5-mc נקודה כתם Assay לכמת את מתילציה DNA רמת Chondrocyte Dedifiationiation במבחנה
17 במאי 2017
אנו מציגים שיטה לכמת מתילציה דנ"א מבוסס על 5-methylcytosine (5-mC) כתם נקודה. קבענו את רמות 5-mC במהלך dedondferentiation chondrocyte. טכניקה פשוטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע במהירות את הפנוטיפ chondrocyte בטיפול ACI.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לקבוע את רמות ה-5-מתילציטוזין במהלך דה-דיפרנציאציה של כונדרוציטים. שיטה זו מראה שיכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בטיפול בפגמים בסחוס מבוסס תאים כגון השתלת כונדרוציטים אוטולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בשיטה אמינה, פשוטה ומהירה לאיתור רמת המתילציה הכללית של ה- DNA כדי להעריך פנוטיפ כונדרוציטים.
ההשלכה של טכנולוגיה זו היא סטנדרטית לחלקנו בהשתלת כונדרוציטים אוטולוגיים מכיוון שמתילציה של DNA במהלך דה-דיפרנציאציה של כונדרוציטים מהווה מכשול מרכזי לטיפול בהשתלת כונדרוציטים אוטולוגיים לפגמים בסחוס. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי רמות מתילציה של DNA בדה-דיפרנציאציה של כונדרוציטים, ניתן ליישם אותה גם במחקרים אחרים של מחלות, כגון דלקת מפרקים ניוונית. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר קראנו את הפרוטוקולים בהפניות של שיטת dot blot.
אנא הראה שהדגמה של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה לנקוב בשם מצבי כתמי נקודות. יש לעבור דנטורציה של DNA גנומי ולאחר מכן לדלל אותו באופן סדרתי. לאחר מכן נתמך על קרום ניילון טעון חיובית.
מי שידגים את הנהלים יהיה ג'אופנג ג'יה, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלנו. רקמות הסחוס המפרקי ששימשו במחקר זה בודדו ממפרקי הברכיים של חולים תורמים לאחר טראומה. בעזרת אזמל סטרילי חותכים את הסחוס לקוביות של מילימטר עד שניים.
לאחר מכן הוסף מיליגרם אחד למיליליטר קולגנאז II ו- DMEM לסחוס הטחון. ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות כדי לעכל את הכונדרוציטים. למחרת, סנן את מתלה התאים שנוצר דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר.
סובב את התאים. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו PBS וסובבו שוב. ספרו את התאים בעזרת המוציטומטר.
וזרע בצפיפות של 20,000 עד 30,000 תאים לסנטימטר בריבוע ו-DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% סטרפטומיצין פניצילין. תרבית בחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. קצור תאים תת-משותפים באמצעות 0.25% טריפסין EDTA.
ולוח מחדש בצפיפות של 6, 600 תאים לסנטימטר בריבוע. מגדלים את הכונדרוציטים בחד-שכבות עד שישה קטעים ומעריכים בקטעים 1, 2, 3, 4 ו-5. כדי להתחיל בהליך זה, אסוף תאים על ידי טריפסיניזציה וצנטריפוגה.
לאחר מכן השעו מחדש תאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזה לכל 10 מיליון תאים על ידי פיפטינג והיפוך מהיר. דגירה למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס. הוסף פרוטאינאז K בריכוז של 160 מיקרוגרם למיליליטר ליזאט תאים והפוך את התערובת במרץ.
דגירה במשך שש שעות בחום של 55 מעלות צלזיוס. הוסף לכל דגימה נפח אחד של פנול רווי Tris pH 7.9 לכלורופורם לאלכוהול איזואמיל. יש לנער את הדגימה ביד ביסודיות למשך כ-20 שניות.
צנטריפוגה את הדגימות בטמפרטורת החדר ב-13,000 פעמים G למשך חמש דקות. הסר את השלב המימי העליון והעביר לצינור טרי. כדי להסיר את הפנול, הוסף נפח שווה של כלורופורם לכל צינור.
יש לנער ביד ולהסתובב. מעבירים את השלב המימי העליון לצינור טרי. הוסף 0.1 נפח דגימה של שלושה נתרן אצטט מולארי pH שמונה ושני נפחים של 100% אתנול.
אחסן את הצינורות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לזרז את ה-DNA הגנומי. למחרת, צנטריפוגה של הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב-16,000 פעמים G כדי לגלול את ה-DNA הגנומי. שוטפים את הדגימות עם 70% אתנול.
וצנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס למשך שתי דקות ב-13,000 פעמים G.הסר את הסופרנטנט בזהירות וייבש את כדור ה-DNA באוויר. השעו מחדש את ה-DNA ב-10 מילי-מולרי טריס pH שמונה 0.1 מילי-מולרי EDTA. התחל הליך זה על ידי דנטורציה של ה-DNA המבודד בנתרן הידרוקסיד 0.1 מולרי למשך 10 דקות ב-95 מעלות צלזיוס.
לנטרל את ה-DNA עם אמוניום אצטט מולארי אחד על קרח. ואז לדלל פי שניים במים מזוקקים כפולים. השלב הקריטי ביותר במבחני כתמי הנקודות הוא איתור הדגימות, וזכרו לעשות זאת לאט ובזהירות.
נסה למזער כל מערך מנוקד לקוטר של שלושה עד ארבעה מילימטרים. בעזרת קצה פיפטה צר, אתר בזהירות שני מיקרוליטרים של ה-DNA הגנומי המדולל הסדרתי על קרום ניילון טעון חיובית במרכז הרשת. כתם את הממברנה בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
לאחר מכן, חסום את אתרי קשירת הנוגדנים הלא ספציפיים על ידי השריית הממברנה ב-5% BSA ב-TBST בצלחת פטרי של 10 סנטימטר למשך שעה בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין. לאחר שעה יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים ב- TBST למשך חמש דקות בכל פעם. דגרו את הממברנה עם נוגדן חד שבטי אנטי-5-מתילציטוזין של עכבר ב-TBST ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
למחרת יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים ב- TBST למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן דגרו עם נוגדן משני, חזרת פרוקסידאז מצומד כבשים אימונוגלובולין G נגד עכברים ב-TBST למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת הממברנה ב- TBST כמו קודם, הוסיפו את מצע האנזים לקרום ודגרו למשך חמש עד 10 דקות.
לבסוף, דמיין את אות הנוגדן המשני באמצעות ערכת כימילומינסנציה בהתאם להוראות היצרן. כונדרוציטים שגודלו בשכבה חד-שכבתית עד למעבר השישי הראו שינויים פנוטיפיים מתקדמים שהפכו לצבוטים מאוד ושטוחים עם מעברים עוקבים. שינוי מורפולוגי זה אופייני לתהליך הדה-דיפרנציאציה של כונדרוציטים.
DNA גנומי בודד מכונדרוציטים לאחר מספר משתנה של מעברים ורמות מתילציה של DNA הוערכו על ידי בדיקת כתם נקודה ספציפי ל-5-מתילציטוזין. לאחר מכן נותחו עוצמות הנקודות על ידי תמונה J.חמש רמות מתילציטוזין מוגברות בהדרגה נצפו עם תת-תרבות ממושכת, מה שמרמז על קשר בין רמות מתילציה מוגברות בדרך כלל לבין דה-דיפרנציאציה של כונדרוציטים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 24 שעות אם היא מבוצעת כראוי.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למקסם את ריכוז ה-DNA הגנומי והטוהר. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו פרופיל עיבוד DNA גנומי כדי לענות על שאלות נוספות כגון כונדרוציטים של דה-דיפרנציאציה במונוקולטורה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום השתלת כונדרוציטים אוטולוגיים להעריך עיבוד DNA של כונדרוציטים ולקבוע את פנוטיפ הכונדרוציטים בטיפול בפגם בסחוס.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בכתם נקודות 5-מתילציטוזין כדי לזהות מנוף עיבוד מנוון כדי להעריך את פנוטיפ הכונדרוציטים. אל תשכח שעבודה עם פנול עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש ללבוש כפפות בזמן ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לכימות מתילציה של DNA באמצעות טכניקת dot blot של 5-methylcytosine (5-mC). המחקר מתמקד בקביעת רמות ה-5-mC במהלך דה-דיפרנציאציה (dedifferentiation) של כונדרוציטים, תהליך המהווה חשיבות מכרעת לטיפול בהשתתלת כונדרוציטים אוטולוגית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- דה-דיפרנציאציה של כונדרוציטים מציבה אתגרים בשיקום סחוס.
- מתילציה של DNA היא גורם מרכזי המשפיע על הפנוטיפ של הכונדרוציטים.
- הבנת המתילציה יכולה לשפר את תוצאות הטיפול בפגמים בסחוס.
- ניתן להחיל שיטה זו גם על מחלות אחרות, כגון אוסטאו-ארתריטיס.
מטרת המחקר
- לכימות רמות 5-mC במהלך דה-דיפרנציאציה של כונדרוציטים.
- לפיתוח שיטה מהימנה להערכת הפנוטיפ של כונדרוציטים.
- למענה על מכשולים בהשתלת כונדרוציטים אוטולוגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקת dot blot עבור 5-methylcytosine (5-mC).
- הערכה של רמות מתילציה של DNA.
- הערכה של פנוטיפ של כונדרוציטים במהלך דדפרנציאציה (dedifferentiation).
- יישום הממצאים לטיפולים בפגמי סחוס.
תוצאות עיקריות
- השיטה מזהה באופן מהימן רמות כלליות של מתילציה של DNA.
- רמות 5-mC נמצאות במתאם עם הפנוטיפ של הכונדרוציטים.
- התובנות שהושגו עשויות לשפר אסטרטגיות של השתלת כונדרוציטים אוטולוגיים.
- יישומים פוטנציאליים עשויים להתרחב למחלות קשורות אחרות.
מסקנות
- טכניקה זו מציעה גישה פשוטה ומהירה להערכת מתילציה של DNA.
- הבנת הדינמיקה של המתילציה חיונית לשיפור טיפולים לשיקום סחוס.
- השיטה עשויה להקל על מחקרים נוספים ברפואה רגנרטיבית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
דדיפרנציאציה של כונדרוציטים במהלך הרחבה in vitro מהווה אתגר משמעותי עבור השתתלת כונדרוציטים אוטולוגית, שהיא טיפול מרכזי בפגמי סחוס. רמות מתילציה גלובליות של DNA משמשות כסמן ביולוגי לאובדן פנוטיפי, אך שיטות כימות קיימות מוגבלות בשל דרישות לדגימות גדולות, עלות גבוהה או מורכבות. בדיקת 5-mC dot blot מציעה חלופה אמינה, פשוטה ומהירה להערכת דינמיקת המתילציה, ובכך תומכת בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי פיתוח ברפואה רגנרטיבית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מנגנונים אפיגנטיים המניעים את אובדן הפנוטיפ של כונדרוציטים במהלך דדפרנציאציה.
- ערך תפעולי: מספק קריאה מהירה להערכת מתילציה גלובלית של ה-DNA כסמן ביולוגי תפקודי בתהליכי תיקוף של מטרות.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי קישור מגמות מתילציה להתקדמות הדדפרנציאציה, ובכך מספק מידע לקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) בתרפיה תאית.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים של מתילציה מדגימות gDNA בדילול סדרתי, מה שמאפשר הערכת תגובה למינון לאורך מספרים של מעברים (passage numbers).
- ערך תפעולי: משתמש בנוגדן 5-mC זמין מסחרית ובממברנת ניילון, ובכך מבצע סטנדרטיזציה של הגילוי ומפחית שונות במבחני סריקה אפיגנטיים.
- ערך סקילביליות: מבטל את הצורך באלקטרופורזה של ג'ל או בעיכול DNA, מה שמאיץ את הקמת הבדיקה ותומך בהערכה של תרביות כונדרוציטים בתפוקה בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: מקשר בין מודלים של דה-דיפרנציאציה (dedifferentiation) in vitro לתוצאות פנוטיפיות הרלוונטיות ליעילות של השתלת כונדרוציטים אוטולוגיים.
- ערך פרה-קליני: מאפשר ניטור אורך של שינויים אפיגנטיים לאורך מעברים (passages), ובכך תומך בהחלטות קידום מבוססות סיכון במחקרי תרפיה תאית פרה-קליניים.
- ערך מכניסטי: מסייע בתיאום של ביומרקרים על ידי מתאם של רמות 5-mC עם פנוטיפים של דה-דיפרנציאציה, ובכך מגביר את הביטחון החיזוי במודלים תרגומיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
בדיקת ה-5-mC dot blot משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, בכך שהיא מספקת קריאה אפיגנטית התורמת לתיקוף המטרה, לבדיקת מוכנות המערך ולרציפות תרגומית בטיפולים המבוססים על כונדרוציטים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מניעים אפיגנטיים בדדפרנציאציה, ובכך מאפשר הבהרת מסלולים והפחתת סיכונים ביולוגיים.
- סריקה: מספק פלטי מתילציה כמותיים וניתנים לשחזור מ-gDNA שננקד באופן סדרתי, ובכך תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובהשוואה בין תרכובות או תנאים.
- אנליטיקה: מייצר נתוני עוצמת אות הניתנים לניתוח באמצעות כימות תמונות, ומספק מדדים מדידים להערכת מגמות מתילציה בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין מודלים של דדפרנציאציה in vitro לתוצאות פנוטיפיות הרלוונטיות לתיקון סחוס, ותומך בתיקוף פרה-קליני המותאם לסממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה כלי סריקה אפיגנטי בר-שימוש שניתן להחיל מעבר לכונדרוציטים על מודלים של מחלות אחרות המערבות יציבות פנוטיפית, כגון אוסטאוארתריטיס.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית סביב תרומות אפיגנטיות לדדפרנציאציה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה באמצעות פורמט dot blot פשוט הדורש ציוד מינימלי וללא עיכול DNA.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להערכה אפיגנטית מהירה בשלב מוקדם של הגילוי, ובכך מפחית נשירה בשלבים מאוחרים עקב חוסר יציבות פנוטיפית בלתי צפויה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של שורות תאים או תנאי תרבית בהתבסס על יציבות מתילציה, ומספק מידע לקבלת החלטות על קידום בנתיבי רפואה רגנרטיבית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד DNA גנומי, דנטורציה וטכניקות בלוטינג כדי להבטיח את שלמות הדגימות ואת דיוק האות.
- תלוי בגישה לתנורי היברידיזציה, למערכות דימוי כימילומניסנציה ולריאגנטים סטנדרטיים לביולוגיה מולקולרית (למשל, BSA, TBST, נוגדנים).
- מחייב סטנדרטיזציה של טכניקת הניקוד (spotting) והטיפול בממברנה כדי למזער שונות בגודל הנקודה ובעוצמת האות בין משתמשים ומעבדות שונות.
- דורש אופטימיזציה של תנאי דגירה של נוגדנים ותנאי שטיפה כדי להפחית רעשי רקע ולהבטיח זיהוי ספציפי של 5-mC במגוון דגימות gDNA.
- מוגבל להערכת מתילציה חצי-כמותית או יחסית; כימות מוחלט עשוי לדרוש שיטות משלימות לצורך תיקוף.
