Question 1

כיצד טכניקות לעריכת גנום יוצרות מוטציות ממוקדות ב-DNA?

Accepted Answer

שיטות לעריכה גנומית משתמשות באנזימי נוקלאז מהונדסים כדי ליצור חתכים קטנים או שברים בדו-גדיל ברצפי DNA ספציפיים. תאים מנסים לתקן נזק זה באמצעות חיבור קצוות לא-הומולוגי (nonhomologous end joining) או תיקון מודרך-הומולוגיה (homology-directed repair). במהלך התיקון, מוחדרות מוטציות לאזור המטרה ביעילות גבוהה בהרבה מאשר בשיטות קלאסיות לטרגוט גנים.

Question 2

מה ההבדל בין NHEJ ל-HDR בתיקון DNA?

Accepted Answer

חיבור קצוות שאינו הומולוגי (NHEJ) סוגר באופן ישיר קצוות שבורים של DNA, אך לעיתים קרובות הדבר נעשה באופן לא מושלם, תוך מחיקה או הוספה של בסיסים והשראת מוטציה ברצף המטרה. תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) מתקן את הנזק על ידי העתקה מתבנית הומולוגית, מה שמאפשר לחוקרים להוסיף רצפים ספציפיים כדי להנחות שינויים מדויקים באתר המטרה.

Question 3

במה נבדלים נוקלאזות אצבעות אבץ ו-TALENs בגישת התargeting שלהם?

Accepted Answer

נוקלאזות אצבעות אבץ (ZFNs) מחברות דומיינים של אצבעות אבץ הקושרים DNA לאנדונוקלאז FokI, כאשר כל דומיין מזהה שלשיית נוקליאוטידים ספציפית. TALENs מחברות את FokI לדומיינים של effector דמויי מפעיל שעתוק חיידקי, שבהם כל דומיין מזהה בסיס DNA יחיד וייחודי, מה שמעניק רמות שונות של ספציפיות לרצף.

Question 4

מדוע מערכת CRISPR-Cas9 עדיפה בהשוואה לשיטות עריכה גנומית מבוססות חלבון?

Accepted Answer

מערכת ה-CRISPR-Cas9 משתמשת ברצפי RNA מנחים הניתנים להתאמה אישית, הנקראים sgRNAs (single guide RNAs), כדי לכוון את Cas9 לרצפים גנטיים רצויים. גישה זו, המבוססת על RNA, מעניקה יתרונות ברורים על פני שיטות המבוססות על חלבונים, כגון ZFNs ו-TALENs, כיוון שניתן לשנות בקלות את רצף המנחה כדי לכוון כמעט לכל מיקום גנומי בתאי יונקים או במערכות אחרות.

Question 5

מהו התפקיד של ה-protospacer adjacent motif בתהליך המכוון של CRISPR-Cas9?

Accepted Answer

המוטיב הסמוך לפרוטוספייסר (PAM) הוא רצף של 3 זוגות בסיסים הממוקם בקצה ה-3' של אזור ה-DNA המטרה. Cas9 זקוק ל-PAM כדי לזהות ולחתוך את ה-DNA המטרה, ורצף ה-PAM המדויק הוא ספציפי לאורגניזם ממנו הגיע אנזים ה-Cas9, מה שהופך אותו לחיוני לעריכת גנום מוצלחת.

Question 6

כיצד מסנתזים רצפי מנחה של CRISPR וכיצד מטמיעים אותם בתאים?

Accepted Answer

שני אוליגונוקלאוטידים משלימים התואמים לרצף המטרה מסונתזים, עוברים דנטורציה ואנילינג. רצף המנחה המתקבל מולחם לתוך פלסמיד המכיל scaffold של sgRNA באמצעות אנזימי הגבלה וליגאז. לאחר מכן, מבנה ה-CRISPR מועבר בטרנספקציה משותפת עם מבנה המקודד ל-Cas9 לתאי המטרה, אשר גודלים בתרבית ונבדקים באמצעות PCR או ריצוף לאיתור מוטציות רצויות.

Question 7

מהן כמה מהיישומים הנוכחיים של עריכת גנום במחקר?

Accepted Answer

חוקרים משתמשים בעריכה גנומית כדי להחדיר רצפי דותק (reporter sequences), כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק, לתוך גנים ספציפיים, ליצור אורגניזמי נוק-אאוט (knockout) שבהם גנים הופכים לבלתי פונקציונליים, וליצור מחיקות גנטיות נרחבות על ידי השראה של שני שברים דו-גדיליים באותו אזור כרומוזומלי. יישומים אלו מאפשרים את חקר תפקודי הגנים ומנגנוני מחלות באורגניזמי מודל ובתאים מתרבות.

עריכת גנום - חידון הערכה