רב שכבתיים Ca קליפת המוח

המטרה הכללית של הליך זה היא לאפשר ויזואליזציה סימולטנית של פעילות נורונלית על פני שכבות מרובות של נורונים קורטיקליים באמצעות אינדיקטורים של סידן בעכבר בעל התנהגות חופשית, ולהבין את תפקוד המעגלים העצביים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה ממוזער המותקן על הראש. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הנוירוסיינס של מערכות, כגון, כיצד המידע מופץ על פני שכבות מרובות של הקורטקס. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ויזואליזציה של אוכלוסיות גדולות של נורונים מקודדים גנטית על פני שכבות קורטיקליות מרובות בבעלי חיים בעלי התנהגות חופשית, באופן מהימן לאורך זמן.

על מנת להנחית ויזואליזציה של נוירונים מקודדים גנטית משכבות קורטיקליות מרובות בחיה בעלת התנהגות חופשית, יש לבצע את הפרוצדורות הבאות, ופרוטוקול זה מדגיש את השתלת גרשן הפריזמה (prism probe), התקנת פלטת הבסיס והדימיג'ing in vivo בעכבר בעל התנהגות חופשית. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, שבוע עד שבועיים לאחר הזרקת הנגיף, מקם את החיה במכשיר הסטריאוטקסי, והכן את גרשן הפריזמה להשתלה על ידי חיטוי ב-70% ethanol וניקוי באמצעות נייר לעדשות. לאחר מכן, בצע קרניאוטומי מעגלי באמצעות מקדח מיקרו עם מקדח בקוטר 0.5 millimeter.

וודאו שקוטר הקרניוטומיה גדול במעט מקוטר הפריזמה. לאחר מכן, מקמו את הקרניוטומיה כך שכאשר הפריזמה תוכנס לקורטקס, צדה השטוח יפנה לעבר אתר הזרקת הווירוס ויהיה בתוך רדיוס של 150 עד 200 מיקרון. לאחר מכן, הסירו את הקשיחה (dura) באמצעות פינצטה עדינה.

ברגע שרקמת המוח חשופה, יש לשמור עליה תמיד לחה באמצעות סליין סטרילי. פעולה זו תשמור גם על הלחץ המופעל על הרקמה. כדי להקל על הלחץ ברקמת המוח במהלך השחלת התחוש (probe) הפריזמטי, צרו נתיב השחלה על ידי הצמדת סכין ניתוח בעלת קצה ישר לזרוע מחזיק האלקטרודה של המכשיר הסטריאוטקסי.

התקן אותו בזווית, כך שפלטת הסכין תהיה ניצבת לעקמומיות הגולגולת ובמישור מקבילי לעמודת הזרקת הווירוס. מקם בזהירות את הסכין מעל הקרניוטומיה, לאורך הקצה המדיאלי הפנימי שלה ובמרחק של כ-200 מיקרון לטרלית לאתר הזרקת הווירוס, כאשר חוד הסכין פונה לאחור. אפס את ציר ה-Z כאשר קצה הסכין נוגע ב-pia.

לאחר מכן, הנמיכו אותו בהדרגה לעומק שבו יוחדק מחשב המ prisma. לאחר מכן, העבירו את הסכין מילימטר אחד אחורה, כדי ליצור נתיב לקצה הקדמי של המ prisma. הסיגו את הסכין באיטיות באמצעות המיקרו-מניפולטור של הזרוע הסטריאוטקסית בקידומים של 10 micron לשנייה, והניחו חתיכה של ספוג ג'ל-פום (gel foam) הספוג בתמיסת סליין סטרילית מעל החתך.

לאחר מכן, הצמידו את מחזיק העדשה לזרוע המניפולטור הסטריאוטקסית באותה זווית שבה היה הסכין בשלב הקודם. יישרו את הפריזמה כך שהצד השטוח שלה יהיה מעל החתך ומקביל לעמוד הזרקת הנגיף. ברגע שהפריזמה נמצאת בזווית הנכונה, הורידו אותה בהדרגה אל תוך המוח בתוספות של 10 מיקרון, עד למפלס Z סופי של 1.1 מילימטר מפני השטח של המוח, עבור גשושית זו.

כסו כל רקמה חשופה סביב הפריזמה בקרניוטומיה, בשכבה דקה מאוד של דבק אלסטומר מגן, באמצעות מחט בגודל 25 gauge. כדי למנוע מהעדשה לזוז בתוך הקרניוטומיה, לאחר שהדבק האלסטומר התקשה, השתמשו במחט בגודל 25 gauge כדי למרוח מעט דבק ציאנואקרילט להצמדת זכוכית עדשת הפריזמה לגולגולת הסמוכה, מעל שכבת דבק האלסטומר. לאחר שדבק הציאנואקרילט התקשה, שחררו את תפס העדשה והסירו בזהירות את המיקרוסקופ.

לאחר מכן, החזירו לאט את זרוע המניפולטור הסטריאוטקסי, כך שגשושית הפריזמה תישאר מושתלה באופן מאובטח. מרחו שכבה של אקריליק דנטלי או דבק ציאנואקרילט מסביב לשתל, כדי לכסות את פני הגולגולת החשופים מבלי לגעת ברקמת השריר המרוחקת מסביב. כיסוי שטח גדול של הגולגולת באמצעות כיסוי קרנאלי זה יסייע מאוחר יותר בחיבור ללוח הבסיס.

לאחר מכן, ערבב את קצה הקטליזטור והבסיס ממזרק דבק סיליקון והנח טיפה של האלסטומר בתוך שרוול גשש הפריזמה, כך שתכסה את חלקו העליון של עדשת הגשש, וזאת כדי למנוע נזקים ושקיעת אבק. שבוע עד 10 ימים לאחר השתלת גשש הפריזמה, בדוק את ביטוי הווירוס ברקמה באמצעות גשש הפריזמה שהושתל. לשם כך, הסר את מכסה דבק הסיליקון מעל פני השטח של עדשת גשש הפריזמה המושתל.

בדקו את פני השטח של עדשת הגשושית, ונקו בעדינות כל לכלוך בעזרת נייר לעדשות ו-70% ethanol, כדי להבטיח שפני הדימיון נקיים. לאחר מכן, הצמידו פלטת בסיס למיקרוסקופ והדקו את בורג המעצור של הפלטה כדי לקבע אותה במקומה. לאחר מכן, אבטחו את המיקרוסקופ בתוך תופסן המיקרוסקופ על זרוע המיקרו-מניפולטור הסטריאוטקסי.

חברו את התפסן למוט שניתן להרכיב על זרוע המיקרו-מניפולטור הסטריאוטקסי. לאחר מכן, מקמו את המיקרוסקופ מעל עדשת Probe prism, באמצעות זרוע המיקרו-מניפולטור הסטריאוטקסי. בדקו ויזואלית את הכיוון על ידי התבוננות בעדשת הפריזמה מהצד ומגב השלב של בעל החיים.

יש להקביל את הציר האופטי של עדשת המיקרוסקופ ושל גשש הפריזמה. לאחר מכן, הפעל את תוכנת הרכישה, בחר את הפרויקט והדלק את נורת ה-LED של המיקרוסקופ באמצעות התוכנה. העריך את איכות כיול המיקרוסקופ על ידי מיקוד בשלב העליון של עדשת גשש הפריזמה המושתל בתוכנת הרכישה, תוך הזזת זרוע המניפולטור של הסטריאוטקס.

כאשר היישור נכון, קצותיה של עדשת גשש הפריזמה צריכים להיראות חדים. התאימו את המרחק הפיזי של המיקרוסקופ מעל גשש הפריזמה המושתל, באמצעות זרוע המניפולטור הסטריאוטקסית, כדי להגיע למישור המוקד הרצוי בתוך הרקמה. לאחר מכן, השתמשו באקריליק לדנטי או בציינו-אקרילט כדי להדביק לצמיתות את לוח הבסיס למכסה האקרילית כדי לגשר על הפער.

חשוב מאוד לא למרוח דבק על אף חלק מגוף המיקרוסקופ או על בורג הקשקוש בעת הדבקת לוח הבסיס לראש החיה. כעת, שחררו את המיקרוסקופ מהתופסן והסיטו את התופסן מהמיקרוסקופ. אם נעשה שימוש בצייאנואקרילט או בדבק שקוף אחר, כסו אותו בלק שחור לציפורניים או בשכבה של מלט דנטלי שחור כדי למנוע זליגה של אור סביבתי אל כיסוי הראש, דבר שעלול לזהם תמונות עתידיות שיתקבלו במהלך הניסויים.

לאחר מכן, הגנו על גשש הפריזמה המושתל באמצעות כיסוי ללוח הבסיס. בהליך זה, חברו את המיקרוסקופ לתיבת רכישת הנתונים המחוברת למחשב והפעילו את תוכנת הרכישה. לאחר מכן, הסירו את כיסוי לוח הבסיס על ידי סיבוב בורג השביט של לוח הבסיס נגד כיוון השעון והרמת כיסוי לוח הבסיס.

מקמו את המיקרוסקופ על גבי לוח הבסיס שעל בעל החיים. המיקרוסקופ אמור להינעל במקומו בעזרת המגנטים שעל לוח הבסיס. לאחר מכן, הדקו את בורג הכיוון של לוח הבסיס עד להרגשת התנגדות קלה.

לאחר מכן, בחרו את הגדרות הרכישה שישמשו לאיסוף הנתונים, הכוללות את קצב הפריימים ללכידת הנתונים. בדקו את ההיסטוגרמה של התמונה בעת בחירת ההגדרות כדי להבטיח יחס אות לרעש טוב. לאחר מכן, התחילו ברכישת הנתונים.

עם השלמת ההקלטה, שחררו את בורג המעצור של לוח הבסיס ונתקו את המיקרוסקופ מלוח הבסיס על ידי משיכה עדינה של המיקרוסקופ כלפי מעלה. לאחר מכן, החזירו את כיסוי לוח הבסיס והדקו בעדינות את בורג המעצור של לוח הבסיס. להלן הדגמה של בעל חיים המצויד במיקרוסקופ, המקיים אינטראקציה חופשית עם החפצים בזירה ההתנהגותית.

במהלך דימיון של התנהגות במצב ערות באמצעות המערכת, נרשמה הפעילות של נוירונים בקליפת המוח הסומטוסנסורית כאשר העכבר נחשף לשלוש סביבות שונות. שטח פתוח ביום הראשון, היכרות עם אובייקט בימים השני עד הרביעי, ואובייקט חדש ביום החמישי. לאחר חילוץ תאים באמצעות התוכנה לניתוח נתוני דימיון סידן, הונחו פילטרים מרחביים המתאימים למיקומי התאים על גבי השמה של עוצמת פלואורסצנציה ממוצעת מנתוני ההקלטה של המיקרוסקופ.

קו מקווקו לבן מפריד בין תאי שכבות שתיים, שלוש וחמש. עקבות סידן תואמים מחמישה תאים מכל אחת מהשכבות מראים את דפוס הפעילות של התאים בשני הקשרים התנהגותיים שונים: היכרות עם אובייקט וחשיפה לאובייקט חדש. תאי שכבות שתיים ושלוש היו פעילים יותר בהשוואה לתאי שכבה חמש ביום שבו העכבר נחשף לאובייקט חדש.

להלן שאר התרשימים של פעילויות התאים מהישויות השטחיות, כאשר בעל החיים היה בשטח פתוח, בהכרות עם חפץ ובחקר חפץ חדש. לאחר שליטה בשיטה, ניתן להשלים כל טכניקה בתוך שעה אם היא מבוצעת כהלכה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרי נוירוסיינס של מערכות, לחקור סוגי תאים ספציפיים באזורי מוח שונים, תוך מינוף פרדיגמות התנהגותיות שונות בזמזום ומודלים אחרים של נוירופיזיולוגיה במחלה.

מפרוטוקול זה ניתן להפיק הבנה טובה של אופן סימון שכבות מרובות של קליפת המוח הסומטוסנסורית, השתלת Probe פריזמטית וחיבור של מיקרוסקופ מיניאטורי המורכב על הראש.