Name: גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט Staphylococcus aureus (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: למדו כיצד לחלץ מטבוליטים מ-Staphylococcus aureus ולנתח אותם באמצעות כרומטוגרפיית נוזלים וספקטרומטריית מסה. שיטה זו מאפשרת לחקור את הקשר בין מטבוליזם לפתוגניות בזמן זיהום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מסלול NIH כדי פרס העצמאות (להעניק GM 099,893) וקרנות ההפעלה הסגל כדי SRB, כמו גם גרנט פרויקט מחקר (להעניק GM 042,219). הממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף הנתונים לפרשנות, או ההחלטה להגיש את העבודה עבור פרסום.

1. הכנת תמיסות בופר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פוספט שנאגר מלוח (PBS; pH 7.4) על ידי דילול פתרון מניות של 10x PBS לריכוז סופי של 1X עם ultrapure (מזוקק ללא יונים) מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מרווה ידי שילוב 2 מ&quot;ל של אצטוניטריל, 2 מ&quot;ל של מתנול, 1 מ&quot;ל של ultrapure H 2 O, ו 19 μL (0.1 ריכוז סופי מ&quot;מ) של חומצה פורמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן LC-MS ממס A על ידי הוספת חומצה פורמית ([v / v] 0.2% ריכוז סופי) כדי מי ultrapure. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן B ממס LC-MS-ידי הוספת חומצה פורמית ([v / v] 0.2% ריכוז סופי) כדי acetonitrile. הערה: כל הפתרונות צריכים להיות מוכנים באמצעות ריאגנטים הגבוהה ביותר טוהר זמין (כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים בדרך כלל כיתה). פתרונות יש להכין טרי לפני כל ניסוי ומאוחסן על קרח לפני השימוש. </li></ol> 2. הקמת צמיחת aureus היציבה S. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak ס aureuזנים של בעלי עניין עבור בידוד על אגר סויה tryptic (TSA) ממלאי גליצרול קפוא. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 16-24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 4 מ&quot;ל של מרק סויה tryptic (TSB) או אחר בינוני מתאים צינורות הדגירה זכוכית סטרילית עם מושבות אחת של כל זן. דגירה נוטה (~ 70 ° זווית) עם סיבוב ב 60 סיבובים לדקה (סל&quot;ד) בשעה 37 מעלות צלזיוס למשך 16-20 שעות. הערה: תרבויות לילה נוטים הדרגתיים חמצן בעת ​​שימוש בשיטות סטנדרטיות, כולל אלה המתוארים בשלב 2.2, אשר משפיעים הפיזיולוגיה הסלולר. לפיכך, אנו מעסיקים אסטרטגית גב דילול מרובה כדי להבטיח מצב יציב ביולוגי (ראה צעדים 2.4-3.2, להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ספקטרופוטומטר למדידת צפיפות אופטית של תרבויות משלב 2.2 ב 600 ננומטר (OD 600). השתמש בינוני סטרילי כהפניה אופטית (ריק). לדלל תאים אלה כדי OD 600 של 0.05 ב 50 מ&quot;ל של מדיום TSB סטרילי (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס) ב נפרדת, 250 בקבוקונים מ&quot;ל DeLong. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Incuבייט התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עם רועד ב 280 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל 30 דק &#39;, לקחת OD 600 מדידות; כמו הצפיפות האופטית להגדיל, זה עשוי להיות נחוץ כדי לדלל את התרבויות עם TSB, כך שהם יישארו בטווח הספיג ליניארי של ספקטרופוטומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תרבויות משלב 2.5 להשיג OD 600 של ~ 0.8-1.0, תת אותם לתוך 50 מ&quot;ל של 37 ° C TSB ל OD 600 של 0.01-0.05 וחזור על שלבים 2.4 ו 2.5. </li></ol> 3. הגדרת אוסף דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מצע הקרח יבש כתוש בתוך כלי מתאים (למשל, צלחת זכוכית, דלי קרח, או מצנן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו הצפיפות האופטית של התרבויות מתקרבת לנקודת הקציר הרצויה, להוסיף 1 מיליליטר של מרווית פתרון בצלחת 35 מ&quot;מ מטופל פטרי טרום מגניב על קרח יבש ≥5 דקות. הערה: &quot;נקודת הקציר הרצויה&quot; תשתנה בהתאם מטרות ניסוי. לדוגמא, אם אחד היה לבחון מטרetabolites במהלך צמיחה אירובית, אינדיקטורים מרכזיים של המדינה הזאת כוללים הפרשה תצטט מחדש התבוללות של אצטט במהלך שלב הצמיחה שלאחר מעריכי 32, 33. באופן כללי, בשלב זה צריך להיות בתוך במת צמיחה ספציפית (למשל, שלב מעריכים). הערכים הספציפיים OD 600 הקשורים בשלב זה עשויים להשתנות בין זני חיידקים שונים בתקשורת צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים frit מסנן נירוסטה (טרום צונן כדי -20 ° C) בתוך פקק גומי ולמקם אותו על גבי תֶרמוֹס מחובר משאבת ואקום או ואקום הבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את הוואקום ולמקם קרום אסתר תאית מעורב (0.22 מיקרומטר גודל נקבובי) על גבי. הערה: חשוב מאוד להשתמש במסנן בקוטר שווה לזה של frit ולמרכז זה מסנן כראוי כדי להבטיח כי המדגם הוא נמשך דרך המסנן ולא מעבר לקצה. הרטבת הממברנה עם קר כקרח, סטרילי H 2 O עשויה לעזורעם מיצוב הממברנה. </li></ol> 4. לדוגמא קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה OD של 600 ~ 0.4-0.5, להשתמש פיפטה סרולוגיות להסיר 13 מ&quot;ל של תרבות מהצפחת כדי להחיל את המדגם כדי המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדגם כולו סוננה, מיד לשטוף את המסנן עם ≥5 מ&quot;ל של PBS קר כקרח לשטוף מטבוליטים הקשורים בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את הוואקום ולהשתמש פינצטה סטרילית כדי להסיר את המסנן מן frit. הפוך את המסנן (תא בצד למטה) לתוך התמיסה להרוות טרום צוננת. הערה: חשוב לבצע את הפעולות הנ&quot;ל במהירות (כלומר, בתוך שניות) וברגע הנוזל הוסר כדי להבטיח את המרווה המהירה של התאים, עצר פעילות מטבולית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המסננת בתמיסה להרוות על קרח יבש ≥20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פינצטה סטרילי, להפוך את המסנן (עד התא בצד) בצלחת פטרי ולהשתמש micropipette כדי לשטוף את התאים מעל tהוא הממברנה לתוך הפתרון להרוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-השעה את התאים בתמיסה להרוות ולאחר מכן להעביר את השעית תא צינור מיליליטר 2 סטרילי השפעה עמיד המכיל ~ 100 μL של חרוזי סיליקה 0.1 מ&quot;מ. בחנות זו על קרח יבש או -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 5. הפקת המטבוליט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות להפשיר על קרח רטוב לשבש את תאי homogenizer עם ארבע התפרצויות 30 שניות על 6000 סל&quot;ד, עם 2 תקופות צינון דקות על קרח יבש בין מחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר את lysates עבור 15 דקות ב microcentrifuge טרום צונן, בקירור במהירות המרבית (כלומר, 18,213 XG ב C ° ≤4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant לצינור microcentrifuge נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש micropipette, להעביר חלק קטן מהמדגם צינור microcentrifuge עבור כימות של התוכן פפטיד שיורית צעד 6; לאחסן את השארית ב -80 מעלות צלזיוס. הערה: היקף מדגם שמורות משתנה, תלוי assay BCA בשימוש בשלב 6.1. זֶההמדגם צריך להיות מאוחסן על קרח רטוב לניתוח מיידי או קפוא ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> Assay 6. Bicinchoninic חומצה (BCA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע assay BCA כפי מומלץ על ידי יצרן הערכה, באמצעות דגימות משלב 5.4 כדי לקבוע את ריכוז הפפטיד שיורי עבור כל דגימה. </li></ol> 7. LC-MS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 75 μL של ס תמצית aureus עם 75 μL של LC-MS הממס B, מוכן בשלב 1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס לערבב ספין על 13,000 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 100 μL של supernatant לתוך כרומטוגרפיה נוזלית (LC) הבקבוקון מכסה אותו. ודא כי אין בועות אוויר לכודות במדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מבחנות LC על autosampler LC-MS ולערוך את רשימת ריצה בתוכנה &quot;עורך Worklist מנותק.&quot; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את &quot;שם לדוגמא&quot; (למשל, wild-type-1), &quot;עמדה לדוגמא&quot; (למשל, P1-A1), &quot;שיטה&quot; (למשל, נמליםCID-שלילי שיטה), ו &quot;קובץ נתונים&quot; (למשל, עמודות מסוג פרא-1). לחץ על כפתור &quot;שמור Worklist&quot; כפתור. פתח את תוכנת &quot;Workstation קליטת נתונים ספקטרומטריית מסה&quot; והזן את worklist שנשמר בעבר. לחץ על כפתור &quot;Run Worklist התחל&quot; כדי להתחיל את המדידה LC-MS רציפה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הדגימות על עמודה, לקשר את עמודת זמן הטיסה (TOF) ספקטרומטר, ומשלב ספקטרומטר TOF עם מערכת LC. השתמש שיפוע נייד פאזי כדלקמן: 0-2 דק &#39;, 85% B ממס; 3-5 דק &#39;, 80% B ממס; 6-7 דק &#39;, 75% B ממס; 8-9 דק &#39;, 70% B ממס; 10-11.1 דקות, 50% B ממס; 11.1-14 דקות, 20% B ממס; ו 14.1-24 דקות, 5% B ממס; להסתיים תקופת 10 דקות מחדש איזון ב B 85% ממס בשיעור זרימת -1 0.4 מ&quot;ל min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות משאבת isocratic, להשרות פתרון המוני הפניה עם הריצה כדי לאפשר כיול ציר סימולטני המוני. הערה: זה צעדמבוסס על במדריך TOF ספקטרומטר סטנדרטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתערובת של חומצה אצטית D4 ו- hexakis (1H, 1H, 3H-tetrafluoropropoxy) phosphazine כפתרון המונית הפניה לביצוע כיול בזמן אמת. השתמש במשאבה isocratic עם קצב הזרימה של דק 2.5 מ&quot;ל -1 עבור עירוי. </li></ol></li></ol> 8. תיקון אצווה של רוזני יון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין בכל אחת מהדוגמאות כדי לשמש דוגמה התייחסות תיקון אצווה (למשל, wild-type, לשכפל 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הסכום של ספירת יון לכל מטבוליטים בתוך מדגם התייחסות. חזור על חישוב זה עבור כל הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלק את ספירת היון הכוללת של כל דגימה על ידי ספירת היון הכוללת של מדגם ההתייחסות ליצור יחס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלק את ספירת היון לכל המטבוליט בתוך מדגם ידי היחס המדגם / ההפניה להשיג ספירת יון תצווה-מתוקן לכל המטבוליט. </li></ol> 9. פפטיד נורמליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Divide ערכי ספירת יון אצווה תיקן עבור כל דגימה שהושגו בשלב 8 על ידי ריכוז הפפטיד נקבע עם assay BCA בשלב 6 להניב ערך מנורמל עבור כל המטבוליט. הערה: ספירת יון תיקן המנורמלת, יצווה-תצווה עבור כל המטבוליט שהושג בשלב 9.1 ניתן להשוות באופן ישיר בין זנים ו נתון ניתוח סטטיסטי (למשל, מאן-ויטני U -test). לחלופין, מטבוליט הידוע להיות ללא שינוי או על ידי הטיפול או רקע גנטי עשויים לשמש מנרמל כדי לזהות שינויים עקב המטבוליט פירוק. הכללת כמות ידועה של L-norvaline או חומצה gluraric במאגר החילוץ יכול לשמש כדי לתקן הפסד במהלך מדגם עיבוד 34. </li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כל מטבוליטים המולקולות קטנות מחוברים זו לזו באמצעות מקורותיה המשותפים שלהם מסלולי מטבוליים מרכזיים. במהלך גידול מעריכי, תאי חיידקיים הם על מצב יציב ביולוגי מטבוליות, מתן תמונת מצב של המצב הפיזיולוגי בתנאים ספציפיים. Cody מפקחת הסתפקות מזין ידי היענות ILV ו GTP. כפי ILV ושחרר ברכות GTP, פעילות Cody מצטמצמת סיכוי בהדרגה, התאמת ביטוי גני היעד שלה להסתגל הגדלת מזין דלדול 30. זן Cody לקוי מתנהג כאילו ILV ו GTP מתרוקנים מהסביבה אלא רק מציג הבדל מאוד מתון יחסית הת...

חיידקים פתוגנים חייבים להתמודד עם אתגרים רבים בתוך הסביבה המארחת. בנוסף התקפה ישירה על ידי תאי מערכת חיסון, המארח גם sequesters מזינים חיוניים להישרדות שכפול חיידקים, יצירת חסינויות תזונתיות 1, 2. כדי לשרוד בסביבה העוינת אלה, חיידקים פתוגנים לפרוס גורמים ארסיים. חלק מגורמים אלה מאפשרים החיידק להתחמק התגובה החיסונית; גורמים אחרים כוללים מופרש אנזימי עיכול, כגון hyaluronidase, thermonuclease, וטריפז, אשר עשוי לאפשר לחיידקים לחדש מזינים חסרים על ידי צריכת מרכיבים שמקורם ברקמה 3, 4, 5. ואכן, חיידקים התפתחו מערכות רגולטוריות שקושרים את המצב הפיזיולוגי של התא לייצור של גורמים בחיידק הגורם 6, 7, <s<html> עד class = &quot;Xref&quot;&gt; 8, 9, 10. גוף גדל והולך של ראיות מצביע Cody כרגולטור קריטי המקשר חילוף חומרים ואת ארסיות. למרות גילו לראשונה subtilis Bacillus בתור מדכא של permease dipeptide (DPP) גן 11, קודי הוא ידוע כיום להיות מיוצר על ידי כמעט כל החיידקים G + C נמוך גראם חיובי 12, 13 ו מסדיר עשרות גנים המעורבים פחמן חנקן המטבוליזם 14, 15, 16, 17, 18, 19. במינים פתוגניים, Cody שולט גם הביטוי של כמה גנים הארסיים החשובים 20, 21,. EF &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 קודי מופעל בתור חלבון קושר DNA על ידי שתי כיתות של הליגנדים: חומצות אמינו מסועפות שרשרת (BCAAs; ואיזולויסין, לאוצין, ו- וואלין [ILV]) ו GTP . כאשר מזין אלה נמצאים בשפע, Cody מדחיק (או במקרים מסוימים, מגרה) תעתיק. כמו חומרים מזינים אלו הופכים מוגבלים, פעילות Cody מצטמצמת בהדרגה, ומביא לתגובת תעתיק מדורגת כי חישוב מחדש של מסלולים מבשרים דרך מסלולי מטבוליים שונים הקשורים למטבוליזם מרכזי 28, 29, 30. כרומטוגרפיה נוזלית טנדם מצמידים ספקטרומטריית מסה (LC-MS) הינה טכניקה שיכולה לזהות במדויק ולכמת מטבוליטים תאיים-מולקולה קטנה 31. כאשר יחד עם transcניתוח riptome (למשל, RNA-seq), עבודה אנליטית זה יכול לספק תובנות לגבי השינויים הפיסיולוגיים המתרחשים בתגובה לעקה סביבתית או תזונתית. כאן, אנו מציגים שיטה להפקת המטבוליט מתאי סטפילוקוקוס וניתוח שלאחר מכן באמצעות LC-MS. גישה זו נעשה שימוש כדי להדגים את ההשפעות pleiotropic של Cody על הפיזיולוגיה aureus S..

<table><tbody><tr><td><חזק>חומר/ציודa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DeLong Culture Flask (250 מ"ל)</td><td>Belco</td><td>2510-00250</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק זרוע צד, 500 מ"ל</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td></td></tr><tr><td>פקק גומי 3 חורים, #7</td><td>Fisher</td><td>14-131E</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מסנן נירוסטה/פריט</td><td>VWR</td><td>89428-936</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי, 35 מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>430588</td><td>לא מטופל בתרבית רקמות</td></tr><tr><td>קרום אסטר תאית מעורבת, 0.22 &mu; m גודל נקבוביות</td><td>Millipore</td><td>GSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>צינורות עמידים בפני פגיעות, 2 מ"ל</td><td>USA Scientific</td><td>1420-9600</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי סיליקה, 0.1 מ"מ</td><td>Biospec Products Inc</td><td>11079101Z</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 הומוגנייזר</td><td>Bertin Instruments</td><td>EQ03119-200-RD000.0</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון Micro BCA</td><td>פירס (תרמו מדעי)</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Cogent Diamond hydride סוג C עמודה</td><td>Agilent</td><td>70000-15P-2</td><td></td></tr><tr><td>זמן טיסה מדויק מסה (TOF) LC-MS, משאבת Quat Agilent G6230B</td><td></td><td></td><td></td>מסדרת 6200</tr><tr><td>, סדרת 1290</td><td>Agilent</td><td>G4204A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>משאבת פח, סדרה 1290</td><td>Agilent</td><td>G4220A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>כונן שסתומים, סדרת 1290</td><td>Agilent</td><td>G1107A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>משאבה איזוקרטית, סדרת 1290</td><td>Agilent</td><td>G1310B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TCC, סדרת 1290</td><td>Agilent</td><td>G1316C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סמפלר, סדרת 1290</td><td>Agilent</td><td>G4226A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תרמוסטט, סדרת 1290</td><td>Agilent</td><td>G1330B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><חזק>כימי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מרק סויה טריפטי</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>אגר דיפקו, בקטון מגורען</td><td>דיקינסון</td><td>214530</td><td>חומר מוצק מכיל 1.5% [w/v] אגר</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (pH 7.4) 10x</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td>מדלל טרי עד פי 1 עם מים טהורים במיוחד</td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A955-500</td><td>אופטימה LC-MS</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A456-500</td><td>אופטימה LC-MS;</td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td> רעילה <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>94318</td><td>לספקטרומטריית מסה, 98%</td></tr><tr><td><חזק>תוכנה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassHunter</td><td>Agilent</td><td>G3337AA</td><td></td></tr> <tr><td>זן חיידקי חזק><חזק</ חזק></td><td><חזק>מין</חזק><</td><td>חזק>זן</חזק></td><td><חזק>גנוטיפ</חזק></td></tr><tr><td>SRB 337</td><td>סטפילוקוקוס זהוב</td><td>USA200 MSSA UAMS-1</td><td>סוג בר</td></tr><tr><td>SRB 372</td><td>סטפילוקוקוס זהוב</td><td>USA200 MSSA UAMS-1</td><td>&דלתא; codY::erm</td></tr><tr><td colspan="4">aכימיקלים וחומרים המפורטים הם ספציפיים לשיטה המתוארת ואינם כוללים כימיקלים או אספקה סטנדרטיים למעבדה.</td></tr></tbody></table>

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em&gt; staphylococcus aureus</em

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

במאמץ לסכל חיידקים פתוגנים, מארחים קרובים להגביל את הזמינות של חומרים מזינים באתר של זיהום. הגבלה זו יכולה לשנות את שכיחותם של מטבוליטים מפתח אשר גורם רגולטוריים להגיב, התאמת חילוף חומרים תאיים. בשנים האחרונות, מספר החלבונים ו- RNA צמח כמו רגולטורים חשובים של ביטוי גנים ארסיים. לדוגמה, החלבון Cody מגיב רמות של חומצות אמינו מסועפות שרשרת ו GTP ו נשמרת נרחב חיידקים G + C גראם חיובי נמוך. כרגולטור עולמי Staphylococcus aureus, Cody שולט הביטוי של עשרות ארסיות וגני מטבולית. אנו משערים כי S. aureus משתמשת cody, בין השאר, כדי לשנות מצב מטבולי שלה בניסיון להסתגל לתנאים מגבילים-מזין נתקלו פוטנציאלי בסביבה המארח. כתב יד זה מתאר שיטה לחילוץ וניתוח מטבוליטים מ S. aureus באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם מפרט מוניתtrometry, פרוטוקול אשר פותח על מנת לבחון השערה זו. השיטה גם מדגישה מומלצת שיבטיחו הקפדת שחזור, כגון שמירה על מצב יציב ביולוגי אוורור קבוע ללא שימוש בתרבויות chemostat רציפות. ביחס aureus USA200 ס רגיש ל- methicillin לבודד UAMS-1 זן הורי, מוטצית Cody isogenic הציגה עליות משמעותיות חומצות אמינו הנגזרות aspartate (למשל, תראונין ואיזולויסין) וירידות קודמיהם (למשל, אספרטט ו- O -acetylhomoserine ). ממצאים אלה תואמים היטב עם נתוני תעתיק שהושגו עם ניתוח RNA-seq: גנים במסלולים אלה היו למעלה מוסדרים בין 10 ו 800 של פי מוטצית Cody null. צימוד ניתוחים הגלובליים של transcriptome ואת metabolome יכול לחשוף כמה חיידקים לשנות את חילוף החומרים שלהם כאשר הוא מתמודד עם לחץ סביבתי או תזונתי, המספק תובנה פוטנציאל לתוך להתעמלותשינויים iological הקשורים דלדול מזין חוו במהלך זיהום. תגליות אלה עשויות לסלול את הדרך לפיתוח תרופות נוגדת זיהום ואת הרומן.

ניתחנו בריכות המטבוליט תאיים ב S. aureus במהלך הצמיחה במבחנה במדיום עשיר, מורכב. כהוכחה עקרוני, השווינו פרופילים המטבוליט בין אוסטאומיאליטיס aureus methicillin-רגישים ס לבודד UAMS-1 (wild-type [WT]) וכן זן isogenic חסר הרגולטור תעתיק העולמי Cody (Δ Cody) 26. מצב יציב, תרבויות מעריכים של זני WT והקודים הוקמו במדיום TSB, כמתואר בשלב 2 של הפרוטוקול. התנהגות הצמיחה של wild-ty...

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת מטבוליטים מ סטפילוקוקוס והניתוח הבא שלהם באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ו ספקטרומטריית מסה.

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

המטרה הכללית של שיטת דגימה זו היא לאסוף דגימות מטבוליטים מ-Staphylococcus aureus לצורך כימות מאוחר יותר באמצעות Tandem Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. המעבדה שלנו מעוניינת לחקור את נקודת המפגש בין מטבוליזם לפתוגנזה בחיידקים הרלוונטיים לבריאות האדם. כzeit, אנו משתמשים בפתוגן האופורטוניסטי האנושי Staphylococcus aureus כאורגניזם מודל.שאלה מרכזית אחת שאנו שואפים להשיב עליה היא כיצד חיידקים מתאימים את הפיזיולוגיה והפתוגניות שלהם כאשר הם עומדים בפני מחסור בחומרי הזנה במהלך זיהום במארח. טכניקה זו היא בעלת יתרון מכיוון שהיא מספקת תמונת מצב של התפלגות מטבוליטים ספציפיים בין המסלולים המטבוליים הרבים בתאים הצומחים באופן פעיל, עם הפרעה מינימלית למצבם הפיזיולוגי. כדי להתחיל, בצעו מריחה של זני ה-S.aureus הרלוונטיים לצורך בידוד על מצע tryptic soy agar מתוך מלאי הגליצרול הקפוא.דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 16-24 שעות. למחרת, חסנו 4 mL של מצע צמיחה tryptic soy broth, או TSB, במבחנות דגירה מזכוכית סטרילית באמצעות מושבות בודדות מכל זן. דגרו את התרביות, במצב נטוי עם סיבוב, בטמפרטורה של 37 °C למשך 16-20 שעות.השתמשו בספקטרופוטומטר למדידת הצפיפות האופטית של התרביות ב-600 ננומטר, המסומנת כ-OD600. בהתבסס על מדידה זו, מהלו את התאים ל-OD600 של 0.05 ב-50 mLs של מצע TSB סטרילי, בבקבוקי Delong בנפח 250 mL. דגרו את התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במקלחת עם ניעור במהירות של 280 rpm.יש לבצע מדידות OD600 בכל 30 דקות. ככל שהצפיפות האופטית עולה, ייתכן שיהיה צורך לדלל את התרביות ב-TSB כדי שיישארו בטווח הבליעה הליניארי של הספקטרופוטומטר. בזמן גדילת התאים, יש להכין טריים את תמיסות בופר המיצוי תוך שימוש בריאגנטים בעלי רמת הטוהר הגבוהה ביותר הזמינה, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.כאשר התרביות מגיעות ל-OD600 בין 0.8 ל-1.0, יש להעביר אותן לתתי-תרביות ב-50 mLs של TSB טרי שחומם מראש עד ל-OD600 של 0.01 עד 0.05, ולחזור על שלבי הדגירה והמדידה. הכינו מצע של קרח יבש גרוס בכלי מתאים, כגון צלחת זכוכית, דלי קרח או קירור. כאשר הצפיפויות האופטיות של התרביות מתקרבות לנקודת הקציר הרצויה, הוסיפו 1 mL של תמיסת כיבוי (quenching solution) לצלוחית פטרי לא מטופלת בקוטר 35 mm, וקררו מראש על קרח יבש למשך 5 דקות לפחות.לצורך העניין, נקודת הקציר הרצויה היא צפיפות אופטית של כ-0.4 עד 0.5. עם זאת, ניתן לשנות זאת בהתאם למטרות הניסוי. בשלב הבא, מקמו פילטר מנירוס (frit) מפלדת אל חלודה בתוך פקק גומי, והניחו אותו מעל בקבוק ואקום המחובר למערכת ואקום מרכזית או למשאבת ואקום.הפעילו את הוואקום, והניחו ממברנת cellulose ester מעורבת מעל. השתמשו במסנן בעל קוטר זהה לזה של הפריט (frit) כדי להבטיח שכל התאים נאספו. קריטי לאסוף את התאים ולהפסיק את הפעילות המטבולית במהירות האפשרית, וזאת כדי לספק תמונת מצב (snapshot) של השפע המטבולי תחת תנאי נתון.אפילו עיכובים קטנים עלולים להשפיע על הפיזיולוגיה במצב יציב (steady-state) של התאים. כאשר ה-OD600 הוא בין 0.4 ל-0.5, השתמשו בפיפט סרולוגי כדי להוציא 13 mLs של תרבית מהבקבוק. העבירו את הדגימה למסנן באופן מיידי.לאחר סינון כל הדגימה, שטפו מיד את המסנן בכמות של עד 5 mL של PBS קר מאוד כדי להסיר מטבוליטים הקשורים למצע הגידול. לאחר מכן, נתקו את הוואקום והשתמשו בפינצטה סטרילית כדי להסיר את המסנן מהפריט (frit). הפכו את המסנן לתוך תמיסת ה-quench שהוקררה מראש.דגרו את המסנן בתמיסת השבת (quench solution) על קרח יבש למשך 20 דקות לפחות. באמצעות פינצטה סטרילית, הפכו את המסנן בתוך פטריית הפטרי ובסיוע מיקרופיפט שטפו את התאים מהממברנה אל תוך תמיסת ההשבת. השעיקו מחדש את התאים בתמיסת ההשבת, ולאחר מכן העבירו את תסביב התאים לשפופרת סטרילית עמידה להטבה בנפח 2 mL המכילה כ-100 microliters של חרוזי סיליקה בגודל 0.1 mm.יש לאחסן זאת על קרח יבש או בטמפרטורה של 80- degrees Celsius. כדי להתחיל את מיצוי המטבוליטים, יש להפשיר תחילה את הדגימות על קרח רטוב. לאחר מכן, יש לפרק את התאים במערבל הומוגניזציה באמצעות ארבעה פולסים של 30 שניות במהירות של 6000 rpm, כאשר בין המחזורים יש לבצע תקופות קירור של שתי דקות על קרח יבש.השקיעו את הליזאטים למשך 15 דקות במיקרוצנטריפוגה בקירור, בתוך מבחנה מקוררת מראש ובמהירות מרבית. לאחר הצנטריפוגציה, העבירו את העילאי למבחנת מיקרוצנטריפוגה נקייה. בעזרת מיקרופיפטה, העבירו חלק קטן מהמדגם למבחנת מיקרוצנטריפוגה לצורך כימות תכולת הפפטידים הנותרת, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.יש לאחסן את שאר הדגימה ב-80 degrees Celsius. לעיון בפרוטוקול הטקסט לצורך ניתוח המטבוליטים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסות. המוטנט null של CodY שימש לבדיקת דלדול של חומצות אמינו בעלות שרשרת מסועפת, שכן חלבון ה-CodY מווסת את הביטוי של עשרות גנים בתגובה לירידה בריכוזם של רכיבים תזונתיים אלו.למוטציה ב-codY השפעה מועטה על קצב הצמיחה של תאי S.aureus. הירידה בצפיפות האופטית בנקודת הזמן של 3 שעות מעידה על שלב הדילול החוזר, אשר מגדיל את מספר הכפילויות של התאים לפני הקצירה, ומדלל מולקולות שונות שנצברו במהלך הצמיחה במהלך הלילה. ניתוח רצף RNA של התמלילים (transcriptomes) של שני הזנים מראה שינויים משמעותיים בביטוי של גנים המעורבים בסינתזה של משפחת חומצות האמינו אספרטט.כאן, המספרים שמתחת לשמות הגנים מציינים את שינוי המכפלה (fold change) בביטוי במוטציה שבה codY אינו קיים (null mutant), בהשוואה לזן הבר (wild type). לאחר כימות של המטבוליטים המופקים באמצעות LC-MS, הושוו השכיחויות בין שני הזנים. בהתמקדות בכמה תרכובות הקשורות למשפחת חומצות האמינו של אספרטט, נראה כי השכיחויות של חומרי מוצא, כגון aspartate ו-O-acetylhomoserine, פחיתו במוטציה של codY.לעומת זאת, תוצרי קצה כגון threonine ו-isoleucine עולים בריכוזם. כאן, הקו המקווקו מציין את רף השינויים בשכיחות עבור ניסוי זה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לאסוף מטבוליטים מ-Staphylococcus aureus לצורך כימות באמצעות liquid chromatography mass spectrometry.פרוטוקול זה מתאים, עם התאמות, גם לאסוף מטבוליטים ממינים חיידקיים אחרים. מכיוון שחיידקים מגיבים לסביבות דינמיות, חשוב לבצע את שלבי הסינון והשטיפה במהירות כדי למזער שינויים פיזיולוגיים פוטנציאליים המושרים על ידי הדגימה. ניתן למזער שינויים אלו גם על ידי שמירת הפריט (frit) וה-PBS קרים במהלך הדגימה.

a-tandem-liquid-chromatographymass-spectrometry-based-approach-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

תרכובות לכידת הם מולקולות קטנות trifunctional כדי להפחית את המורכבות של proteome על ידי תפקודית אינטראקציה הפיך מולקולות חלבון קטן ואחריו crosslinking-צילום טיהור. כאן אנו משתמשים מתחם לכידת...

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

מקור: סמואלס, ד. ג'יי. ואחרים. גישה מבוססת כרומטוגרפיה נוזלית טנדם–ספקטרומטריית מסה לניתוח מטבוליטים של סטפילוקוקוס אוראוס. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית–ספקטרומטריית מסה לזיהוי וכמת מטבוליטים תוך-תאיים מ-S. aureus. הוא מפרט את השלבים המעורבים בהפקת מטבוליטים, נרמול פפטידים, כרומטוגרפיה נוזלית וניתוח ספקטרומטרי מסה.

גישה מבוססת כרומטוגרפיה נוזלית–ספקטרומטריית מסה לניתוח מטבוליטים מ-S. aureus

פרופיל מטבוליט לא ממוקד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (UPLC-MS) היא טכניקה רבת עוצמה לחקירת חילוף החומרים.  מאמר זה מתאר זרימת עבודה טיפוסית המשמשת לפרופיל מטבוליט לא ממוקד של סרום, כולל ארגון והכנת דגימות, רכישת נתונים, ניתוח נתונים, בקרת איכות וזיהוי מטבוליטים.

בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS)

לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS) מצמידים את תוכנת ניתוח ההפרש.

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

השליח השני c-di-GMP הנפוץ בכל מקום שולט בגדילה ובהתנהגות של חיידקים רבים. פיתחנו טכנולוגיה חדשה המבוססת על ספקטרומטריית מסה של תרכובת לכידה לזיהוי ואפיון ביוכימי של חלבונים קושרים c-di-GMP כמעט בכל מין חיידקים.

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה דו-מושביים כדי לזהות ולכמת ליפידים סלולריים עיקריים ב סכביסים cerevisiae ס. השיטה המתוארת להערכה כמותית של שיעורי השומנים העיקריים בתוך תא שמרים הוא רב-תכליתי, חסון ורגיש.

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

פרוטוקול זה מכסה ניתוח מפורט של הרכב פפטידוגליקן באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם מיצוי תכונות מתקדם ותוכנת ניתוח ביואינפורמטיקה.

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי וכמות של סוגים עיקריים של מטבוליטים מסיסים במים ב cerevisiae Saccharomyces שמרים. השיטה המתוארת היא רב-תכליתית, חזקה ורגישה. היא מאפשרת הפרדה בין איסומרים מבניים וצורות סטריאואיזומריות של מטבוליטים מסיסים במים זה מזה.

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מהיר של חלבונים המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים ברצף גנומי באמצעות ספקטרומטריית מסה יחד MALDI-TOF-TOF וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה עם תוכנה שפותחה בתוך הבית. שבר יונים חלבון Metastable בגלל אפקט חומצה אספרטית וספציפיות זו מנוצל לזיהוי חלבון.

זיהוי חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים ב- Escherichia coli באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה

הפרוטוקולים מתארים שיטות כרומטוגרפיה נוזלית בעלות ביצועים גבוהים בשילוב עם אינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה לחקר תגובות מטבוליות במערכות מורכבות המבוססות על ליסאט ללא תאים.

כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב לאינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה ליצירת פרופיל מטבוליט במערכות ללא תאים מבוססות ליסאט

למדו כיצד לחלץ מטבוליטים מ-Staphylococcus aureus ולנתח אותם באמצעות כרומטוגרפיית נוזלים וספקטרומטריית מסה. שיטה זו מאפשרת לחקור את הקשר בין מטבוליזם לפתוגניות בזמן זיהום.

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט

גלה סרטונים נוספים