How do genome editing techniques create targeted mutations in DNA?

Genome editing methods use engineered nuclease enzymes to create small cuts or double-strand breaks in specific DNA sequences. Cells attempt to repair this damage through nonhomologous end joining or homology-directed repair. During repair, mutations are introduced into the targeted region with much higher efficiency than classical gene targeting methods.

What is the difference between NHEJ and HDR in DNA repair?

Nonhomologous end joining (NHEJ) directly reseals broken DNA ends but often imperfectly, deleting or adding bases and mutating the target sequence. Homology-directed repair (HDR) fixes damage by copying from a homologous template, allowing researchers to add specific sequences to direct precise changes at the target site.

How do zinc finger nucleases and TALENs differ in their targeting approach?

Zinc finger nucleases (ZFNs) fuse DNA-binding zinc finger domains to the FokI endonuclease, with each domain recognizing a specific nucleotide triplet. TALENs join FokI to bacterial transcription activator-like effector domains, where each domain recognizes a single unique DNA base, providing different levels of sequence specificity.

Why is the CRISPR-Cas9 system advantageous compared to protein-based genome editing methods?

The CRISPR-Cas9 system uses customizable RNA guide sequences called single guide RNAs (sgRNAs) to target Cas9 to desired genetic sequences. This RNA-based approach provides distinct advantages over protein-based methods like ZFNs and TALENs because the guide sequence can be easily modified to target almost any genomic location in mammalian cells or other systems.

What role does the protospacer adjacent motif play in CRISPR-Cas9 targeting?

The protospacer adjacent motif (PAM) is a 3-base pair sequence located at the 3' end of the target DNA region. Cas9 requires the PAM to recognize and cleave the target DNA, and the exact PAM sequence is specific to the organism from which the Cas9 enzyme originated, making it essential for successful genome editing.

How are CRISPR guide sequences synthesized and incorporated into cells?

Two complementary oligonucleotides matching the target sequence are synthesized, denatured, and annealed. The resulting guide sequence is ligated into a plasmid containing an sgRNA scaffold using restriction enzymes and ligase. The CRISPR construct is then co-transfected with a Cas9-encoding construct into target cells, which are cultured and screened by PCR or sequencing for desired mutations.

What are some current applications of genome editing in research?

Researchers use genome editing to insert reporter sequences like green fluorescent protein into specific genes, generate knockout organisms where genes are rendered non-functional, and create large genetic deletions by inducing two double-strand breaks in the same chromosomal region. These applications enable study of gene function and disease mechanisms in model organisms and cultured cells.

עריכת גנום

0 צפיות08:31 דק'

עריכת הגנום כוללת טכניקות שבהן חוקרים יכולים "לערוך" או לשנות רצף דנ"א ספציפי. שיטות אלה מסתמכות על יצירת "חתכים" קטנים ב- DNA, אשר תאים מנסים לתקן, לעתים קרובות באופן חלקי. באופן זה, מדענים יכולים לגרום מוטציות ברצפים ממוקדים עם יעילות רבה יותר בהשוואה פילוח גנים קלאסי.

בסרטון זה נסקור את העקרונות שמאחורי שלוש טכניקות לעריכת גנום, ונדון בפרוטוקול כללי עבור אחת מהן, מערכת CRISPR-Cas9. לאחר מכן נחקור כמה יישומים של שיטות אלה.

ראשית, בואו נסתכל על העקרונות שמאחורי עריכת הגנום.

השיטה הקלאסית להכנסת שינויים גנטיים לרצפים ספציפיים בגנום היא פילוח גנים על ידי רקומבינציה הומולוגית, שבה שילוב רצפים הומולוגיים במבנה המיקוד מוביל ל"מעבר " של הגן האנדוגני לגרסה שונה.

בדומה לפילוח גנים, עריכת גנום יכולה למקד שינויים באזורי דנ"א ספציפיים, אך היא יכולה לעשות זאת ביעילות גבוהה בהרבה, ולבסס את המוטציות הרצויות ביותר תאים בכל ניסוי נתון.

כל שיטות עריכת הגנום מסתמכות על יכולתו של תא לתקן שברים כפולים שנעשו לדנ"א שלו על ידי אנדונוקלאזים. נזק זה עשוי להיות מתוקן על ידי הצטרפות קצה לא הומולוגי או NHEJ, שבו קצות DNA שבורים נחסמים מחדש ישירות; או על ידי תיקון או HDR מונחה ההומולוגיה, שבו הנזק קבוע על ידי העתקה מתבנית הומולוגית. NHEJ אינו מושלם בדרך כלל, ועלול לגרום למחיקה או הוספה של מספר בסיסים ל- DNA המתוקן, ובכך לשנות את רצף היעד. מצד שני, HDR מאפשר לחוקרים להוסיף תבנית כדי לכוון שינויים ספציפיים לאתר היעד.

שלוש טכניקות עריכת גנום עיקריות פותחו והפכו לפופולריות בשנים האחרונות.

בשיטה אחת, חוקרים משלבים תחומים מחייבי DNA של "אצבע אבץ" של גורמי שעתוק מסוימים לתחום מבקע ה- DNA של FokI endonuclease. מכיוון שכל תחום אצבע אבץ מזהה שלישיית נוקלאוטיד ספציפית, ניתן לקשר תחומים אלה באופן מלאכותי כדי להנדס גרעיני אצבע אבץ, או ZFNs, המתמקדים ברצפי דנ"א ייחודיים.

באופן דומה, גרעינים הנקראים "TALENs" מצטרפים לפוק1 לתחומים המשתנים של חלבונים חיידקיים הנקראים מפעילי שעתוק, או TALEs. כל תחום TALE מזהה בסיס DNA יחיד וייחודי, ומעניק ל- TALENs את הספציפיות שלהם לרצף.

לבסוף, מערכת CRISPR-Cas9 משתמשת ברכיבים של מערכת חיסונית פרוקריוטית שבדרך כלל מגנה על הפונדקאי שלה מפני פלישה על ידי חומרים גנטיים זרים, כמו אלה בווירוסים או פלסמידים. במערכת זו, פיסות דנ"א זר פולש הנקראות "protospacers" משולבות בלוקוס CRISPR, אשר מתומלל ומעובד על ידי מכונות חלבון-RNA לתוך RNAs קטנים הנקראים crRNAs.

מדענים רותמים את מכונות CRISPR למטרות עריכה גנומית על ידי עיצוב רצפי מדריך דמויי CRRNA המכונים "מדריך יחיד" או sgRNA, אשר ניתן להשתמש בהם כדי למקד את Cas9 כמעט לכל רצף גנטי רצוי בתאי יונקים, או מערכות עניין אחרות. יכולת ההתאמה האישית הפשוטה של מערכת CRISPR-Cas9 מבוססת רצף הרנ"א מספקת יתרונות ברורים על פני שיטות עריכת גנום מבוססות חלבון כמו ZFNs ו-TALENs.

כעת, לאחר שלמדתם על העקרונות שמאחורי עריכת הגנום, בואו נסקור פרוטוקול טיפוסי של שימוש ב-CRISPR כדי ליצור שינויים גנטיים ממוקדים בתאי יונקים.

ראשית, נבחר מיקום גנומי לעריכה. אזור זה חייב להיות קצר - כ- 20 זוגות בסיס בגודל - ובעל מוטיב "פרוטוספייסר סמוך" ארוך של 3 בסיסים או "PAM" בקצה 3′. ה- PAM נדרש כדי ש- Cas9 יזהה ויבקע את אזור הדנ"א של היעד, והרצף המדויק הוא ספציפי לאורגניזם המקור של ה- Cas9 הנמצא בשימוש. לאחר שזוהה אתר פוטנציאלי, יש לחפש אותו מול רצף הגנום כדי להבטיח שאתרים דומים לא יימצאו במקום אחר בגנום, ולכן לא ייערכו אזורים גנומיים מחוץ למטרה.

כדי לסנתז את רצף קו היישור CRISPR, נוצרים שני אוליגונוקלאוטידים, אחד זהה ואחד משלים לרצף היעד. רצפים נוספים כלולים בקצוות 5′ שלהם לצורך תאימות עם וקטורים sgRNA. לאחר מכן, אוליגונוקלאוטידים אלה מעורבבים יחד, מושפלים, ואז מחושים.

לאחר מכן, פלסמיד המכיל "פיגום" של sgRNA נחתך עם אנזים ההגבלה המתאים, מעורבב עם רצף מדריך CRISPR מסונתז, ודגורה עם אנזים ליגאז כדי ליצור את מבנה sgRNA. לאחר מכן ניתן להפוך את הפלסמיד לחיידקים ולתרבות להגברה. לאחר שטוהר מחיידקים, מבנה CRISPR מועבר בשיתוף עם מבנה קידוד Cas9 לתוך התאים שהגנום שלהם יש לערוך. תאים אלה שהודבקו מתורבתים ויוצרים מושבות כליות.

ניתן לבודד את הדנ"א הגנומי מכל מושבה ולנתח אותו על ידי PCR או רצף כדי לסנן את אלה שבהם מערכת CRISPR הפיקה את המוטציות הרצויות.

בואו נסתכל על כמה דרכים שבהן מדענים משתמשים בטכניקות עריכת גנום.

חוקרים רבים משתמשים בעריכת גנום כדי להכניס רצפי כתבים ללוצי ספציפי. בניסוי זה, ZFNs שימשו להחדרת חלבון פלואורסצנטי ירוק לגן המעורב בהתפתחות נוירונים והישרדות. החוקרים אישרו כי הם התמקדו נכון בגן זה על ידי הנחת תאי גזע להבדיל לנוירונים, וביצוע אימונופלואורסצנטיות כפולה עבור GFP וסמנים עצביים.

עריכת הגנום גם הקלה בהרבה על יצירת אורגניזמים "נוקאאוט" שבהם גן מעניין הופך ללא פונקציונלי. כאן, החוקרים ביקשו ליצור עכברי נוקאאוט על ידי הזרקת עוברים עם סיפורי קידוד mRNA המכוונים לגנים ספציפיים. טיפול אנדונוקלאז לאחר מכן של DNA מעכברים שטופלו TALEN אפשר לחוקרים לזהות בעלי חיים עם מוטציות בשני העותקים של הגן הממוקד.

לבסוף, עריכת גנום יכולה לשמש ליצירת מחיקות גנטיות גדולות על ידי גרימת שתי הפסקות גדיל כפול באותו אזור כרומוזומלי. מחיקות גדולות אלה עשויות להיות נחוצות כאשר הפונקציה של גן או אלמנט גנטי לא ניתן לדפוק על ידי מחיקות קטנות שנוצרו עם פרוטוקולי עריכת גנום קונבנציונאלי. כאן, החוקרים שיתוף אלקטרופורציה תאים סרטניים עכבר עם מבנה GFP ושני מבנים CRISPR מיקוד אזורים שונים בתוך גן נהיגה בסרטן. תאים שהודבקו בהצלחה, אשר ובכך פולטים אות GFP, היו מבודדים על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, ו- PCR ורצף תאים מזוהים הבאים שבהם נמחק אזור ה- DNA בין שני האתרים הממוקדים על-ידי CRISPR.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על עריכת גנום. כאן, סקרנו את העקרונות שמאחורי ZFNs, TALENs ו- CRISPR, חקרנו פרוטוקול CRISPR-Cas9 כללי ודנו באופן שבו חוקרים משתמשים בטכניקות עריכת גנום כיום. כמו תמיד, תודה שצפית!

טכניקה מבוססת היטב לשינוי רצפים ספציפיים בגנום היא פילוח גנים על ידי רקומבינציה הומולוגית, אך שיטה זו יכולה להיות מייגעת ופועלת רק באורגניזמים מסוימים…

Browse More Videos

CRISPR Cas9

Zinc Finger Nucleases

TALENs

DNA Repair

Homologous Recombination

Nonhomologous End Joining

Homology Directed Repair

Double Strand Breaks

Guide RNA Design