Name: חרוז לזווג עם מגנט במערך צורניים Microwells עם משתנה גיאומטריות קעורה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: למד לייצר מיקרובארים קעורים ב-PDMS באמצעות כוח מגנטי וחרוזי פלדה לתרביות תלת-ממדיות. שיטה זו מאפשרת יצירת מאות מיקרובארים בשטח קטן ללא ציוד מורכב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על-ידי התוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) במימון של משרד המדע, ICT ותכנון העתיד (ה-NRF-2014R1A1A2057527 ו- NRF-2016R1D1A1B03934418).

1. הכנת מערך דרך חור אלומיניום פלייט, מגנט מערך
<ol><li>להכין שני 50 מ"מ x 50 מ"מ (או גדול) פלטות אלומיניום. העובי של כל צלחת היה מיקרומטר 300 זה ממחצית הקוטר חרוז.</li>
	<li>טופס מערך דרך חור 30 x 30 על אחד הלוחות אלומיניום באמצעות חרט סיבוביים CNC עם Φ550-מיקרומטר מיקרו מקדחה עם 30 מ מ/s של 8000 סל"ד של פלך מהירות וקצב מים עמוקים. המרחק בין כל חור (מרכז למרכז) היה 1 מ מ (איור 1a ו- איור 2a, אני).</li>
	<li>טופס מערך 30 x 30 מיקרומטר Φ750 דרך חורים על אחרים הצלחת אלומיניום, באמצעות ההליך אותו כמו זה שמתואר 1.2 (איור 1a , איור 2a, ii).</li>
	<li>לצרף שתי צלחות אחד את השני באמצעות סרט דביק ויוצרים Φ3 מ"מ יישור חורים בכל אחד בארבע הפינות של שתי פלטות אלומיניום.</li>
	<li>לטבול הלוחות אלומיניום 15% חומצה גופרתית במשך 12 שעות לניקוי משטחים שלהם. מאז שכבה דקה של אלומיניום אוקסיד על פני השטח של האלומיניום להפוך עמידים בפני קורוזיה, קוטר חור ואת עובי הלוח אינם משתנים על ידי טיפול החומצה הזו.</li>
	<li>טופס מערך 30 × 30 1 x 1 x 1 מ מ נאודימיום מגנטים (עם כוח מגנטי של 0.363 N). ודא כי כל מגנט הקוטביות הפוכה לשכן שלו. כדי למנוע את שבירת או פיזור של המערך מגנט, לצרף צלחת 30 x 30 מ מ אלומיניום התחתון של המערך מגנט באמצעות סרט הדבקה דו-צדדי (איור 2 א, השלישי, שיבוץ ב איור 2).</li>
</ol>2. חרוז השמנה תהליך
<ol><li>ליישר, לערום את שני לוחות אלומיניום (top צלחת: 750-מיקרומטר-חור צלחת, צלחת התחתון: 550-מיקרומטר-חור צלחת) באמצעות החורים יישור מוכן בארבע פינות של כל צלחת (איור 1b).</li>
	<li>לנעול את שתי צלחות יחד על-ידי הוספת M3 ברגים לתוך החורים יישור ולאחר מכן לאבטח את המנעולים עם אגוזים (איור 1b).</li>
	<li>מחסנית מכלול לוחית אלומיניום במערך מגנט מוכן (איור 1b, 2bו- 2 c). יישר את המערך של מגנטים, המערך של דרך חורים לוח אלומיניום במהלך תהליך הערימה. לאחר מכן להשתמש סרט דביק כדי לתקן את המיקום של המערך מגנט.</li>
	<li>המקום מספר מספיק של Φ600 מ"מ SUJ2 פלדה חרוזים על מכלול צלחת ולטפל החרוזים באמצעות אקריל (או מתכתיים) צלחת כזו חרוז. הופך להיות לכוד בתוך כל חור (איור 1 ג, 1 דו 1e) בזמן בו זמנית הסרת את החרוזים עודף אשר לא הגישו החורים.</li>
	<li>הסר בזהירות את הפלטה כדי למנוע פיזור לא רצויים פריקה של חרוזים לכודה (איור 1f).</li>
</ol>3. קעורה microwell ייצור
<ol><li>להעביר כייר קעורה microwell, מיוצר בשלבים 2.1-2.5, לעיל, צלחת פטרי.</li>
	<li>מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) מונומר והסוכן ריפוי על-פי הוראות היצרן19 עם מונומר PDMS: אשפרה הסוכן יחס של 10:1.</li>
	<li>גז מבטל את התערובת PDMS באמצעות desiccator וחדר משאבת ואקום כדי להסיר את כל הבועות לכוד בתוך התערובת PDMS.</li>
	<li>שופכים את התערובת PDMS לתבנית microwell קעורה וגז והתבקשתי שוב באמצעות אותו הנוהל כמו זה שמתואר 3.3 (איור 1f).</li>
	<li>אופים את התערובת PDMS על גזייה ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעתיים ליצור מצע PDMS חרוז-מוטבע (איור 1 g).</li>
	<li>הסר את המצע PDMS נרפא התבנית (איור 1 g). בתהליך הסרת, תרסיס מתנול באמצעות בקבוק כביסה כדי לנתק PDMS המצע של העובש.</li>
	<li>שימוש של Φ15 מ מ x 2 מ מ מגנט, הסר את החרוזים פלדה לכוד המצע PDMS (איור 1 h). במשך תהליך זה, כל מגנט חזקה דיה כדי לחלץ את החרוזים של המצע PDMS יכול לשמש.</li>
</ol>4. ספרואיד תרבות
<ol><li>חותכים המצע PDMS קעורה בדוגמת microwell באמצעות אגרוף ביופסיה מ מ Φ14 כדי להיות מצויד בצלחת 24-ובכן במחקר זה.</li>
	<li>לעקר את המצע PDMS מ"מ Φ14 שנוצר במעקר אוטוקלב 121 מעלות צלזיוס ו 15 psi.</li>
	<li>מקם את המצע PDMS סטיריליים לצלחת 24. טוב.</li>
	<li>מעיל המצע PDMS שלם עם 4% (w/v) pluronic F-127 פתרון בן לילה כדי למנוע התא מצורף אל פני השטח microwell. במהלך תהליך ציפוי, להסיר את כל בועות האוויר בפח של microwells קעורה באמצעות pipetting או באמצעות שימוש של ניקוי אולטראסוניות.</li>
	<li>לרוקן את הפתרון F-127 שלוש פעמים על-ידי שימוש באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).</li>
	<li>זרע 1 מ"ל של התא-בינוני (של Dulbecco ששינה נשר בינוני) פתרון (המכיל 2 x 106 תאים) על המצע PDMS. שימו לב כי ניתן לשנות את צפיפות זריעה לפי גודל ספרואיד היעד ו/או סוג תא היעד. . הנה, נגזר שומן בתאי גזע (ASC) שימשו.</li>
	<li>האחות של 1 מ"ל של מדיום באמצעות פיפטה µL של 1000 כדי להסיר תאים עודף זה לא נלכדו microwells (איור 3).</li>
	<li>דגירה התאים ב- 36.5 ° C, לחות של > 95% ו- 5% CO2 תנאי. במקרה של השיקופיים השתמשו במחקר שלנו, התאים צבירה כדי ספרואיד 48 שעות.</li>
</ol>

<ol><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Djordjevic, B., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+spheroids+as+a+tool+for+prediction+of+radiosensitivity+in+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy.</a> Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).</li>
<li>Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+immuno-cytochemical+characterization+of+a+hetero-spheroid+composed+of+fibroblasts+and+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes.</a> J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).</li>
<li>Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brave+little+world%3A+spheroids+as+an+in+vitro+model+to+study+tumor-immune-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions.</a> Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+multicellular+tumor+spheroid+model+using+microencapsulation+and+its+application+in+anticancer+drug+screening+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing.</a> Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).</li>
<li>Kim, B. C., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13233-014-2044-7">Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell.</a> Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+production+and+growth+of+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids.</a> Cancer Res. 37 (10), 3639-3643 (1977).</li>
<li>Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+medium+composition+on+the+morphology+and+function+of+rat+hepatocytes+cultured+as+spheroids+and+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol-Animal%22%5BJournal%5D)">Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37 (10), 656-667 (2001).</li>
<li>Nyberg, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+large-scale+formation+of+porcine+hepatocyte+spheroids+in+a+novel+spheroid+reservoir+bioartificial+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplant%22%5BJournal%5D)">Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver.</a> Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).</li>
<li>Lazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+liver-specific+functions+of+porcine+hepatocyte+spheroids+entrapped+in+collagen+gel%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol-Animal%22%5BJournal%5D)">Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
<li>Choi, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled-size+embryoid+body+formation+in+concave+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays.</a> Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).</li>
<li>Hwang, J. W., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13233-012-1202-4">Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array.</a> Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).</li>
<li>Wong, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concave+microwell+based+size-controllable+hepatosphere+as+a+three-dimensional+liver+tissue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model.</a> Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).</li>
<li>Yeon, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+concave+microwells+to+pancreatic+tumor+spheroids+enabling+anticancer+drug+evaluation+in+a+clinically+relevant+drug+resistance+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model.</a> PloS one. 8 (9), (2013).</li>
<li>Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-lithographic+fabrication+of+concave+microwells+and+a+microfluidic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network.</a> Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).</li>
<li>Corning, D. <a target="_blank" href="null">Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet</a>. , (2008).</li>
<li>Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+cavities+in+polydimethylsiloxane+using+DRIE+silicon+molds%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1660-1662 (2007).</li>
<li>Choi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/ra/c4ra09730k#!divAbstract">Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure.</a> RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).</li>
<li>Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0030402613014460">Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique.</a> Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+multi-level+microchannel+fabrication+by+pseudo-grayscale+backside+diffused+light+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+advances%22%5BJournal%5D)">Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography.</a> RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+3D+hair+follicle-like+hydrogel+by+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+MAter+Res+A%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography.</a> J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).</li>
<li>Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+organoid+culture+of+rat+hepatocytes+and+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells.</a> J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).</li>
</ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

האתגר של מרכזי בשיטה זו פבריקציה נוספת היה מתקן מאובטח של החרוזים במערך דרך חור בצלחת אלומיניום. כדי לפתור את האתגר הזה, כוח מגנטי בצורה של מערך מגנט 30 x 30 שימש כדי לתקן את החרוזים בצורה מאובטחת, כפי שמוצג דמויות 6 ו -7. צפיפות השטף המגנטי של המערך מגנט, הכולל את הקוטביות הפוכה, הוא החזק ביותר במרכז כל משטח מגנט. כי הכוח של הכוח המגנטי תלוי צפיפות השטף, החרוזים מונחים למרכז המשטח העליון של כל מגנט שבו הוחזקו במצב. אם יחיד גדול בגודל מגנט (5 ס"מ × 5 ס"מ × 1 ס מ) שימש, החרוזים, במיוחד אל...

התאים גדלו לתוך טופס ספרואיד דומים יותר אמיתי רקמות בגוף מאשר תרבות מישורי דו-ממדי1. בהתחשב יתרון זה, השימוש spheroids אומץ כדי לשפר את המחקר של אינטראקציה לתא2,3, ההפעלה החיסונית4, סמים הקרנת5וכן בידול6. בנוסף, spheroids שילוב סוגי תאים מרובים לאחרונה הוחלו על organoids (ליד-פיזיולוגיים תלת מימדי (3D) רקמות), אשר מאוד שימושי עבור לימוד ופיתוח המחלה האנושית7. מספר שיטות השתמשו כדי לייצר spheroids. השיטה הפשוטה ביותר כרוך הניצול של משטח ללא דבק, כך התאים צבירה עם כל טופס spheroids. צלחת פטרי יכולים להיות מטופלים עם אלבומין שור, pluronic F-127 או פולימר הידרופובי (למשל פולי 2-hydroxyethl methacrylate) כדי להפוך את השטח ללא דבק89. השיטה ספינר-הבקבוק הוא אמצעים ידועים אחרים לייצר כמויות גדולות של spheroids10,11. בשיטה זו, תאים מוחזקים השעיה על-ידי ערבוב כדי למנוע מהם להפוך למצע. במקום זאת, הצפים תאים צבירה כדי טופס spheroids. שיטת משטח ללא דבק והן טווה את הבקבוק שיטה לייצר כמויות גדולות של spheroids. עם זאת, הם כפופים למגבלות לרבות קשיים שליטה בגודל ספרואיד, כמו גם את המעקב וניטור של כל ספרואיד. כתרופה בעיות כאלה, שיטה אחרת ספרואיד הייצור, כלומר, התליה זרוק שיטה יכול להיות מועסקים12. פעולה זו כרוכה הפקדת תא טיפות השעיה על החלק התחתון של המכסה לצלחת תרבות. טיפות אלה הם בדרך כלל 15 אל 30 µL בגודל ומכילים כ 300 עד 3000 תאים13. כאשר המכסה היא הפוכה, הטיפות מתקיימים במקום על ידי מתח. הסביבה microgravity כל טיפה מרכזת את התאים, המהווים ואז spheroids יחיד-הממשק נוזלי-אוויר חופשי. היתרונות של התליה טיפה שיטה הם שהיא מציעה התפלגות גודל ומבוקרות היטב, בעוד קל לאתר ולעקוב אחר כל ספרואיד, יחסית ללא דבק השטח, טווה את הבקבוק השיטות. עם זאת, שיטה זו כרוך חיסרון אחד בייצור מאסיבי של spheroids תהליך הייצור עצמה היא מוגזמת עבודה אינטנסיבית.
מערך microwell הוא שטוח צלחת עם בארות רבות בגודל מיקרו, שלכל אחד מהם בקוטר הנע בין 100 מיקרומטר 1000. העיקרון ייצור ספרואיד בעת שימוש microwells דומה לזה של שיטת משטח ללא דבק. היתרונות כוללים את העובדה כי microwells לספק רווחים בין microwells להפריד את התאים או spheroids, כך קל לשלוט על גודל ספרואיד, תוך כדי גם מה שהופך אותו קל לעקוב אחר כל ספרואיד יחיד. עם מספר גדול של microwells, ייצור תפוקה גבוהה ספרואיד אפשרי גם כן. יתרון נוסף של microwells הוא האפשרות טופס בארות של צורות שונות (מסגרות, גלילי, הטריגונלית מנסרתיים) בהתאם למטרות ניסוי ייחודי של המשתמשים. בדרך כלל, עם זאת, תלת מימדי (3D) קעורה (או המיספרי) צורה כמטוס המתאימים ביותר להפקת spheroids יחיד בגודל אחיד. לכן, התועלת של microwells קעורה דווחה ללימודי ביולוגיה תא רבים כגון אלה לבחון את הבידול cardiomyocyte של תאי גזע עובריים14, הפרשת אינסולין תא איון אשכולות15, פעילות אנזימטי של hepatocytes16, וההתנגדות סמים של גידול spheroids17.
לצערי, הזיוף של microwells לעיתים קרובות דורשת מתקנים מיוחדים micropatterning; שיטות קונבנציונליות מבוססי פוטוליתוגרפיה דורשות חשיפה ומתקני המתפתח בעוד שיטות המבוססות על יון-איכול תגובתי צריך ציוד פלזמה ויון-קרן. ציוד כזה הוא יקר, יחד עם תהליך ייצור מורכב, שמציג מחסום כניסה גבוה לביולוגים שאין להם גישה מיקרוטכנולוגיה. כדי להתגבר על בעיות אלה, חסכונית בשיטות אחרות כגון קרח ליתוגרפיה18 (באמצעות טיפות מים קפואים), שיטת הממברנה הגמישה14 (באמצעות קרום, דרך חור המצע ואקום) שהוצעו. עם זאת, שיטות אלה כרוכים גם החסרונות רציני כמו שזה היה קשה לשלוט את גודל דוגמת המילוי, הפרי של יחסי גודל גבוה, ואת הייצור של אזור גדול יותר microwells.
כדי להתגבר על הבעיות הנ ל, מה שאנו מציעים שיטת ייצור חדשניים microwell קעורה ניצול מצע דרך חור פלדה חרוזים, מערך מגנט. באמצעות שיטה זו, מאות קעורה microwells כדורית יכול להיות מפוברק על ידי ניצול של המנגנון של מגנטי כוח-בסיוע עצמית נעילה מתכתי חרוזים (איור 1). תהליך ייצור כרוכה בשימוש במתקני מעט מאוד יקר ומסובך, אינה דורשת מיומנויות מתקדמות רבות. ככזה, אנשים אפילו מיומנים יכולים בקלות מתחייבים בשיטה זו פבריקציה נוספת. כדי להדגים את השיטה המוצעת, נגזר על האדם-שומן בתאי גזע היו תרבותי ב microwells קעורה כדי לייצר spheroids.

<table><tbody><tr><td>חרט סיבובי CNC</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>מקדח מיקרו</td><td>HAM Pr&auml; zision</td><td>30-1301 TA</td><td>&Phi; 0.55 ו-0.75 מ"מ</td></tr><tr><td>חומצה גופרתית 98%</td> <td>Daejung</td><td>7683-4100</td><td>לניקוי צלחת אלומיניום. לדלל במים מזוקקים עם תמיסה של 15%</td></tr><tr><td>מגנט ניאודימיום</td><td>Supermagnete</td><td>W-01-N</td><td>1 x 1 x 1 מ"מ</td></tr><tr><td>כדור מיסב</td><td>Agami Modeling</td><td>SUJ2</td><td>&Phi; 600 &mu; m חרוז פלדה</td></tr><tr><td>פולידימתילסילוקסן (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>פלורוניק F-127</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>p2443</td><td>לדלל עם תמיסת מלח חוצץ פוספט לתמיסה של 4% (w/v) מדיום</td></tr><tr><td>הנשר השונה של דולבקו (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>מלח פוספט חוצץ של דולבקו (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>תאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-500-011</td><td></td></tr></tbody></table>

חרוז לזווג עם מגנט במערך צורניים microwells עם משתנה גיאומטריות קעורה

A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

תרבות ספרואיד הוא כלי שימושי להבנת התנהגות הסלולר בכך שהוא מספק של ויוו-כמו סביבה תלת-ממדי. שיטות הייצור ספרואיד שונים כגון משטחים ללא דבק, טווה מבחנות, טיפות באוויר, microwells השתמשו במחקרים של אינטראקציה לתא, ההפעלה החיסונית, סמים הקרנה, גזע תאית התמיינות, ויצירת תא צורב. בין השיטות, microwells עם גאומטריה קעורה תלת מימדי השיגו את תשומת הלב של מדענים ומהנדסים, בהתחשב יתרונם של דור ספרואיד בגודל אחיד ואת הקלות שבה ניתן התגובות של spheroids בודדים פיקוח. אף-על-פי שיטות חסכוניים כגון השימוש של ממברנות גמיש, ליתוגרפיה קרח הוצעו, טכניקות אלו כרוכות חסרונות רציניים כגון קושי בשליטה על גודל התבנית, ההישג של יחסי גודל גבוהה והייצור של אזורים גדולים של microwells. כדי להתגבר על בעיות אלה, אנו מציעים שיטה חזקה בדיית קעורה microwells ללא צורך מתחם מתקני עלות גבוהה. שיטה זו משתמשת מערך דרך חור 30 x 30, פלדה מיקרומטר מאה-הזמנה מספר חרוזים, כוח מגנטי כדי לבדות 900 microwells על מצע polydimethylsiloxane (PDMS) 3 ס"מ על 3 ס"מ. כדי להדגים את הישימות של השיטה שלנו ליישומים ביולוגית התא, אנחנו תרבותי תאי גזע אדיפוז 3 ימים והפיק בהצלחה spheroids באמצעות הפלטפורמה שלנו microwell. בנוסף, נוכל לבצע סימולציה magnetostatic לחקור את המנגנון, לפיה כוח מגנטי שימש כדי ללכוד את החרוזים פלדה החורים דרך. אנו מאמינים כי שיטת ייצור microwell המוצע יכול להיות מיושם מבוססי ספרואיד הסלולר מחקרים רבים כגון והתרופות הקרנה, התחדשות רקמות, התמיינות תאי סרטן גרורות.

Microwell דפוס ולעצב קמורה זוייפו בהצלחה על-ידי ביצוע שלבים 2.1 ל 3.7. (איור 4). החרוזים פלדה מסחרי נלכדו במערך דרך חור 30 x 30. החרוזים התקיימו בחוזקה ללא פערים בין החרוזים המתאים דרך-החורים (איור 4a). צורת microwell קעורה מפוברק קעור המיספרי, בקוטר של 600 מיקרומטר, וזה זהה לזה של החרוז פלדה (איור 4b). חתך רוחב של microwell קעורה (איור 4 c) מראה כי המרחק בין microwell ה...

כתב יד זה מציג שיטה חזקה של בדיית קעורה microwells ללא צורך מתחם מתקני עלות גבוהה. באמצעות כוח מגנטי, חרוזים פלדה מערך דרך חור, מספר מאות microwells נוצרו במצע polydimethylsiloxane (PDMS) 3 ס"מ על 3 ס"מ.

חרוז לזווג עם מגנט במערך צורניים Microwells עם משתנה גיאומטריות קעורה

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

המטרה הכללית של שיטה זו היא לייצר מיקרו-בארות כדוריות קעורות באמצעות חרוזי מתכת בעלי נעילה עצמית בסיוע כוח מגנטי. שלום, שמי Gi Hun Lee, ואני עוזר הוראה באוניברסיטת Chung-Ang. במעבדה שלנו אנו מתעניינים בייצור התקנים ופלטפורמות שונות בקנה מיקרו כדי לשפר את מחקרינו בנוגע לפיתוח מכשור ביולוגי, תרביות שלהם ומבני מיקרו חדשניים.אחד מתחומי המחקר שלנו הוא פיתוח מכשירים ומתודולוגיות מיקרו חדשניים כדי לבצע התכווצות זו בסביבה תלת-ממדית. אנו מכנים זאת תרבית. תרבית זו שימושית מאוד להבנת תגובה תלת-ממדית, כיוון שהיא דומה יותר לרקמה בפועל מאשר תרבית פלטית דו-ממדית קונבנציונלית.ניסו מספר שיטות להפקת ספראייד (spread), כגון בבקבוק או במבחנות, ברשת תוף ובמיקרוגל. בין שיטות אלו, שיטת המיקרו-שקע (concave micro method) היא כלי רב עוצמה להפקה בתלת-ממד. כל גובה של המיקרו-גל נמצא בניטור, עם יכולת לשלוט בגדלים ובפיזור של הכדורים.כאן אנו מציעים את שיטתנו לייצור מיקרו-כלים קעורים באמצעות חרוז ומערך של מגנטים קטנים. באמצעות טכניקה זו, ניתן לייצר 100 מיקרו-כלים קעורים על ידי מנגנון של כוח מגנטי המסייע לחרוזים נייחים. התגבורים הם שונים בתהליך בכל קערה ואין קני מידה חוזרים.בתחילה, פלטות אלומיניום עם מערך של 230 על 30 חורים יוצרו באמצעות חריטה סיבובית ב-CNC. הפלטות מספקות מסלול מנחה עבור החרוזים, כפי שיוצג בסעיפים הבאים. הפלטות נקדחו באמצעות מקדחים בקטרים שונים, כאשר הפלטה עם החורים הקטנים יותר הוצבה בתחתית.הפינות החיצוניות נקדחות אף הן על מנת ליישר את הפלטות. לאחר מכן, שתי הפלטות מיושרות, מונחות אחת על השנייה וננעלות יחד על ידי הכנסת שלושה ברגים לחורי ה-limen ומהודקות באמצעות אומים. כפי שצוין קודם לכן, חשוב שהיצרן יניח את הפלטה בעלת החור הקטן יותר למטה, כדי שניתן יהיה לקבע את החרו지를 בתוך בארות המוליכים.השלב הבא הוא הכנת מערך של 30 על 30 מגנטים של נאודימיום. נתחיל בבידוד ידני של המגנטים וסידורם במערך של שני על שני. לאחר מכן, נסדר אותם במערך גדול יותר באמצעות פינצטה.על מנת ליצור מערך מגנטים תקין, כל מגנט חייב להיות בעל קוטביות הפוכה מזו של השכן לו. יתרה מכך, כדי למנוע שבירה או פיזור של המערך, מצמידים ליתר המערך פלטת אלומיניום באמצעות סרט דביק דו-צדדי. כעת, אנו מוכנים להרכיב כל חלק שהכנו לתוך תבנית המיקרו-בארים.מערך המגנטים מחובר בזהירות ללוח התחתון באמצעות סרט דביק רגיל. חשוב שמערך המגנטים יהיה מחובר כך שהמגנטים פונים כלפי מטה. לאחר שהלוח מאלומיניום ומערך המגנטים מסודרים כראוי, מניחים חרוזי פלדה על מכלול הלוחות.החרו지를 ששימשו במאמר שלנו הם חרוזי פלדה מסוג SUJ two בעלי קוטר של 600 micron. תהליך היישור שלנו פשוט מאוד. אנו שופכים מספר מספיק של חרוזים על המכלול וגוררים אותם החוצה באמצעות לוח אקרילי.המגנט בתחתית לוכד את החרוזים, הנכנסים לחורים של לוח האלומיניום, והחרוזים העודפים שאינם מקובעים בחורים מוסרים במהלך תהליך הגרידה. החרוזים העודפים מוסרים באמצעות מגנט נוסף. כאשר החרוזים מקובעים כראוי בתוך בארי המנחה, אנו ממשיכים בהסרת הלוח העליון.במהלך תהליך זה, ישנם מקרים שבהם החרוצים נופלים וזזים ממקומם. במקרה כזה, החזירו את החרוץ לחור באופן ידני באמצעות פינצטה. כעת תבנית המיקרו-באר הקעורה מוכנה.העבירו את הפלטפורמה לצלוחית פטרי אחרת והכינו את השלב הבא. אנו מכינים PDMS בהתאם להוראות היצרן על ידי ערבוב מונומר PDMS וחומר המקשה ביחס של 10 ל-1. כדי להסיר בועות אוויר הלכודות בתערובת ה-PDMS, אנו מבצעים ניקוון של התערובת על ידי הנחתה בתוך דסיקטור למשך כשעה.בסיום פעולה זו, ניקח את תערובת ה-PDMS לאחר ניקוי הגזים ונשפוך אותה על תבנית המיקרו-בארות הקעורה ונבצע ניקוי גזים פעם נוספת. לאחר מכן, נבשל את תערובת ה-PDMS על פלטה חמה בטמפרטורה של 80 °C למשך שעתיים כדי ליצור מגש משני של PDMS עם מיקרו-בארות מוטמעות. את התהליך הבא יש לבצע בזהירות רבה.על מנת להקל על תהליך ההסרה, שופכים מתנול על תבנית המשנה (sub tray) ומסירים את תבנית המשנה ההיקפית של ה-PDMS באופן רצפי. יש לציין כי על היצרן לוודא שהמתנול חודר היטב למרווחים כדי להבטיח הסרה נקייה. לאחר מכן מפרידים את תבנית המשנה של ה-PDMS מלוח האלומיניום; קל יותר לחתוך את הקצוות לפני קילוף תבנית המשנה.לבסוף, אנו מסירים את החרוזים מתבנית המשנה של ה-PDMS. לפני ההסרה, אנו מותחים ומכופפים את תבנית המשנה למשך זמן מה כדי להחליש את הקשרים בין החרוזים לבין תבנית המשנה של ה-PDMS. ההסרה בפועל של החרוזים היא פשוטה מאוד וניתן לבצעה באמצעות מגנט גדול.ייצור המיקרו-בארות הקעורות הושלם והמיקרו-בארות מוכנות לתרבית תאים. כדי לבחון האם פלטפורמת ה-PDMS שלנו מתאימה לגידול תאים, ביצענו את הפרוצדורות הבאות. ראשית, השתמשנו במנקב ביופסיה בקוטר 14 מילימטר כדי לחתוך את תת-המגש של ה-PDMS בעל תבנית המיקרו-בארות הקעורות.לאחר עיקור תת-התבנית מ-PDMS, נמקם אותה בתוך פלטה בעלת 24 בארות. לאחר מכן, נצפה את תת-התבנית מ-PDMS כולה בתמיסת pluronic F-127 בריכוז של 4% למשך לילה, כדי למנוע מהתאים להיצמד לפני השטח של המיקרו-בארות. במהלך תהליך הציפוי, יש להסיר בועות אוויר שנלכדו במיקרו-בארות, באמצעות פיפטינג או על ידי שימוש במכשיר ניקוי אולטרסוני.לאחר שווידאנו שלא נותרו בועות אוויר, נזרע מיליליטר אחד של תמיסת מצע תרבית תאים, שתכיל כשני מיליון תאים, על תת-המגש של ה-PDMS. לאחר מכן, נשאב את המצע באמצעות פיפט של 1000 µL כדי להסיר תאים עודפים שלא נלכדו במיקרו-בארים, וכך הכל מוכן להכנסת התאים לאינקובטור. תבנית קמורה בתצורת מיקרו-בארים יוצרה בהצלחה, וחרוזי פלדה מסחריים נלכדו במערך חורים של 30 על 30.החרו지를 הוחזקו היטב ללא גז בין החרוזים לבין החורים התואמים. צורתו של המיקרו-באר הקעורה שיוצרה היא חצית-כדור קעורה בקוטר של 600 מיקרון, בדומה לקוטרו של חרוז הפלדה. חתך רוחב של מיקרו-באר קעורה מראה כי המרחק מהמיקרו-באר השכנה היה מילימטר אחד, בדומה למרחק בין החורים.תאי גזע המופקים מרקמת שומן גודלו במיקרו-בארות קעורות. זרענו שני מיליון תאים על מערך מיקרו-בארות קעורות בקוטר 14 מילימטר. לאחר 24 שעות, התאים הצטברו לספרואידים.הקוטר הממוצע של הספרואידים שנוצרו במערך של מיקרו-בארות היה 185.68 microns. ביום השלישי, התאים הפכו למאגרגים יותר, אך הקוטר הממוצע של הספרואידים ירד ל-147 microns. בעקבות הליך זה, ניתן לייצר 100 מיקרו-בארות כדוריות קעורות בשיטה שלנו, שהיא חסכונית ופשוטה יחסית.

a-paired-bead-magnet-array-for-molding-microwells-with-variable

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הגישה ליתוגרפיה micropunching מפותח כדי ליצור מיקרו submicron דפוסי למעלה, דפנות ומשטחים התחתון של פולימר מצעים. הוא מתגבר על המכשולים של דפוסים מנהלת פולימרים ויצירת דפוסי דפנות. שיטה זו מאפשרת ייצור מהיר של תכונות מרובות ללא כימיה אגרסיבי.

Micropunching ליתוגרפיה לייצור מיקרו submicron דפוסי פולימר על מצעים

bilayers שומנים נתמך וחלקיקי קרום טבעיים הם מערכות נוחים שיכול להתקרב למאפיינים של קרום תא ולהיות משולבות במגוון רחב של אסטרטגיות אנליטיות. כאן אנו מדגימים שיטה להכנת microarrays המורכב של SiO 2 חרוזים נתמכים שומנים מצופים bilayer, שלפוחית ​​פוספוליפידים או חלקיקי קרום טבעיים.

היווצרות של microarrays Biomembrane עם שיטת הרכבה מבוססת מגב

בעבודה זו, מודל ניסיוני חדשני שבו תרביות עצביות תלת-ממדיות מחוברות למערכי מיקרו-אלקטרודות מישוריים (MEAs) presented. 3D רשתות נבנות על ידי זריעת נוירונים בפיגום המורכב ממיקרו-חרוזי זכוכית שעליהם גדלים נוירונים ויוצרים מבנים תלת-ממדיים המחוברים זה לזה.

התממשקות תרבויות 3D הנדסה עצבית למערכי מיקרו-אלקטרודה: חדשני<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם ניסיוני

מתוארים פרוטוקולים לכימות אינטראקציות מכניות בין תאים דבקים ומצעים מיקרו-מובנים. אינטראקציות אלו קשורות קשר הדוק להתנהגויות תאים חיוניות כולל נדידה, התפשטות, התמיינות ואפופטוזיס. הפרוטוקולים מציגים תוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח הנקראת MechProfiler, המאפשרת קביעת הכוחות המעורבים עבור כל מיקרו-פוסט.

Mechano-פרופיל קל ומדויק על מערכי Micropost

מוצגים נהלים המשמשים ליצירת חרוזי פולידימתילסילוקסן קעורים מיקרו-מובנים. מודגשות במיוחד ההשפעות של ריכוז וזהות האלקטרוליטים בתוך הפאזה המימית.

ייצור Microbubble של חרוזים PDMS קעור-נקבוביות

אנו מציעים טכניקת הרכבה עצמית פשוטה של ננו-חלקיקים קולואידיים של סיליקה כדי ליצור צומת ננו-פלואידית בין שני מיקרו-ערוצים בפולידימתילסילוקסן (PDMS). באמצעות טכניקה זו, קרום חרוז ננו-נקבובי בגודל נקבוביות של עד ~45 ננומטר נבנה בתוך מיקרו-ערוץ והוחל על ריכוז מוקדם אלקטרוקינטי של דגימות DNA.

יצירת צומת תת-50 ננומטר ננו-נוזלי ב PDMS Microfluidic שבב באמצעות תהליך ההרכבה העצמית של חלקיקים קולואיד

Microfluidics הוא כלי רב עוצמה לפיתוח בדיקות אבחון. עם זאת, ציוד וחומרים יקרים, כמו גם טכניקות ייצור וטיפול מייגע, נדרשים לעתים קרובות. כאן אנו מפרטים את פרוטוקול הייצור של התקן מיקרופלואידי אקרילי עבור אימונו-אנליזות מגנטיות מבוססות מיקרו וננו-חלקיקים בסביבה זולה ופשוטה לשימוש.

מיקרומילינג בקרה נומרי ממוחשב של מכשיר אקרילי מיקרופלואידי עם הגבלה מדורגת עבור בדיקות חיסוניות מבוססות ננו-חלקיקים מגנטיים

פרוטוקול זה מתאר שיטת דפוס תאים ללא דיו, ללא תוויות, שאינה תלויה במצע ובעלת תפוקה גבוהה המבוססת על אפקט ארכימדס מגנטי.

תבניות תאים באמצעות אסטרטגיית ארכימדס מגנטי

אנו מציגים פלטפורמת בדיקת קשיחות דינמית והפיכה המיוצרת באמצעות אלסטומר סיליקון רך במיוחד (פולידימתילסילוקסן, PDMS) עם חלקיקי ברזל משובצים. בדיקה חדשנית זו מתאימה לחקר שינויים פיזיים תלויי זמן בפנוטיפים של תאים, כולל הנחיית מגע. כאן, אנו מודדים יישור קרדיומיוציטים של חולדות יילודים עם התקשות מטריצה באמצעות מגנטיות.

אלסטומרים מגנטו-ריאולוגיים מיקרו-דפוסיים להנעת שינויים ביישור קרדיומיוציטים

מאמר זה מציג שיטה ייחודית לייצור תבניות מאסטר עם חור אוורור למניעת לכידת אוויר במהלך יציקת פולימר צמיגי, ומאפשרת ייצור מחטי ג'לטין עם קצה חד. על ידי הפחתת נפח היציקה של ג'לטין בעל צמיגות גבוהה, ניתן היה גם לייצר מחטים מיקרו-פירמידליות חלולות עם דפנות דקות.

ייצור תבנית ראשית למחטים מיקרו עם חור אוורור בגודל מיקרון

למד לייצר מיקרובארים קעורים ב-PDMS באמצעות כוח מגנטי וחרוזי פלדה לתרביות תלת-ממדיות. שיטה זו מאפשרת יצירת מאות מיקרובארים בשטח קטן ללא ציוד מורכב.

חרוז לזווג עם מגנט במערך צורניים Microwells עם משתנה גיאומטריות קעורה

גלה סרטונים נוספים