Name: רב שכבתיים Ca קליפת המוח 2+ הדמיה בחופשיות העברת עכברים עם בדיקות פריזמה מיקרוסקופית פלואורסצנטי מיניאטורי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: חקור הדמיית סידן רב-שכבתית בקליפת המוח בעכברים חופשיים תנועה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיניאטורי. שיטה זו מאפשרת תצפית בו-זמנית על מאות תאים עצביים פעילים לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות V. Jayaraman, DS קים, לוגר Looger ו K. Svoboda מן גנטית- encoded ניורון מחוון ואפקטור (GENIE) פרויקט בקמפוס המחקר של ג&#39;נליה של הווארד יוז רפואי המכון על תרומתם הנדיבה של AAV1-GCaMP6f כדי אוניברסיטת פנסילבניה וקטור הליבה. הם גם רוצים להודות א Olson ו Neuroscience מיקרוסקופית Core באוניברסיטת סטנפורד נתמך על ידי NIH NS069375 להעניק עבור שירותי מיקרוסקופיה confocal שלהם.

<ol><li>McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+decision-making+in+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Development and decision-making in the mammalian cerebral cortex.</a> Brain Res. 472 (1), 1-23 (1988).</li>
<li>Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+and+decision-related+activity+propagate+in+a+cortical+feedback+loop+during+touch+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sensory and decision-related activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception.</a> Nat. Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).</li>
<li>Miller, E. K., Cohen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrative+theory+of+prefrontal+cortex+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An integrative theory of prefrontal cortex function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 167-202 (2001).</li>
<li>Bailey, M. R., Simpson, E. H., Balsam, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+underlying+effort%2C+time%2C+and+risk-based+decision+making+in+motivated+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Neural substrates underlying effort, time, and risk-based decision making in motivated behavior.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 133, 233-256 (2016).</li>
<li>Dehaene, S., Changeux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reward-dependent+learning+in+neuronal+networks+for+planning+and+decision+making%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making.</a> Prog. Brain Res. 126, 217-229 (2000).</li>
<li>Ferenczi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+cortical+regulation+of+brainwide+circuit+dynamics+and+reward-related+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior.</a> Science. 351 (6268), aac9698(2016).</li>
<li>Anomal, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+Processing+in+the+Primary+Auditory+Cortex+of+an+Animal+Model+of+Autism%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Sys.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Impaired Processing in the Primary Auditory Cortex of an Animal Model of Autism.</a> Front. Sys. Neurosci. 9, 158(2015).</li>
<li>Pauls, D. L., Abramovitch, A., Rauch, S. L., Geller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obsessive-compulsive+disorder%3A+an+integrative+genetic+and+neurobiological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Obsessive-compulsive disorder: an integrative genetic and neurobiological perspective.</a> Nat. Rev. Neurosci. 15 (6), 410-424 (2014).</li>
<li>Ziv, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+dynamics+of+CA1+hippocampal+place+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).</li>
<li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li>
<li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li>
<li>Sun, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+speed+dependence+of+entorhinal+island+and+ocean+cells%2C+including+respective+grid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entorhinal+Cortical+Ocean+Cells+Encode+Specific+Contexts+and+Drive+Context-Specific+Fear+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory.</a> Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).</li>
<li>Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Type-Specific+Activity+in+Prefrontal+Cortex+during+Goal-Directed+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior.</a> Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).</li>
<li>Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+sleep-wake+related+neuronal+activity+in+the+dorsal+pons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Comm%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons.</a> Nat. Comm. 7, 10763(2016).</li>
<li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).</li>
<li>Hooks, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+cortical+and+thalamic+input+to+pyramidal+neurons+in+mouse+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex.</a> The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).</li>
<li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+layer-specific+dynamics+of+cortical+ensembles+during+learning+of+a+motor+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task.</a> Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).</li>
<li>Rowland, D. C., Moser, M. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cortical+modules+to+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">From cortical modules to memories.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat. Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).</li>
<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat. Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
<li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+deep+cortical+layers+using+a+microprism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of deep cortical layers using a microprism.</a> J. Vis. Exp. (30), (2009).</li>
<li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li>
<li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layer+in+vivo+imaging+of+neocortex+using+a+microprism%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), pdb.prot5476 (2010).</li>
<li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures%3A+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li>
<li>Hawrylycz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+cortical+function+in+the+mouse+visual+system+through+large-scale+systems+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).</li>
<li>Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+primary+somatosensory+cortex+projection+to+the+primary+motor+cortex+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).</li>
<li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Euro.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li>
<li>Rogan, S. C., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Pharma.+Rev%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal signaling.</a> Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).</li>
<li>Berdyyeva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zolpidem+reduces+hippocampal+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice%3A+a+large+scale+calcium+imaging+study+with+miniaturized+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope.</a> PloS One. 9 (11), e112068(2014).</li>
</ol>

המחברים קראו את מדיניות היומן ויש להם את האינטרסים המתחרים הבאים: SG, SO ו- VC משולמים לעובדים ב- Inscopix.

הבנת פעילות מעגל עצבי במהלך התנהגות ערנית היא רמה חיונית של החקירה neuroscientific צורך ביעילות לנתח את תפקוד המוח בבריאות ומחלות. הקורטקס הוא אזור חשוב במיוחד כדי ללמוד בהקשר של התנהגות ער, שכן הוא ממלא תפקיד חשוב בהרבה תפקודים חושיים, קוגניטיביים ומבצעים 28 , 29 . הטור הקורטיקלי נחשב ליחידה הפונקציונלית הבסיסית בקליפת המוח, והפעילות ברמת האוכלוסין של תאי קליפת המוח ידועה בהתאם למיקומם הפיזי בעמודה. לדוגמה, נוירונים מעוררים בשכבות 2/3 בפרויקט הקורטקס הסומאטוסנסורי, בעיקר לאזורים ניאו-קורטיקליים אחרים, ומאופיינים ברשתות קורטיקליות אחרות 30 , בעוד שהתאים בשכבות עמוקות יותר מתמקדים בעיקר באזורים תת-קורטיקליים כמו התלמוס 31 . הקלטה של ​​פעילות של מאותS של תאים קליפת המוח שנקבע מראש בו זמנית ובאופן אמין לאורך זמן על פני lamina שונים בחופשיות נושאים מתנהג מאוד לקדם את ההבנה שלנו של זרימת מידע קליפת המוח, ומאפשר לנתח תפקודית עדינה של עמודות קליפת המוח ידי מידע התנהגותי בזמן אמת, מאזניים. איסוף זה ברמה של נתונים מעגל עצביים מתאפשר עם שימוש יעיל ויעיל פלטפורמת מיקרוסקופ מיניאטורי לנהל בקנה מידה גדול Ca 2 + הדמיה בנושאים מתנהגים בחופשיות (או נושאים קבוע בראש לפי הצורך). משמש עם מחווני סידן מקודדים מבחינה גנטית כדי לאפשר תא מסוג ספציפי מיקוד, הדמיה שדה רב שכבתית של נוף המסופק על ידי בדיקה פריזמה מושתל כרונית, פרוטוקול זה בחנו מקרה אחד בין יישומים אפשריים רבים: התבוננות הבדלים למינרית בעיבוד קליפת המוח somatosensory כאשר עכברים פיזית עוסקת עם אובייקט חדש ( איור 5 ).זהו האיור הפרוצדורלי הראשון מסוג זה של סוג תא ספציפי, בגישה vivo ללמוד שכבות קליפת המוח מרובים ער, מתנהג בחופשיות בעלי חיים, ומרחיב את הספקטרום של שיטות ניסיוניות זמין כדי להבין מבנים למינרית במוח הפעיל. שדה הראייה פריסקופי מופעלת על ידי בדיקה פריזמה בטכניקה זו יכול להיות מוחל על מבנים מוחיים אחרים כאשר שימור הרקמות ישירות הגב אל אזור של עניין הוא הרצוי; לדוגמה, הדמיה CA3 יכול להיות מושגת ללא הפרעה של תפקוד בהיפוקמפוס. פריזמה בדיקה המבוססת על גישה הדמיה Ca 2 + פעילות מחייב את ההכנסה פיזית השתלה קבועה של microprism לתוך קליפת המוח, אשר משווה את היצירה של הנגע קליפת המוח שבו בדיקה העדשה מוכנס. זה עלול לגרום שיבושים המעגלים העצביים המקומיים, כולל ניתוק של דנדריטים ותהליכים אפיים. Tההליך שלו גם יגרום הפעלה ראשונית של תאים גליה באזור, אם כי זה צפוי להיות מקומי לרקמה על 150 מיקרומטר מ הפנים פריזמה, וכדי להירגע לאחר המוח ריפא 22 . חשוב מאוד לשקול אם טכניקה זו תשפיע על אנטומיה מעגל רגיל ו / או התנהגות של בעלי החיים בעת תכנון ניסויים. קבוצות בקרה התנהגותיות צריכות תמיד להתבצע על מנת להבטיח כי אין שינויים משמעותיים בהתנהגויות בסיסיות שעלולות לגרום לתוצאות ניסוי מבולבלות. שימוש זה מיניאטורי, נייד Ca 2 + טכניקה הדמיה עם מניפולציה neuropharmacological, שונים קוגניטיבית, חברתית, מוטורית או פרדיגמות התנהגותיות, ולשלב אותו עם מדדים פיזיולוגיים אחרים יכולים להעמיק ולהעשיר מחקרים התמקד בהבנת תפקידים תפקודיים של מעגלים עצביים בהתנהגות האות עיבוד 32 דיכוי או הפעלהAtion של מסלולים מסוימים מאופיינים על ידי תרופות יכול להשפיע על התנהגויות הקשורות, אשר ניתן ללמוד בקלות באמצעות טכנולוגיה זו 33 . הסתעפות לתוך סוגי תאים שונים על ידי שינוי המיקוד של מחוון סידן עוד יישום חזק ושימושי, ומאפשר שילובים יצירתיים רבים של כלים ניסיוניים כדי לענות על מגוון רחב של שאלות מעגל עצבי.

הקורטקס הוא שחקן חיוני בתפקודים נפשיים והתנהגותיים מורכבים רבים, מתוך תשומת לב, תפיסה חושית ושליטה קוגניטיבית מלמעלה למטה 1 , 2 , 3 למסלולי מוטיבציה, גמול והתמכרות 4 , 5 . הבנת התהליכים החישוביים המונחים ביסוד תפקידה היא מטרה חשובה להניע הבנה קלינית טובה יותר של הפרעות נפשיות והתנהגותיות רבות. תיאוריות עכשוויות רבות של מרכז המחלות הפסיכיאטריות סביב הרעיון כי תפקוד לקוי של מעגלים עצביים בקליפת המוח או דיסקואורדינציה עשוי להתבסס על הפרעות קוגניטיביות והתנהגותיות שהן סימני ההיכר של התנאים כגון סכיזופרניה 6 , אוטיזם 7 או הפרעה אובססיבית-קומפולסיבית 8 . לפיכך, קבלת האוכלוסייה ברמת האוכלוסייה נתונים עצביים ממעגלים אנכיים בהקשר הנכון של מידע התנהגותי סימולטני הוא בעל חשיבות רבה, אידיאלי יכול להיות ממוקד סוגי תאים ספציפיים עבור דיסקציה מעגל עדין יותר. מיקרוסקופים מיניאטוריים בשילוב עם מיקרוסקופים מבודדים של שיפוע הדרגתי (GRIN) מאפשרים גישה אופטית להרכבים עצביים בתנאי תנועה חופשית ממגוון אזורי מוח אפשריים 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , כולל הקליפה 14 , 15 , 16 . באמצעות מערכת מיקרוסקופית נייד יחד עם מחוונים סידן מקודד גנטית מאפשר הדמיה עקבית של האוכלוסייה הסלולרית זהה המקיף מאות נוירונים על ימים עד שבועות באזורי מוח רבים 9 , והוא יכול להיותממוקד גנטית סוגי תאים ספציפיים באמצעות וקטור ויראלי או טכניקות מהונדס. כמו קליפת ידוע לתמוך פונקציות שונות להתחבר אזורים שונים במוח בהתאם למיקום של התאים בתוך lamina 17 , 18 , 19 , אנו מעוניינים לקבל פעילות רב עצבית רב שכבתיים בעת ובעונה אחת נושאים מתנהג ער. כאן אנו מדגימים כיצד לדמות מאות נוירונים שכותרתו fluorescently בעכברים מתנהג בחופשיות על פני ימים, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיניאטורי 20 בשילוב עם בדיקה מנסר המנסר, אשר מציעה תצוגה רב שכבתיים של קליפת המוח ( איור 1 ). הבדיקה פריזמה משמש כאן מורכב משני עדשות GRIN נפרד: פריזמה עדשת גליל ממסר ( איור 1 ). האור מהמיקרוסקופ מעורר את התווית הנקראת פלואורסצנטליתתאים הממוקמים לאורך הפנים הדמיה של בדיקה פריזמה, לאחר משתקף מחוץ hypotenuse של החלק פריזמה של בדיקה. האור הנפלט מן התאים משקף גם את hypotenuse של הפריזמה, נאסף באמצעות המטרה של המיקרוסקופ ומגיע חיישן במיקרוסקופ. בדיקת פריזמה בשימוש בהליך זה מותאם לשימוש קל עם ציוד stereotaxic סטנדרטי. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיניאטורי 20 מזהה פעולה הפוטנציאל עורר Ca 2 + חולפים באוכלוסיות עצביים עם רזולוציה תא יחיד, לאחר תאים אלה כבר שכותרתו במיוחד עם Ca 2 + רגיש מחוונים ניאון מקודד גנטית. בפרוטוקול זה, אנו מזריקים Ca 2 + אינדיקטור מקודדים בקטור ויראלי (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), להשתיל בדיקה פריזמה, להתקין את המיקרוסקופ, ולאחר מכן להשיג מספר ימים של נתונים סומטוסנסוריים (S1 אחוריים אחוריים) נתונים עצביים מתוך חשיפה חיהד למשטחים אובייקט הרומן במהלך חקירה חופשית ( איור 2 ).

<table><tbody><tr><td>Neurostar ממונע מכשיר סטריאוטקסי לבעלי חיים קטנים מדויק</td><td>במיוחד Kopf</td><td>דגם 963SD</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>סטריאוסקופ</td><td>Labomed</td><td>Prima DNT</td><td>ניתוח והדמיה</td></tr><tr><td>מיני בדיקת תרמיסטור רקטלי (קוטר 0.062 אינץ'/1.6 מ"מ) - 1/4 אינץ' ג'ק</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td>כרית חימום לניתוח</td></tr><tr><td>5 X 12.5 ס"מ&nbsp;</td><td>FHC</td><td>40-90-2-07</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח בקר טמפרטורת DC</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>משאבת מיקרו-מזרקים</td><td>World Precision Instruments</td><td>דגם UMP3; 155788 סדרתי F110</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>NanoFil 10 &mu; L מזרק</td><td>מכשירים מדויקים עולמיים</td><td>ניתוח</td><td>NANOFIL</td></tr><tr><td>35 גרם קצה משופע Nanofil NDL 2PK</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>NF35BV-2</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>Omnidrill35, 115 - 230 V</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>503598</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>קוצים למקדחה מיקרו</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>19007-05</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>nVista</td><td>Inscopix</td><td>100-001048</td><td>דימות</td></tr><tr><td>AAV1. CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>פן וקטור ליבת</td><td>AV-1-PV3435</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>קטופרופן</td><td>ויקטור רפואי</td><td>5487</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>קרפרופן</td><td>ויקטור רפואי</td><td>1699008&nbsp;</td><td>כירורגיה</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Victor Medical</td><td></td><td>1001054 Surgery</td></tr><tr><td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12 ס"מ x 7 מ"מ)</td><td>פייזר (פישר סיינטיפיק)</td><td>NC9841478</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 מלקחיים</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11251-35</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>ניתוח סכינים</td><td>בסדר Science Tools</td><td>10055-12</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח ערכת שתלים ProView</td><td>Inscopix</td><td>100-000756</td><td>ניתוח והדמיה</td></tr><tr><td>ProView Prism Probe 1.0 מ"מ-קוטר. ~4.3 מ"מ אורך</td><td>Inscopix</td><td>100-000592</td><td>ניתוח והדמיה</td></tr><tr><td>חבילת דבק Kwik-Sil של 2</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>KWIK-SIL</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>איטום יצוק</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>KWIK-CAST</td><td>ניתוח והדמיה</td></tr><tr><td>פוסט הרכבה אופטי מיניאטורי</td><td>ניופורט</td><td>M-TSP-3</td><td>הדמיה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ בסיס</td><td>Inscopix</td><td>BPL-2</td><td>הדמיה</td></tr><tr><td>כיסוי לוחית בסיס מיקרוסקופ</td><td>Inscopix</td><td>BPC-2</td><td>הדמיה</td></tr></tbody></table>

רב שכבתיים ca קליפת המוח<sup&gt; 2+</sup&gt; הדמיה בחופשיות העברת עכברים עם בדיקות פריזמה מיקרוסקופית פלואורסצנטי מיניאטורי

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

במעגל vivo ו הדמיה תפקודית ברמה התאית הוא כלי קריטי להבנת המוח בפעולה. הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים קליפת המוח העכבר עם מיקרוסקופ שני פוטון סיפקה תובנות ייחודיות לתוך מבנה קליפת המוח, פונקציונליות. עם זאת, מחקרים אלה מוגבלים לבעלי חיים קבועים ראש, לצמצם במידה ניכרת את המורכבות ההתנהגותית הזמינה למחקר. במאמר זה, אנו מתארים הליך לביצוע מיקרוסקופ פלואורסצנטי כרונית עם רזולוציה הסלולר על פני שכבות קליפת המוח מרובים בעכברים מתנהג בחופשיות. השתמשנו מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיניאטורי משולב יחד עם בדיקה מנסר המושרשת בו זמנית לדמיין ולהקליט את הדינמיקה סידן של מאות נוירונים על פני שכבות מרובות של קליפת המוח סומאטוסנסורי כמו העכבר עוסקת במשימה חיפוש חדש אובייקט, על פני כמה ימים. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת לאזורים אחרים במוח במינים שונים של בעלי חיים אחרים p התנהגותיארדיגמות.

<html> פרוטוקול המתואר כאן מתאר דרך יעילה ויעילה לבצע אורך רב שכבת Ca 2 + הדמיה של מאות נוירונים קליפת המוח בעכברים מתנהג בחופשיות באמצעות בדיקות פריזמה ( איור 1 ). גישות קודמות כלפי רב שכבתיים הדמיה קליפתית יש בעיקר היה מוגבל חיות בראש קבוע 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . על מנת לרכוש את רמת הנתונים הזאת בהקשר חופשי, נעשה שימוש בפלטפורמת מיקרוסקופ מיניאטורה לגמישות התנהגותית; אינדיקטור סידן מקודד גנטית (GCaMP6f) שימש למקד אוכלוסיות תאים ספציפיים (CAMKII + תאים בקליפת המוח); ו פריזמה בדיקה נבחרה לספק כרונית, רב שכבת שדה של נוף. -Together.within-page = &quot;1&quot;&gt; הראינו את זרימת העבודה להכנת החיה לצורך הדמיה. וקטור ויראלי קידוד מחוון סידן מתאים הוזרק לתוך קליפת המוח ( איור 2 , שלב 1), לפני כרוני השתלת בדיקה פריזמה כדי לאפשר גישה אופטית לתאים שכותרתו ( איור 2 , שלב 2). A baseplate המשמש כמעגן מאובטח, זמני למיקוד של המיקרוסקופ במהלך הפגישות הדמיה הותקן אז מעל הראש של החיה ( איור 2 , שלב 3), המאפשר הדמיה של פעילות קליפת המוח על פני שכבות תאים מרובים ב ערני מתנהג ניסיוני ( איור 2 , שלב 4). כדי להבטיח כי האוכלוסייה הסלולרית הרצוי היה להיות ממוקד, לאחר המוות ממותה בסעיף המוח מעכבר נציג מוצג באיור 3 עם דגימת בדיקה פריזמה שדה הראייה מסומן יחסית המעבדה GCaMP6fEled נוירונים בשכבות 2/3 ו 5 של קליפת המוח סומטו-סנסורי. במהלך התעוררות הדמיה התנהגות עם המערכת, הפעילות של נוירונים קליפת המוח somatosensory נרשמה כאשר העכבר נחשף לשלוש סביבות שונות - שדה פתוח (יום 1), אובייקט היכרות (יום 2-4) ו רומן אובייקט (יום 5) ( איור 4 ). ביום הראשון הונח העכבר בזירה התנהגותית נטולת חפצים. ביום 2-4 העכבר הונח בזירה עם שני אובייקטים שונים מבחינה טקסטורלית (בלוק ג&#39;ל ובלוק עץ). ביום 5 הוחלף אחד החפצים באובייקט חדש. החיה היה צילמו על פני 5 ימים במשך 20 דקות בכל יום. בעקבות מיצוי התא באמצעות Ca 2 + נתונים תוכנת ניתוח נתונים, מסננים מרחביים המתאים מיקומי התא היו עלים על הקרנת עוצמת פלואורסצנטי הממוצע של נתוני הקלטה מיקרוסקופ( איור 5) . קו מקווקו לבן מפריד שכבות 2/3 ו 5 תאים. מקבילים Ca 2 + עקבות מ 5 תאים מכל אחת השכבות להראות את דפוס הירי של התאים בשתי הקשרים התנהגותיים שונים - היכרות אובייקט וחשיפה אובייקט רומן. שכבת 2/3 תאים היו פעילים יותר לעומת שכבת 5 תאים ביום שבו העכבר נחשף אובייקט חדש. זה ניכר גם מן החלקות רסטר המציגים את פעילות הירי thresholded של כל תאים צילמו בימים 1, 4 ו - 5. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> איור 1: בויו Ca 2 + הדמיה על פני שכבות קליפת המוח מרובים בחופשיות העברת עכברים. ( א ) מפרטים פריזמה בדיקה ותיאור של המטוס הדמיה. ציפוי רפלקטיבית על החלק הפנימי של hypotenuse מאפשר הדמיה 90 ° מן המטוס הכניסה של בדיקה פריזמה. העדשה cuFf משתלב עם מחזיק העדשה, אשר מייעלת את הליך ההשתלה ומאפשר צפייה פוטנציאלית של הקרינה רקמות הסביבה במהלך ההשתלה ( B ) (i). איור של מיקום של craniotomy בדיקה פריזמה חתך סכין יחסית לאתר הזרקת הנגיף, ו (ii) איור של מיקום של פריזמה בדיקה בצד שטוח יחסית לחתך סכין אתר הזרקת וירוסים. ( C ) איור של in-vivo Ca 2 + הגדרת הדמיה מראה את הנתיב האור עבור שטח קטן בתוך שדה מלא של נוף באמצעות בדיקה פריזמה מושתל קליפת עכבר. ( ד ) שדה שדה תצוגה במהלך ההתקנה פריזמה בדיקה. מיקרוסקופ מיניאטורי מחובר מחזיק העדשה, המחזיקה בדיקה פריזמה המאפשר לבדוק את הביטוי וירוס במהלך ההתקנה פריזמה בדיקה. ( E ) שילוב של מיקרוסקופ עם בדיקה מנסרה עבור הדמיה קליפתית רב שכבתיים של GCaMP6f שכותרתו תאים S1. שדה שדה לדוגמה לדוגמהבמהלך ההתקנה. נקה כלי הדם דפוס גלוי בזמן baseplate להתקין עם כמה תאים בתמונה גלם. תאים נוספים נראים בבירור כאשר DF / F מופעל בחלון רכישת התוכנה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> איור 2: סכמטי מציג את ציר הזמן של אירועים זרימת עבודה עבור פריזמה בדיקה השתלת מיקרוסקופ התקנה. מספר השבועות מיוצגים על ציר ה- X ואת שלבי העבודה של ההליכים לאורך ציר ה- Y. ( A ) גרפי הממחישות הזרקת ויראלי (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) לאורך ציר dorso- הגחון אותו, כדי התווית מספר שכבות של קליפת המוח somatosensory. ( ב ) 2 שבועות לאחר זריקות וירוסים, בעיה פריזמהE הוא מושתל על ציר מקביל לאתרים הזרקת הנגיף. ( ג ) כשבוע לאחר ההשתלה בדיקה פריזמה, החיה נבדקת עבור הביטוי עם מיקרוסקופ ו baseplate מותקן על הראש אם אוכלוסייה של תאים גלוי. ( D ) בעל החיים הוא מוכן אז הדמיה כרונית במהלך משימות התנהגותיות רלוונטיות (קליפ עכבר אמנות שונה לאחר אישור מ - UW מדיסון ביוכימיה MediaLab). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> איור 3: אימות שלאחר המוות היסטולוגית של מיקום פריזמה בדיקה הביטוי GCaMP. ( א ) סעיף העטרה ממוח העכבר עכבר מראה את המסלול בדיקה פריזמה עם הצד הדמיה שלה פונהאת התאים GCaMP6f להביע (AAV1.CaMKII.GCaMP6f לידי ביטוי נוירונים בשכבות 2/3 ו 5). ( ב ) באותו המוח המוח העטרה הבאים מכתים עבור DAPI. סולם בר = 250 מיקרומטר ( C ) זום לאור תאי GCaMP6f להביע בקורטקס סומאטוסנסורי. סולם בר = 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> איור 4: פעילות עכבר במהלך הרגלה, היכרות, וחפץ אובייקט חדש בדיקה היה מעקב וידאו באמצעות תוכנת וידאו. ( א ) ביום הראשון, החיה הונחה בזירה התנהגותית נטולת חפצים (שדה פתוח). ( ב ) בימים 2-4, שני אובייקטים שונים מבחינה טקסטורלית (בלוק ג&#39;ל ובלוק עץ) הונחו בזירה (אובייקט Fami). ( ג ) ביום 5, אחד האובייקטים הוחלף עם חפץ חדש (בלוק עץ עם נייר חול) (רומן אובייקט חשיפה). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> איור 5: דינאמיקה סידן מ שכבות שטחיות ועמוקות של קליפת המוח סומטו-סנסורי של עכבר נציג צילמו עם המיקרוסקופ. ( א ) תמונה ממוזגת של מסננים נוירונים מרחביים (כתמים ירוקים) ואת הקרינה מתכוונת עוצמת הקרינה של הקלטה מיקרוסקופ דרך שדה בדיקה פריזמה של נוף. גבול בין שכבות על-גבייות ושכבות אינפרא-גרנריות המצוין על ידי קו מקווקו לבן. סולם בר = 100 מיקרומטר. ( ב ) עקבות סידן מחמישה תאים שטחיים ושכבה עמוקה (מלא כחול ואדום גElls בחלונית A), המציין יחידות של סטיית תקן של הקרינה הבאים העיקריים ניתוח רכיב עצמאי. סרגל סולם אופקי 50 s וסרגל מידה אנכי 10 SD ( C ) Raster העלילה של תאים משטחית (שכבות 2/3) ושכבות עמוקות (שכבה 5) המוצגות מעל שדה פתוח, היכרות אובייקט וחפץ אובייקט חדש. סולם בר = 100 s. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

כאן, אנו מציגים הליך לביצוע בקנה מידה גדול Ca 2 + הדמיה עם רזולוציה הסלולר על פני שכבות קליפת המוח מרובים בעכברים נעים באופן חופשי. מאות תאים פעילים ניתן לצפות בו זמנית באמצעות מיקרוסקופ מיניאטורי, ראש רכוב יחד עם בדיקה מנסר פריזמה.

רב שכבתיים Ca קליפת המוח<sup&gt; 2+</sup&gt; הדמיה בחופשיות העברת עכברים עם בדיקות פריזמה מיקרוסקופית פלואורסצנטי מיניאטורי

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לאפשר ויזואליזציה סימולטנית של פעילות נורונלית על פני שכבות מרובות של נורונים קורטיקליים באמצעות אינדיקטורים של סידן בעכבר בעל התנהגות חופשית, ולהבין את תפקוד המעגלים העצביים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה ממוזער המותקן על הראש. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הנוירוסיינס של מערכות, כגון, כיצד המידע מופץ על פני שכבות מרובות של הקורטקס. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ויזואליזציה של אוכלוסיות גדולות של נורונים מקודדים גנטית על פני שכבות קורטיקליות מרובות בבעלי חיים בעלי התנהגות חופשית, באופן מהימן לאורך זמן.על מנת להנחית ויזואליזציה של נוירונים מקודדים גנטית משכבות קורטיקליות מרובות בחיה בעלת התנהגות חופשית, יש לבצע את הפרוצדורות הבאות, ופרוטוקול זה מדגיש את השתלת גרשן הפריזמה (prism probe), התקנת פלטת הבסיס והדימיג'ing in vivo בעכבר בעל התנהגות חופשית. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, שבוע עד שבועיים לאחר הזרקת הנגיף, מקם את החיה במכשיר הסטריאוטקסי, והכן את גרשן הפריזמה להשתלה על ידי חיטוי ב-70% ethanol וניקוי באמצעות נייר לעדשות. לאחר מכן, בצע קרניאוטומי מעגלי באמצעות מקדח מיקרו עם מקדח בקוטר 0.5 millimeter.וודאו שקוטר הקרניוטומיה גדול במעט מקוטר הפריזמה. לאחר מכן, מקמו את הקרניוטומיה כך שכאשר הפריזמה תוכנס לקורטקס, צדה השטוח יפנה לעבר אתר הזרקת הווירוס ויהיה בתוך רדיוס של 150 עד 200 מיקרון. לאחר מכן, הסירו את הקשיחה (dura) באמצעות פינצטה עדינה.ברגע שרקמת המוח חשופה, יש לשמור עליה תמיד לחה באמצעות סליין סטרילי. פעולה זו תשמור גם על הלחץ המופעל על הרקמה. כדי להקל על הלחץ ברקמת המוח במהלך השחלת התחוש (probe) הפריזמטי, צרו נתיב השחלה על ידי הצמדת סכין ניתוח בעלת קצה ישר לזרוע מחזיק האלקטרודה של המכשיר הסטריאוטקסי.התקן אותו בזווית, כך שפלטת הסכין תהיה ניצבת לעקמומיות הגולגולת ובמישור מקבילי לעמודת הזרקת הווירוס. מקם בזהירות את הסכין מעל הקרניוטומיה, לאורך הקצה המדיאלי הפנימי שלה ובמרחק של כ-200 מיקרון לטרלית לאתר הזרקת הווירוס, כאשר חוד הסכין פונה לאחור. אפס את ציר ה-Z כאשר קצה הסכין נוגע ב-pia.לאחר מכן, הנמיכו אותו בהדרגה לעומק שבו יוחדק מחשב המ prisma. לאחר מכן, העבירו את הסכין מילימטר אחד אחורה, כדי ליצור נתיב לקצה הקדמי של המ prisma. הסיגו את הסכין באיטיות באמצעות המיקרו-מניפולטור של הזרוע הסטריאוטקסית בקידומים של 10 micron לשנייה, והניחו חתיכה של ספוג ג'ל-פום (gel foam) הספוג בתמיסת סליין סטרילית מעל החתך.לאחר מכן, הצמידו את מחזיק העדשה לזרוע המניפולטור הסטריאוטקסית באותה זווית שבה היה הסכין בשלב הקודם. יישרו את הפריזמה כך שהצד השטוח שלה יהיה מעל החתך ומקביל לעמוד הזרקת הנגיף. ברגע שהפריזמה נמצאת בזווית הנכונה, הורידו אותה בהדרגה אל תוך המוח בתוספות של 10 מיקרון, עד למפלס Z סופי של 1.1 מילימטר מפני השטח של המוח, עבור גשושית זו.כסו כל רקמה חשופה סביב הפריזמה בקרניוטומיה, בשכבה דקה מאוד של דבק אלסטומר מגן, באמצעות מחט בגודל 25 gauge. כדי למנוע מהעדשה לזוז בתוך הקרניוטומיה, לאחר שהדבק האלסטומר התקשה, השתמשו במחט בגודל 25 gauge כדי למרוח מעט דבק ציאנואקרילט להצמדת זכוכית עדשת הפריזמה לגולגולת הסמוכה, מעל שכבת דבק האלסטומר. לאחר שדבק הציאנואקרילט התקשה, שחררו את תפס העדשה והסירו בזהירות את המיקרוסקופ.לאחר מכן, החזירו לאט את זרוע המניפולטור הסטריאוטקסי, כך שגשושית הפריזמה תישאר מושתלה באופן מאובטח. מרחו שכבה של אקריליק דנטלי או דבק ציאנואקרילט מסביב לשתל, כדי לכסות את פני הגולגולת החשופים מבלי לגעת ברקמת השריר המרוחקת מסביב. כיסוי שטח גדול של הגולגולת באמצעות כיסוי קרנאלי זה יסייע מאוחר יותר בחיבור ללוח הבסיס.לאחר מכן, ערבב את קצה הקטליזטור והבסיס ממזרק דבק סיליקון והנח טיפה של האלסטומר בתוך שרוול גשש הפריזמה, כך שתכסה את חלקו העליון של עדשת הגשש, וזאת כדי למנוע נזקים ושקיעת אבק. שבוע עד 10 ימים לאחר השתלת גשש הפריזמה, בדוק את ביטוי הווירוס ברקמה באמצעות גשש הפריזמה שהושתל. לשם כך, הסר את מכסה דבק הסיליקון מעל פני השטח של עדשת גשש הפריזמה המושתל.בדקו את פני השטח של עדשת הגשושית, ונקו בעדינות כל לכלוך בעזרת נייר לעדשות ו-70% ethanol, כדי להבטיח שפני הדימיון נקיים. לאחר מכן, הצמידו פלטת בסיס למיקרוסקופ והדקו את בורג המעצור של הפלטה כדי לקבע אותה במקומה. לאחר מכן, אבטחו את המיקרוסקופ בתוך תופסן המיקרוסקופ על זרוע המיקרו-מניפולטור הסטריאוטקסי.חברו את התפסן למוט שניתן להרכיב על זרוע המיקרו-מניפולטור הסטריאוטקסי. לאחר מכן, מקמו את המיקרוסקופ מעל עדשת Probe prism, באמצעות זרוע המיקרו-מניפולטור הסטריאוטקסי. בדקו ויזואלית את הכיוון על ידי התבוננות בעדשת הפריזמה מהצד ומגב השלב של בעל החיים.יש להקביל את הציר האופטי של עדשת המיקרוסקופ ושל גשש הפריזמה. לאחר מכן, הפעל את תוכנת הרכישה, בחר את הפרויקט והדלק את נורת ה-LED של המיקרוסקופ באמצעות התוכנה. העריך את איכות כיול המיקרוסקופ על ידי מיקוד בשלב העליון של עדשת גשש הפריזמה המושתל בתוכנת הרכישה, תוך הזזת זרוע המניפולטור של הסטריאוטקס.כאשר היישור נכון, קצותיה של עדשת גשש הפריזמה צריכים להיראות חדים. התאימו את המרחק הפיזי של המיקרוסקופ מעל גשש הפריזמה המושתל, באמצעות זרוע המניפולטור הסטריאוטקסית, כדי להגיע למישור המוקד הרצוי בתוך הרקמה. לאחר מכן, השתמשו באקריליק לדנטי או בציינו-אקרילט כדי להדביק לצמיתות את לוח הבסיס למכסה האקרילית כדי לגשר על הפער.חשוב מאוד לא למרוח דבק על אף חלק מגוף המיקרוסקופ או על בורג הקשקוש בעת הדבקת לוח הבסיס לראש החיה. כעת, שחררו את המיקרוסקופ מהתופסן והסיטו את התופסן מהמיקרוסקופ. אם נעשה שימוש בצייאנואקרילט או בדבק שקוף אחר, כסו אותו בלק שחור לציפורניים או בשכבה של מלט דנטלי שחור כדי למנוע זליגה של אור סביבתי אל כיסוי הראש, דבר שעלול לזהם תמונות עתידיות שיתקבלו במהלך הניסויים.לאחר מכן, הגנו על גשש הפריזמה המושתל באמצעות כיסוי ללוח הבסיס. בהליך זה, חברו את המיקרוסקופ לתיבת רכישת הנתונים המחוברת למחשב והפעילו את תוכנת הרכישה. לאחר מכן, הסירו את כיסוי לוח הבסיס על ידי סיבוב בורג השביט של לוח הבסיס נגד כיוון השעון והרמת כיסוי לוח הבסיס.מקמו את המיקרוסקופ על גבי לוח הבסיס שעל בעל החיים. המיקרוסקופ אמור להינעל במקומו בעזרת המגנטים שעל לוח הבסיס. לאחר מכן, הדקו את בורג הכיוון של לוח הבסיס עד להרגשת התנגדות קלה.לאחר מכן, בחרו את הגדרות הרכישה שישמשו לאיסוף הנתונים, הכוללות את קצב הפריימים ללכידת הנתונים. בדקו את ההיסטוגרמה של התמונה בעת בחירת ההגדרות כדי להבטיח יחס אות לרעש טוב. לאחר מכן, התחילו ברכישת הנתונים.עם השלמת ההקלטה, שחררו את בורג המעצור של לוח הבסיס ונתקו את המיקרוסקופ מלוח הבסיס על ידי משיכה עדינה של המיקרוסקופ כלפי מעלה. לאחר מכן, החזירו את כיסוי לוח הבסיס והדקו בעדינות את בורג המעצור של לוח הבסיס. להלן הדגמה של בעל חיים המצויד במיקרוסקופ, המקיים אינטראקציה חופשית עם החפצים בזירה ההתנהגותית.במהלך דימיון של התנהגות במצב ערות באמצעות המערכת, נרשמה הפעילות של נוירונים בקליפת המוח הסומטוסנסורית כאשר העכבר נחשף לשלוש סביבות שונות. שטח פתוח ביום הראשון, היכרות עם אובייקט בימים השני עד הרביעי, ואובייקט חדש ביום החמישי. לאחר חילוץ תאים באמצעות התוכנה לניתוח נתוני דימיון סידן, הונחו פילטרים מרחביים המתאימים למיקומי התאים על גבי השמה של עוצמת פלואורסצנציה ממוצעת מנתוני ההקלטה של המיקרוסקופ.קו מקווקו לבן מפריד בין תאי שכבות שתיים, שלוש וחמש. עקבות סידן תואמים מחמישה תאים מכל אחת מהשכבות מראים את דפוס הפעילות של התאים בשני הקשרים התנהגותיים שונים: היכרות עם אובייקט וחשיפה לאובייקט חדש. תאי שכבות שתיים ושלוש היו פעילים יותר בהשוואה לתאי שכבה חמש ביום שבו העכבר נחשף לאובייקט חדש.להלן שאר התרשימים של פעילויות התאים מהישויות השטחיות, כאשר בעל החיים היה בשטח פתוח, בהכרות עם חפץ ובחקר חפץ חדש. לאחר שליטה בשיטה, ניתן להשלים כל טכניקה בתוך שעה אם היא מבוצעת כהלכה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרי נוירוסיינס של מערכות, לחקור סוגי תאים ספציפיים באזורי מוח שונים, תוך מינוף פרדיגמות התנהגותיות שונות בזמזום ומודלים אחרים של נוירופיזיולוגיה במחלה.מפרוטוקול זה ניתן להפיק הבנה טובה של אופן סימון שכבות מרובות של קליפת המוח הסומטוסנסורית, השתלת Probe פריזמטית וחיבור של מיקרוסקופ מיניאטורי המורכב על הראש.

multi-layer-cortical-ca2-imaging-freely-moving-mice-with-prism-probes

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

כדי להבין את הדינמיקה של הרשת microcircuits ב הניאוקורטקס, חיוני להקליט בו זמנית את הפעילות של מספר גדול של נוירונים. In-vivo שני הפוטונים הדמיה סידן היא השיטה היחידה המאפשרת להקליט את הפעילות העצבית של אוכלוסייה צפופה עם רזולוציה של תא בודד.

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

ימנית זווית microprisms מוכנס לתוך הניאוקורטקס העכבר מאפשר הדמיה עמוק של שכבות מרובות קליפת המוח עם מבט נמצא בדרך כלל פרוסה. אחת מילימטר microprisms מציעים בתחום של נוף רחב (~ 900 מיקרומטר) והחלטות מרחבי מספיק כדי לפתור את הקוצים הדנדריטים. אנו מדגימים שכבה V הדמיה עצבית הדמיה של כלי הדם neocortical באמצעות microprisms.

בתחום ההדמיה vivo של שכבות קליפתיים עמוק באמצעות Microprism

בחומר וידאו משלים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור...

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

מקור: Thapa, R., et. al., הזרקה ויראלית סטריאוטקסית והשתלת עדשות אינדקס שיפוע למוח עמוק  In Vivo הדמיית סידן.  J. Vis. Exp. (2021)הסרטון מדגים הדמיית סידן בזמן אמת באמצעות מיניסקופ בעכבר שעבר התמרה, ומתאם בין פעילות עצבית להתנהגות.

הדמיית סידן בזמן אמת של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית של עכבר באמצעות מיניסקופ

באמצעות מספר זוויות לחתוך את מוח גור עכבר, אנחנו לשפר פרוסת מוח חריפה שתואר אשר לוכדת את הקשרים בין רוב מבני המוח התיכון והמוח הקדמי השמיעתיים המרכזיים.

שינוי של Colliculo-thalamocortical עכבר המוח פרוסה, שילוב הדפסת 3-D של לשכת רכיבים ודימות אופטי רב בקנה מידה

כאן נתאר תהליך ניקוי רקמות, תיוג פלורסנט של הדמיה בקנה מידה גדול של רקמת מוח העכבר המאפשרת, ובכך, ויזואליזציה של הארגון תלת מימדי של סוגי תאים בתוך קליפת.

הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

שיטה זו מתארת הכנה כרונית המאפשרת גישה אופטית להיפוקמפוס של עכברים חיים. הכנה זו יכולה לשמש לביצוע הדמיה אופטית לאורך של הפלסטיות הקונסטרוקטיבית העצבית ופעילות-מעורר פלסטיות הסלולר במשך תקופה של מספר שבועות.

אורך שני-פוטון הדמיה של CA1 היפוקמאל בעכברים חיים

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

פרוטוקול זה מפרט את ההליך לדימות תגובות סידן בקוליקולוס העליון (SC) של עכברים ערים, כולל הדמיה של פעילות נוירון יחיד במיקרוסקופ של שני פוטונים תוך השארת קליפת המוח שלמה בעכברי בר, והדמיית ה-SC כולו במיקרוסקופ רחב שדה בעכברים מוטנטיים בעלי קליפת מוח חלקית.

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

בשילוב עם לוחית ראש ועיצוב אופטי התואם למיקרוסקופים של פוטון בודד ושני פוטונים, עדשת המיקרופריזמה מציגה יתרון משמעותי במדידת תגובות עצביות בטור אנכי בתנאים מגוונים, כולל ניסויים מבוקרים היטב במצבים קבועים בראש או משימות התנהגותיות טבעיות בבעלי חיים הנעים בחופשיות.

הדמיה ארוכת טווח של אוכלוסיות עצביות מזוהות באמצעות מיקרופריזמות בבעלי חיים הנעים בחופשיות ומקובעים לראש

חקור הדמיית סידן רב-שכבתית בקליפת המוח בעכברים חופשיים תנועה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיניאטורי. שיטה זו מאפשרת תצפית בו-זמנית על מאות תאים עצביים פעילים לאורך זמן.

רב שכבתיים Ca קליפת המוח

גלה סרטונים נוספים