גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט

המטרה הכללית של שיטת דגימה זו היא לאסוף דגימות מטבוליטים מ-Staphylococcus aureus לצורך כימות מאוחר יותר באמצעות Tandem Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. המעבדה שלנו מעוניינת לחקור את נקודת המפגש בין מטבוליזם לפתוגנזה בחיידקים הרלוונטיים לבריאות האדם. כzeit, אנו משתמשים בפתוגן האופורטוניסטי האנושי Staphylococcus aureus כאורגניזם מודל.

שאלה מרכזית אחת שאנו שואפים להשיב עליה היא כיצד חיידקים מתאימים את הפיזיולוגיה והפתוגניות שלהם כאשר הם עומדים בפני מחסור בחומרי הזנה במהלך זיהום במארח. טכניקה זו היא בעלת יתרון מכיוון שהיא מספקת תמונת מצב של התפלגות מטבוליטים ספציפיים בין המסלולים המטבוליים הרבים בתאים הצומחים באופן פעיל, עם הפרעה מינימלית למצבם הפיזיולוגי. כדי להתחיל, בצעו מריחה של זני ה-S.aureus הרלוונטיים לצורך בידוד על מצע tryptic soy agar מתוך מלאי הגליצרול הקפוא.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 16-24 שעות. למחרת, חסנו 4 mL של מצע צמיחה tryptic soy broth, או TSB, במבחנות דגירה מזכוכית סטרילית באמצעות מושבות בודדות מכל זן. דגרו את התרביות, במצב נטוי עם סיבוב, בטמפרטורה של 37 °C למשך 16-20 שעות.

השתמשו בספקטרופוטומטר למדידת הצפיפות האופטית של התרביות ב-600 ננומטר, המסומנת כ-OD600. בהתבסס על מדידה זו, מהלו את התאים ל-OD600 של 0.05 ב-50 mLs של מצע TSB סטרילי, בבקבוקי Delong בנפח 250 mL. דגרו את התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במקלחת עם ניעור במהירות של 280 rpm.

יש לבצע מדידות OD600 בכל 30 דקות. ככל שהצפיפות האופטית עולה, ייתכן שיהיה צורך לדלל את התרביות ב-TSB כדי שיישארו בטווח הבליעה הליניארי של הספקטרופוטומטר. בזמן גדילת התאים, יש להכין טריים את תמיסות בופר המיצוי תוך שימוש בריאגנטים בעלי רמת הטוהר הגבוהה ביותר הזמינה, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

כאשר התרביות מגיעות ל-OD600 בין 0.8 ל-1.0, יש להעביר אותן לתתי-תרביות ב-50 mLs של TSB טרי שחומם מראש עד ל-OD600 של 0.01 עד 0.05, ולחזור על שלבי הדגירה והמדידה. הכינו מצע של קרח יבש גרוס בכלי מתאים, כגון צלחת זכוכית, דלי קרח או קירור. כאשר הצפיפויות האופטיות של התרביות מתקרבות לנקודת הקציר הרצויה, הוסיפו 1 mL של תמיסת כיבוי (quenching solution) לצלוחית פטרי לא מטופלת בקוטר 35 mm, וקררו מראש על קרח יבש למשך 5 דקות לפחות.

לצורך העניין, נקודת הקציר הרצויה היא צפיפות אופטית של כ-0.4 עד 0.5. עם זאת, ניתן לשנות זאת בהתאם למטרות הניסוי. בשלב הבא, מקמו פילטר מנירוס (frit) מפלדת אל חלודה בתוך פקק גומי, והניחו אותו מעל בקבוק ואקום המחובר למערכת ואקום מרכזית או למשאבת ואקום.

הפעילו את הוואקום, והניחו ממברנת cellulose ester מעורבת מעל. השתמשו במסנן בעל קוטר זהה לזה של הפריט (frit) כדי להבטיח שכל התאים נאספו. קריטי לאסוף את התאים ולהפסיק את הפעילות המטבולית במהירות האפשרית, וזאת כדי לספק תמונת מצב (snapshot) של השפע המטבולי תחת תנאי נתון.

אפילו עיכובים קטנים עלולים להשפיע על הפיזיולוגיה במצב יציב (steady-state) של התאים. כאשר ה-OD600 הוא בין 0.4 ל-0.5, השתמשו בפיפט סרולוגי כדי להוציא 13 mLs של תרבית מהבקבוק. העבירו את הדגימה למסנן באופן מיידי.

לאחר סינון כל הדגימה, שטפו מיד את המסנן בכמות של עד 5 mL של PBS קר מאוד כדי להסיר מטבוליטים הקשורים למצע הגידול. לאחר מכן, נתקו את הוואקום והשתמשו בפינצטה סטרילית כדי להסיר את המסנן מהפריט (frit). הפכו את המסנן לתוך תמיסת ה-quench שהוקררה מראש.

דגרו את המסנן בתמיסת השבת (quench solution) על קרח יבש למשך 20 דקות לפחות. באמצעות פינצטה סטרילית, הפכו את המסנן בתוך פטריית הפטרי ובסיוע מיקרופיפט שטפו את התאים מהממברנה אל תוך תמיסת ההשבת. השעיקו מחדש את התאים בתמיסת ההשבת, ולאחר מכן העבירו את תסביב התאים לשפופרת סטרילית עמידה להטבה בנפח 2 mL המכילה כ-100 microliters של חרוזי סיליקה בגודל 0.1 mm.

יש לאחסן זאת על קרח יבש או בטמפרטורה של 80- degrees Celsius. כדי להתחיל את מיצוי המטבוליטים, יש להפשיר תחילה את הדגימות על קרח רטוב. לאחר מכן, יש לפרק את התאים במערבל הומוגניזציה באמצעות ארבעה פולסים של 30 שניות במהירות של 6000 rpm, כאשר בין המחזורים יש לבצע תקופות קירור של שתי דקות על קרח יבש.

השקיעו את הליזאטים למשך 15 דקות במיקרוצנטריפוגה בקירור, בתוך מבחנה מקוררת מראש ובמהירות מרבית. לאחר הצנטריפוגציה, העבירו את העילאי למבחנת מיקרוצנטריפוגה נקייה. בעזרת מיקרופיפטה, העבירו חלק קטן מהמדגם למבחנת מיקרוצנטריפוגה לצורך כימות תכולת הפפטידים הנותרת, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

יש לאחסן את שאר הדגימה ב-80 degrees Celsius. לעיון בפרוטוקול הטקסט לצורך ניתוח המטבוליטים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסות. המוטנט null של CodY שימש לבדיקת דלדול של חומצות אמינו בעלות שרשרת מסועפת, שכן חלבון ה-CodY מווסת את הביטוי של עשרות גנים בתגובה לירידה בריכוזם של רכיבים תזונתיים אלו.

למוטציה ב-codY השפעה מועטה על קצב הצמיחה של תאי S.aureus. הירידה בצפיפות האופטית בנקודת הזמן של 3 שעות מעידה על שלב הדילול החוזר, אשר מגדיל את מספר הכפילויות של התאים לפני הקצירה, ומדלל מולקולות שונות שנצברו במהלך הצמיחה במהלך הלילה. ניתוח רצף RNA של התמלילים (transcriptomes) של שני הזנים מראה שינויים משמעותיים בביטוי של גנים המעורבים בסינתזה של משפחת חומצות האמינו אספרטט.

כאן, המספרים שמתחת לשמות הגנים מציינים את שינוי המכפלה (fold change) בביטוי במוטציה שבה codY אינו קיים (null mutant), בהשוואה לזן הבר (wild type). לאחר כימות של המטבוליטים המופקים באמצעות LC-MS, הושוו השכיחויות בין שני הזנים. בהתמקדות בכמה תרכובות הקשורות למשפחת חומצות האמינו של אספרטט, נראה כי השכיחויות של חומרי מוצא, כגון aspartate ו-O-acetylhomoserine, פחיתו במוטציה של codY.

לעומת זאת, תוצרי קצה כגון threonine ו-isoleucine עולים בריכוזם. כאן, הקו המקווקו מציין את רף השינויים בשכיחות עבור ניסוי זה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לאסוף מטבוליטים מ-Staphylococcus aureus לצורך כימות באמצעות liquid chromatography mass spectrometry.

פרוטוקול זה מתאים, עם התאמות, גם לאסוף מטבוליטים ממינים חיידקיים אחרים. מכיוון שחיידקים מגיבים לסביבות דינמיות, חשוב לבצע את שלבי הסינון והשטיפה במהירות כדי למזער שינויים פיזיולוגיים פוטנציאליים המושרים על ידי הדגימה. ניתן למזער שינויים אלו גם על ידי שמירת הפריט (frit) וה-PBS קרים במהלך הדגימה.