בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד בו זמנית קרדיומיוציטים, תאי אנדותל ופיברובלסטים ברי קיימא מלב החולדה לצורך ניתוחי המבחנה האישיים שלהם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הלב וכלי הדם לגבי מנגנוני האיתות המעורבים בהיפרטרופיה לבבית, פגיעה באיסכמיה, רפרפוזיה, תפקוד אנדותל ופיברוזיס לבבי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד את כל תאי הלב העיקריים בו זמנית, מה שעשוי להפחית את עלויות המחקר הנלוות ואת מספר חיות הניסוי.

לאחר מים מזוקקים אחד ושטיפה בינונית אחת של 50 מיליליטר פאוול, החלף את המדיום ב-80 מיליליטר של מדיום פאוול טרי, והשתמש בפיפטה פסטר מזכוכית מגליל הזכוכית כדי להחדיר את המדיום ברציפות בקרבוגן. לאחר מכן, השתמש בשני זוגות של מלקחיים מעוקלים דקים כדי להרכיב לב חולדה שזה עתה נקטף דרך אבי העורקים על מערכת הזלוף של לנגנדורף, והנח את קצה צינורית מערכת הזלוף בין ענף אבי העורקים הראשון למסתם אבי העורקים. תקן את אבי העורקים בעזרת מהדק תנין.

פתח את שסתום הצינורית ואז תקן את הלב בתפר כירורגי. אפשר ל-35 מיליליטר של מדיום הזלוף לעבור דרך טיפת הלב בצורה חכמה, ולהסיר כל שאריות דם. הנח את משפך האיסוף מתחת ללב, והפעל את המשאבה הפריסטלטית כדי להחזיר את מדיום הזלוף ממשפך האיסוף למאגר.

הוסף תמיסת קולגנאז למדיום הזלוף, והחדיר את הלב בתמיסת הקולגנאז החוזרת למשך 30 דקות. בסוף העיכול, השתמשו במספריים כדי להוציא את הלב ממערכת לנגנדורף ולהניח אותו בצלחת פטרי מזכוכית. כעת הסר גם פרוזדורים וגם שאריות רקמת שומן מהלב.

כדי למנוע זיהום תאי אפיתל, השתמש בשני מלקחיים כדי לקלף בזהירות את קרום הלב. חותכים את הלב באמצע, ומניחים את החצאים לתוך קוצץ הרקמות. טוחנים את הלב פעמיים עד שלוש, ומעבירים את חתיכות הרקמה לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל 12 מיליליטר של חיץ עיכול מזלוף לנגנדורף.

עכל את שברי הרקמה באמבט מים במשך חמש עד 10 דקות, ומדי פעם ערבב עם פיפטת פלסטיק חד פעמית של חמישה מיליליטר. לאחר מכן מסננים את מתלה התאים דרך מסננת של 100 מיקרומטר לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. יש לשטוף את מערכת הזלוף במינימום ליטר אחד של מים מזוקקים ואחריו 100 מיליליטר של 0.1 נתרן הידרוקסיד רגיל למשך 30 דקות, ואז לשטוף את המערכת בעוד שניים עד שלושה ליטר מים מזוקקים, ולייבש את המכשיר באוויר שטוף.

אסוף את התאים המסוננים על ידי צנטריפוגה, והשתמש בפיפטה חד פעמית כדי להעביר בזהירות את תא האנדותל והפיברובלסטים המכילים סופרנטנט לתוך צינור חדש של 50 מיליליטר. השעו מחדש את הגלולה בשישה מיליליטר תמיסת סידן אחת. לאחר דקה אחת, אספו את התאים עם צנטריפוגה שנייה, והשעו מחדש את הכדור בשישה מיליליטר תמיסת סידן שתיים.

לאחר דקה אחת, יש לדלל את תרחיף התאים בתוספת 12 מיליליטר תמיסת סידן שלוש, ולערבב היטב על ידי הטיה עדינה. לאחר צנטריפוגה נוספת, השעו מחדש את הגלולה ב-20 מיליליטר של מדיום CCT שחומם מראש. לאחר מכן יש להקצות מיליליטר אחד של תאים לכל אחד מ-20 צלחות תרבית תאים סטריליות בגודל 35 מילימטר המצופות מראש בלמינין, ולהניח את התאים באינקובטור תרבית תאים נטול פחמן דו חמצני, ולהחליף את המדיום בשני מיליליטר של מדיום CCT טרי כדי להסיר תאים מתים לאחר שעתיים.

כעת צנטריפוגה של תא האנדותל והפיברובלסטים המכילים סופרנטנט, והשעיה מחדש של הגלולה ב-1.5 מיליליטר של מאגר בידוד תאי אנדותל. העבירו את התאים לצינור דגימה של שני מיליליטר, והוסיפו נוגדן CD31 נגד חולדות לעכבר לתאים לדגירה של 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב מקצה לקצה. בסוף הדגירה, הוסף חרוזי IGG נגד עכבר פאן ל-20 בדגירה בארבע מעלות צלזיוס, עם סיבוב מקצה לקצה.

בסוף הדגירה של החרוזים, הניחו את התאים במדף מגנטי למשך שתי דקות, והשתמשו בפיפטה של מיליליטר אחד כדי להסיר בזהירות את הפיברובלסטים המכילים בעיקר סופרנטנט. ראה את הפיברובלסטים על צלחת תרבית של 10 סנטימטר המכילה 10 מיליליטר של מדיום תרבית תאים פיברובלסטים, והנח את התאים בחממת תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעה. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה לצינור תאי האנדותל וכסה את הצינור.

נער בעדינות את התאים ארבע עד חמש פעמים כדי להשעות את החרוזים. לאחר מכן החזר את הצינור למגנט והסר את מאגר הכביסה לאחר דקה אחת. לאחר הכביסה האחרונה, החלף את מאגר הכביסה במיליליטר אחד של מדיום תרבית תאי אנדותל MV2, וזרע את תאי האנדותל לבאר אחת של צלחת 12 בארות, לתרבית הלילה שלהם בחממת תרבית התאים.

בתום הדגירה של הפיברובלסטים, יש לשטוף את התאים המחוברים בנפח מתאים של PBS מחומם מראש פעמיים-שלוש. לאחר מכן, הוסף מדיום תרבית תאי פיברובלסטים טרי שחומם מראש לתאים, והחזיר את הפיברובלסטים לחממת תרבית התאים. למחרת בבוקר, החלף את הסופרנטנט בתרבית תאי האנדותל במדיום תרבית תאי אנדותל טרי, והחזיר את התאים לחממה, והחלף את המדיום כל יומיים-שלושה, עד למפגש למחצה.

לאחר מכן שטפו את התרבית של תאי פיברובלסטים מחוברים עם PBS טרי שחומם מראש כפי שהודגם זה עתה, והזינו את התאים במדיום טרי שחומם מראש. הליך בידוד הקרדיומיוציטים מניב 70 עד 80% אוכלוסיית תאי לב טהורה, בת קיימא, בצורת מוט ומפוספסת. לאחר מכן ניתן לבצע ניתוח תנודות סידן תוך תאיות של קרדיומיוציטים מבודדים טעונים בפורה AM, בתגובה לאיסכמיה בלב קרדיומיוציטים, כמו גם ניתוח השינויים באיתות הסידן בתאי אנדותל מבודדים של חרוזים מגנטיים ופיברובלסטים, לאחר הוספת ATP.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שלוש שעות אם היא מתפקדת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להגדיר את מערכת הזלוף הזו כראוי, ולתקן מיד את הלב במערכת ברגע שהוא מוכן. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום חקר הלב וכלי הדם לחקור את האיתות המעורב בפתופיזיולוגיות קרדיווסקולריות שונות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב את העקרונות הבסיסיים של בידוד ותרבית תאי לב. אל תשכח שעבודה עם מכשירים כירורגיים וריאגנטים לתרבית תאים עלולה להיות מסוכנת ביותר, וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון שימוש זהיר במכשירים ושימוש בכפפות בעת ביצוע הליך זה.