיד רציף, כמו גם סמן בחירת התנגדות kanamycin תוכנן להיות recombineered לתוך 3 ¢ קצה של גן העניין. וקטור זה הוכנס לאחר מכן אדום "רקומבינציה-מוכשר" E. coli, ו recombinants מוצלחים היו מבודדים באמצעות מדיה סלקטיבית. מתחמי החלבון המתויגים טוהרו ביוכימית באמצעות חלבונים שנקשרים בחוזקה לתגיות, ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה כדי לזהות את שותפי האינטראקציה של חלבון העניין.
Recombineering ומיקוד גנים יכול לשמש גם כדי לשנות את הגנום של אורגניזמים טפיליים, כגון טפיל תאי חובה טוקסופלזמה gondii, אשר גורם למחלה טוקסופלזמוזיס. במחקר זה, וקטור פילוח היה recombineered בשמרים, שבו רצפים גנומיים מאגפים את גן העניין הוצבו סביב סמן בחירה. הווקטור היה אז ליניארי ואלקטרופור הפך לטפילים. הגבלת ציפוי דילול במדיה סלקטיבית שימשה לבידוד רקומביננטים מוצלחים, שבהם מכונות רקומבינציה הומולוגיות של הטפיל החליפו את הרצף הגנומי ברצף המהונדס, ובכך מחקו את גן העניין. PCR של האזור הממוקד אישר אירועי רקומבינציה חיוביים.
לבסוף, הליך המכונה subcloning plus insertion, או SPI, הומצא שבו תיקון פערים והכנסת קלטת מתרחשים בו זמנית, מה שהופך את תהליך recombineering פשוט וגמיש יותר. קריטי להצלחת תהליך זה הוא העיצוב הנכון של זרועות ההומולוגיה מרובות, אשר, עד 180 bp, הם ארוכים יותר מאשר recombineering קונבנציונאלי כדי להגביר את יעילות recombination. לאחר שילוב זרועות ההומולוגיה בקלטות הפלסמיד וההחדרה של התת-קלאבים על ידי PCR, הם הפכו יחד לשיבוט BAC אדום- ביטוי, ושילוב מחדש הושרה. מבנים שחולבו מחדש בהצלחה זוהו אז על ידי PCR או ניתוח תקציר הגבלה.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על שילוב מחדש. בסרטון זה דנו בעקרונות של רקומבינציה וכיצד ניתן להשתמש בהם בהנדסה גנטית, פרוטוקול לפרויקט רקומבינרינג, ולבסוף מספר יישומים של טכניקות אלה. כמו תמיד, תודה שצפית!
שיבוט על ידי רקומבינציה הומולוגית, או רקומבינרינג מחדש, שיפר מאוד את יכולתם של החוקרים לבצע הנדסה גנטית בעלת תפוקה גבוהה. שיבוט מולקולרי קלאסי דורש עיכול של וקטורים ותוספות עם אותם אנזימי הגבלה כדי ליצור קצוות תואמים ל"רקומבינציה ", אך במיוחד כאשר מנסים לבודד אזור מרצף ארוך יותר, כגון מתיחה של DNA גנומי, לא תמיד יש אנזימי הגבלה שיחתוך באופן ייחודי סביב אזור העניין, ולא בתוך האזור או במקום אחר ברצף. על ידי הימנעות מהצורך באתרי הגבלה אלה, recombineering מספק דרך הרבה יותר יעילה וחסכונית לעשות מבנים הנדסה גנטית.
בסרטון זה, נציג את עקרונות רקומבינציה גנטית, נספק פרוטוקול כללי לשילוב מחדש של וקטור פילוח גנים, ונדון במספר יישומים של טכנולוגיות אלה.
ראשית, בואו נדון מהי רקומבינציה וכיצד ניתן ליישם אותה.
רקומבינציה גנטית כרוכה בחילופי מידע בין מולקולות דנ"א. ב"רקומבינציה הומולוגית", מוחלפים קטעים גדולים יחסית של רצפי דנ"א דומים או זהים. תאים משתמשים בתהליך זה כדי לתקן הפסקות גדיל כפולות, ואיחודים המתרבים מינית מבצעים זאת גם בין כרומוזומים הומולוגיים במהלך מיוזה כדי להגביר את המגוון הגנטי.
רקומבינציה הומולוגית נרתמה למספר מטרות ניסיוניות, כולל שינוי של loci אנדוגני ספציפי בתאים - המכונה "פילוח גנים". הוא חל גם על הנדסת מבנים גנטיים, תהליך הנקרא "recombineering", אשר שימושי במיוחד לביצוע שינויים בקטעים גדולים של DNA למיקוד לגנום של אורגניזם. כדי לעשות זאת, חוקרים יכולים לעשות שימוש ב"ספריות גנומיות", או קבוצות של וקטורים שכל אחד מהם מכיל שברי דנ"א גנומיים ארוכים. סוגים שונים של ספריות עם יכולות שונות, בדרך כלל מופצים שיבוטים חיידקיים, נוצרו וניתן להזמין ממאגרים מסחריים או מלכ"רים. אחד הסוגים הנפוצים ביותר של ספריה גנומית נקרא כרומוזום מלאכותי חיידקי או BAC, אשר יכול לשאת גודל הכנס בין 150-350 קילובסות.
על מנת להקים מחדש מבנה, מדענים זקוקים לאורגניזם שבו מתרחשת רקומבינציה הומולוגית. שמרים Saccharomyces cerevisiae הוא באופן טבעי "רקומבינציה-מוכשר" והוא יכול בקלות לבצע רקומבינציה הומולוגית בין וקטור ולהוספה. מערכת נוספת המיושמת בדרך כלל משתמשת בחלבונים "אדומים" מבקטריופאג ' למדה, אשר מחדש בחיידק E. coli. וקטורים יכולים להיות recombineered או בזני חיידקים מבוססים בעבר ביטוי אדום, או מרכיבי מערכת אדומה קידוד plasmid יכול להיות שיתוף פעולה עם מצעים recombineering לתוך החיידקים.
עכשיו, בואו נעבור על פרוטוקול כדי ליצור וקטור פילוח גנים על ידי קומבננרציה מחדש.
מטרת הפרוטוקול הזה היא ליצור עכבר מהונדס גנטית עם שינויים ממוקדים בגן מסוים. בקצרה, השינויים הרצויים בגן העניין נעשים ב- BAC; הרצף שהשתנה "מאוחזר" לווקטור מיקוד, והווקטור הזה מועבר לתאי גזע עובריים לצורך פילוח גנים. לאחר מכן ניתן להשתמש בתאי הגזע כדי ליצור את החיה מהונדסת גנטית. לקבלת הוראות על הליך סופי זה, אנא עיין בסרטון החינוך המדעי JoVE "הנדסה גנטית של אורגניזמים מודל".
בתור התחלה, שיבוט BAC המכיל את רצף העניין הגנומי מזוהה ומוזמן. לאחר מכן, זרועות ההומולוגיה, או אוליגונוקלאוטידים המכילים את 30-50 האזורים ההומולוגיים basepair, מתוכננים. אלה oligonucleotides משמשים פריימרים בתגובות PCR כדי ליצור את ה- DNA "קלטות" המשמש לשינוי גן העניין. קלטות אלה מכילות בדרך כלל, למשל, גנים עמידים לאנטיביוטיקה שיכולים לשמש כסמני בחירה, אשר ניתן להגביר בקלות מן plasmids זמין לציבור רבים. שיבוט חיידקי BAC משתנה לאחר מכן, למשל על ידי אלקטרופורציה, עם פלסמיד קידוד רכיבי המערכת האדומה, ואחריו קלטות המכילות זרוע ההומולוגית. החיידקים הם אז דגירה בטמפרטורה המתאימה כדי לגרום רקומבינציה.
כדי לשחזר את הרצף שהשתנה מה- BAC, וקטור "אחזור" הוא ליניארי ומוגבר באמצעות פריימרים המכילים זרועות הומולוגיה המכסות מספר קילובסות סביב אתר השינוי. עמוד השדרה הווקטורי הזה הופך לשיבוט חיידקי BAC, ושילוב מחדש מושרה שוב. הווקטור יהיה "תיקון פער" על ידי "אחזור" הרצף המתאים מן BAC. התוצאה היא וקטור פילוח גנים המכיל את רצף העניין שהשתנה, כמו גם אזורים הומולוגיים לדנ"א גנומי סביב הרצף שהשתנה. לאחר מכן ניתן לטהר וקטור זה, ליניארי ולהכניסו לתאי גזע עובריים שבהם מכונות רקומבינציה הומולוגית אנדוגנית יכוונו לרצף שהשתנה אל הלוקוס המתאים, ובכך ישנו את הגנום המארח.
בואו עכשיו נסתכל על כמה יישומים של טכניקות הנדסיות מבוססות רקומבינציה.
ראשית, חוקרים יכולים להשתמש רקומבינרינג כדי להנדס במהירות ובקלות את הגנום החיידקי, למשל, כדי לחקור קומפלקסים של חלבון. כאן, קלטת קידוד תג זיקה פפטיד רציף, כמו גם סמן בחירת התנגדות kanamycin תוכנן להיות recombineered לתוך 3 ¢ קצה של גן העניין. וקטור זה הוכנס לאחר מכן אדום "רקומבינציה-מוכשר" E. coli, ו recombinants מוצלחים היו מבודדים באמצעות מדיה סלקטיבית. מתחמי החלבון המתויגים טוהרו ביוכימית באמצעות חלבונים שנקשרים בחוזקה לתגיות, ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה כדי לזהות את שותפי האינטראקציה של חלבון העניין.
Recombineering ומיקוד גנים יכול לשמש גם כדי לשנות את הגנום של אורגניזמים טפיליים, כגון טפיל תאי חובה טוקסופלזמה gondii, אשר גורם למחלה טוקסופלזמוזיס. במחקר זה, וקטור פילוח היה recombineered בשמרים, שבו רצפים גנומיים מאגפים את גן העניין הוצבו סביב סמן בחירה. הווקטור היה אז ליניארי ואלקטרופור הפך לטפילים. הגבלת ציפוי דילול במדיה סלקטיבית שימשה לבידוד רקומביננטים מוצלחים, שבהם מכונות רקומבינציה הומולוגיות של הטפיל החליפו את הרצף הגנומי ברצף המהונדס, ובכך מחקו את גן העניין. PCR של האזור הממוקד אישר אירועי רקומבינציה חיוביים.
לבסוף, הליך המכונה subcloning plus insertion, או SPI, הומצא שבו תיקון פערים והכנסת קלטת מתרחשים בו זמנית, מה שהופך את תהליך recombineering פשוט וגמיש יותר. קריטי להצלחת תהליך זה הוא העיצוב הנכון של זרועות ההומולוגיה מרובות, אשר, עד 180 bp, הם ארוכים יותר מאשר recombineering קונבנציונאלי כדי להגביר את יעילות recombination. לאחר שילוב זרועות ההומולוגיה בקלטות הפלסמיד וההחדרה של התת-קלאבים על ידי PCR, הם הפכו יחד לשיבוט BAC אדום- ביטוי, ושילוב מחדש הושרה. מבנים שחולבו מחדש בהצלחה זוהו אז על ידי PCR או ניתוח תקציר הגבלה.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על שילוב מחדש. בסרטון זה דנו בעקרונות של רקומבינציה וכיצד ניתן להשתמש בהם בהנדסה גנטית, פרוטוקול לפרויקט רקומבינרינג, ולבסוף מספר יישומים של טכניקות אלה. כמו תמיד, תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is homologous recombination and how does it differ from classical molecular cloning?
Homologous recombination is the exchange of DNA between molecules based on stretches of similar or identical sequences. Unlike classical molecular cloning, which requires specific restriction enzyme sites to generate compatible ends, homologous recombination avoids this limitation. This makes recombineering a more efficient and cost-effective approach for engineering and recombinant dna technology, especially when restriction sites are unavailable around the region of interest.
Q2: What are the key components needed to perform a recombineering experiment?
Recombineering requires a recombination-competent organism, such as yeast Saccharomyces cerevisiae or E. coli expressing Red proteins from bacteriophage lambda. Researchers also need genomic libraries containing long DNA fragments, with bacterial artificial chromosomes (BACs) being commonly used because they carry insert sizes between 150-350 kilobases. These components enable efficient homologous recombination between vectors and inserts.
Q3: How are homology arms designed and used in the recombineering protocol?
Homology arms are oligonucleotides containing 30-50 basepair homologous regions designed to flank the target sequence. These serve as primers in PCR reactions to generate DNA cassettes that modify the gene of interest. In advanced procedures like subcloning plus insertion (SPI), homology arms can be up to 180 bp long to increase recombination efficiency, making the process more flexible and reliable.
Q4: What is the purpose of a retrieval vector in creating a gene-targeting construct?
A retrieval vector is linearized and amplified using primers containing homology arms that span several kilobases around the modification site. When transformed into the BAC clone, the vector undergoes gap-repair by retrieving the modified sequence from the BAC. This produces a gene-targeting vector containing the modified sequence plus regions homologous to genomic DNA, which can then be introduced into embryonic stem cells for targeted genome modification.
Q5: How can recombineering be applied to study protein interactions in bacteria?
Researchers design cassettes encoding sequential peptide affinity tags and selection markers like kanamycin resistance, then recombineer them into the 3' end of target genes in Red-competent E. coli. Successful recombinants are isolated using selective media. The tagged protein complexes are then biochemically purified using proteins that bind to the tags and analyzed by mass spectrometry to identify interaction partners.
Q6: What advantages does recombineering offer for modifying parasite genomes?
Recombineering enables precise genome modification in parasitic organisms like Toxoplasma gondii. A targeting vector with genomic sequences flanking the gene of interest is recombineered in yeast, then linearized and electroporated into parasites. The parasite's homologous recombination machinery replaces the genomic sequence with the engineered version, effectively deleting or modifying target genes. PCR confirms successful recombination events.
Q7: Why is proper homology arm design critical for the success of subcloning plus insertion (SPI)?
In SPI, gap repair and cassette insertion occur simultaneously, requiring precise homology arm design to ensure efficient recombination. Homology arms in SPI are longer, up to 180 bp compared to conventional recombineering, increasing recombination efficiency and success rates. After PCR incorporation into subcloning plasmids and insertion cassettes, they are transformed into Red-expressing BAC clones and verified by detection and quantification nucleic acids or restriction digest analysis.