Name: בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: למדו לבודד בו-זמנית קרדיומיוציטים, תאים אנדותל ופיברובלסטים מלב עכברוש מבוגר בשיטה יעילה. פרוטוקול זה מפחית עלויות מחקר ומספר בעלי חיים נדרשים לניסויים בקרדיולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

התמיכה הטכנית של L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas ו- A. Weber מודה בהכרת תודה. המחברים מבקשים גם להודות לד&quot;ר א. מרטינסון על הוכחות מקיפות לקריאה ועריכה בשפה של כתב היד. המחקר נתמך על ידי אוניברסיטת ג &#39;סן Anschubsfinanzierung מענק מ&#39; אסלאם וד &#39;Gündüz.

<ol><li>Zaragoza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Animal models of cardiovascular diseases.</a> J Biomed Biotechnol. 2011, 497841(2011).</li>
<li>Claycomb, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HL-1+cells%3A+a+cardiac+muscle+cell+line+that+contracts+and+retains+phenotypic+characteristics+of+the+adult+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).</li>
<li>Barbieri, S. S., Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke+cooperates+with+interleukin-1beta+to+alter+beta-catenin+trafficking+in+vascular+endothelium+resulting+in+increased+permeability+and+induction+of+cyclooxygenase-2+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke cooperates with interleukin-1beta to alter beta-catenin trafficking in vascular endothelium resulting in increased permeability and induction of cyclooxygenase-2 expression in vitro and in vivo.</a> FASEB J. 21 (8), 1831-1843 (2007).</li>
<li>Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).</li>
<li>Xu, X., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+adult+rat+heart+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of adult rat heart myocytes.</a> J Vis Exp. (28), (2009).</li>
<li>Gündüz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+extracellular+ATP+protects+against+acute+reperfusion+injury+in+rat+heart+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.Res%22%5BJournal%5D)">Accumulation of extracellular ATP protects against acute reperfusion injury in rat heart endothelial cells.</a> Cardiovasc.Res. 71 (4), 764-773 (2006).</li>
<li>Brilla, C. G., Zhou, G., Matsubara, L., Weber, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+metabolism+in+cultured+adult+rat+cardiac+fibroblasts%3A+response+to+angiotensin+II+and+aldosterone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Collagen metabolism in cultured adult rat cardiac fibroblasts: response to angiotensin II and aldosterone.</a> J Mol Cell Cardiol. 26 (7), 809-820 (1994).</li>
<li>Shahzad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+involved+in+postconditioning+protection+of+cardiomyocytes+against+acute+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms involved in postconditioning protection of cardiomyocytes against acute reperfusion injury.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 209-216 (2013).</li>
<li>Gündüz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+Stabilizes+Microvascular+Endothelial+Barrier+Function+via+Phosphatidylinositol+3-Kinase%2FAkt-Mediated+Rac1+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol%22%5BJournal%5D)">Insulin Stabilizes Microvascular Endothelial Barrier Function via Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-Mediated Rac1 Activation.</a> Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 30, 1237-1245 (2010).</li>
<li>Lipps, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminal+fragment+of+cardiac+myosin+binding+protein-C+triggers+pro-inflammatory+responses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">N-terminal fragment of cardiac myosin binding protein-C triggers pro-inflammatory responses in vitro.</a> J Mol Cell Cardiol. 99, 47-56 (2016).</li>
<li>Abdallah, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Ca2%2B+cycling+and+mitochondrial+permeability+transition+pores+promotes+reperfusion-induced+injury+of+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Interplay between Ca2+ cycling and mitochondrial permeability transition pores promotes reperfusion-induced injury of cardiac myocytes.</a> J Cell Mol Med. 15 (11), 2478-2485 (2011).</li>
<li>Gündüz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ticagrelor+on+endothelial+calcium+signalling+and+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Effect of ticagrelor on endothelial calcium signalling and barrier function.</a> Thromb Haemost. , (2016).</li>
<li>Gündüz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+effects+of+ATP+and+adenosine+on+barrier+function+of+rat+coronary+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol.Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Opposing effects of ATP and adenosine on barrier function of rat coronary microvasculature.</a> J Mol.Cell Cardiol. , (2012).</li>
</ol>

מחברים אין מה להכריז.

במאמר זה, פרוטוקול לשחזור לבידוד ותרבויות של myocytes לב, תאי האנדותל, fibroblasts מתואר. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד בו זמנית באיכות גבוהה של סוגי תאים עיקריים של רקמת לב, כלומר cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts לעומת סוג אחד בלבד התא. שלב קריטי בהליך הבידוד הוא העיכול הנכון של רקמת הלב. אם העיכול אינו שלם, מספר גדול של myocytes עדיין ניתן להשיג אבל האיכות שלהם היא גרועה מאוד והם בעיקר hypercontracted ו עגול ( איור 2 ב ) ואין ערך בניסויים. יתר על כ...

מודלים מכרסמים כבר זמן רב שימשו כלים כדי להרחיב את ההבנה שלנו של פיזיולוגיה לב וכלי דם בבריאות ומחלות. 1 למרות שמודלים אלו מאפשרים לנו להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלה ברמת האורגן ולנתח את הפרמקוקינטיקה והפרמקודינמיקה של סוכני תרופה שונים המשמשים לטיפול במחלות לב וכלי דם, הבנה של המנגנונים המולקולריים של התפתחות מחלות לב וכלי דם ותרומתו של גורם מסוים סוג התא דורש שימוש במודלים תרבות תאים חוץ גופית . לשם כך פותחו קווי תאים שונים הנפתחים ממערכת הלב וכלי הדם; 2 , 3 עם זאת, תאים מבודדים טרי טרי הם פיזיולוגית ופונקציונלית רלוונטי יותר רקמות חיות אורגניזמים. הלב הוא איבר צדדי המכיל את כל סוגי התאים העיקריים של הלב וכלי הדםYstem, ואת הלב חולדה הוא עדיין מודל נפוץ להבנת פיזיולוגיה של הלב וכלי הדם. במהלך העשורים האחרונים, שיטות שונות לבידוד של סוגי תאים בודדים מרקמת הלב תוארו; 4 , 5 , 6 , 7 עם זאת, שיטות אלה מתמקדים רק על בידוד של סוג תא מסוים אחד וכתוצאה מכך אובדן סוגים אחרים של תאים שאינם יכולים לשמש עוד לניתוח הסלולר. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד בו זמנית באיכות גבוהה של סוגי תאים עיקריים של רקמת הלב, כלומר cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts. כל סוגי תאים אלה ניתן להשתמש setups ניסיוני שונים 8 , 9 , 10 ו לניתוח של תא אינטראקציות התא מאותו בעל חיים.

<table><tbody><tr><td>אנטי-vWF</td><td>סנטה קרוז ביוטק.</td><td>SC-14014</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>Merck</td><td>102378</td><td></td></tr><tr><td>קרניטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג II</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>קריאטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C0780</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>Dil-AC-LDL</td><td>Thermo Scientific</td><td>L3484</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת EDTA (0.2 מ')</td><td>Biochrome AG</td><td>L2113</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת הטמעה</td><td>Citiflour</td><td>AF1-25</td><td></td></tr><tr><td>מדיום תאי אנדותל MV2</td><td>PromoCell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FCS)</td><td>Biochrome AG</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Serva Chemicals</td><td>47991</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>אבוט</td><td>TU 061219</td><td></td></tr><tr><td>למינין&nbsp;</td><td>Roche/Sigma</td><td>11243217001</td><td></td></tr><tr><td>M199 בינוני</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150059</td><td></td></tr><tr><td>M199 בינוני (אבקה)</td><td>Biochrome AG</td><td>T061</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן CD31 נגד חולדות עכבר (TLD-3A12)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-81051</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת NaCl (0.9%), סטרילי</td><td>ב. בראון</td><td></td><td></td>30820080</tr><tr><td>חרוזי IgG של עכבר פאן (Dynabeads)Thermo</td> <td>Scientific</td><td>11041</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution</td><td>Santa Cruz Biotech.</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פוספט מלח (PBS) 1x&nbsp;</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>חומרים מתכלים מפלסטיק</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Merck</td><td>4933</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט</td><td>Merck</td><td>7873</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Merck</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נתרן הידרוקסיד (2 N)</td><td>Merck</td><td>109136</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי מערכת סינון</td><td>Thermo Scientific</td><td>5660020</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO</td><td>Thermo Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>מים, סטרילי</td><td>B. Braun</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד סימולטני של cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

החולדה היא מודל חייתי חשוב המשמש במחקר לב וכלי דם, תאי חולדה חולדה משמשים באופן שגרתי לניתוח במבחנה של המנגנונים המולקולריים של התקדמות מחלות לב וכלי דם כגון היפרטרופיה לבבית, פיברוזיס וטרשת עורקים. למרות מספר ניסיונות עם הצלחה משתנה נעשו לפתח שורות תאים נצח מן המערכת הלב וכלי הדם כדי להבין את המנגנונים הסלולר, תאים ראשוניים מציעים סביבה טבעית קרוב יותר in vivo עבור מחקרים כאלה. לכן, מעבדות שונות העובדות על סוג תא מסוים פיתחו פרוטוקולים לבודד סוגים בודדים של תאי חולדה מעניינים של עניין. פרוטוקול המאפשר בידוד של יותר מסוג תא אחד, עם זאת, חסר. כאן פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד של באיכות גבוהה סוגי תאים לב גדולים (cardiomyocytes, תאי האנדותל, fibroblasts) מתוך הכנה אחת ומאפשרתR לניתוחים סלולריים. זה מאפשר שימוש יעיל ביותר של המשאבים הזמינים, אשר עשוי לחסוך זמן ולצמצם עלויות מחקר.

<html> הליך הבידוד גורם תשואה של 70-80% קיימא, בצורת מוט, cardiomyocytes מופשטים ( תרשימים 2A ו 2C ) שניתן להשתמש בהם עבור ניסויים מתוכננים. ב cardiomyocytes המעבדה שלנו משמשים באופן שגרתי לניתוח Ca 2 + איתות. איור 5A מראה סידן תאיים [Ca 2 + ] תנודה אני בתגובה איסכמיה / reperfusion cardiomyocytes טעון עם Fura-AM (5 מיקרומטר). איור 5 ב מראה ש...

כמה פרוטוקולים פותחו ותיארו לבידוד של סוגי תאים לב שונים של הלב חולדה. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד של איכות גבוהה תאים מרכזיים של תאים לב (cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts) מתוך הכנה אחת, הפחתת עלויות הניסוי.

בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד בו-זמנית קרדיומיוציטים חיים, תאי אנדותל ופיברובלסטים מלבב של חולדה לצורך ניתוחים בודדים in vitro. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הקרדיווסקולרי הנוגעים למנגנוני האיתות המעורבים בהיפרטרופיה של הלב, פגיעה מאיסכמיה וreperfusion, תפקוד האנדותל ופיברוזיס של הלב. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד בו-זמנית את כל תאי הלב העיקריים, מה שעשוי להפחית את עלויות המחקר הנלוות ואת מספר בעלי החיים בניסוי.לאחר שטיפה אחת במים מזוקקים ושטיפה אחת ב-50 milliliter של מצע Powell, החליפו את המצע ב-80 milliliters של מצע Powell רענן, והשתמשו בפיפט פסטור מזכוכית מתוך גליל הזכוכית כדי לבצע פרפוזיה רציפה של המצע עם קרבוגן. לאחר מכן, השתמשו בשני זוגות של פינצטות דקות מעוקלות כדי לקבע לב של חולדה שנקצר זה עתה באמצעות האאורטה אל מערכת הפרפוזיה של Langendorff, והניחו את קצה הקנולה של מערכת הפרפוזיה בין הענף האאורטלי הראשון לבין המסתם האאורטלי. קבעו את האאורטה באמצעות תפס תנימים.פתחו את שסתום הקנולה, ולאחר מכן קבעו את הלב באמצעות תפר כירורגי. הניחו ל-35 milliliters של תמיסת הפרפוזיה לעבור דרך הלב בטפטוף, כדי להסיר שאריות דם. הניחו את משפך האיסוף מתחת ללב, והפעילו את המשאבה הפריסטלטית כדי להזרים את תמיסת הפרפוזיה ממשפך האיסוף חזרה למאגר.הוסיפו תמיסת קולגנאז למצע הפרפוזיה, ובצעו פרפוזיה ללב עם תמיסת הקולגנאז במחזוריות למשך 30 דקות. בסיום העיכול, השתמשו במספריים כדי להוציא את הלב ממערכת לנגנדורף (Langendorff) והניחו אותו בצלחת פטרי מזכוכית. כעת הסירו את שתי העליות וכל שארית של רקמת שומן מהלב.כדי למנוע זיהום של תאי אפיתל, השתמשו בשתי פינצטות כדי לקלף בזהירות את פריקרדיום (קרום השבבת). חתכו את הלב לאורכו במרכז, והניחו את החצאים במקצץ הרקמות. קצצו את הלב שתיים עד שלוש פעמים, והעבירו את חתיכות הרקמה לפסולה קונית של 15 milliliter המכילה 12 milliliter של בופר עיכול מ퍼פוזיית Langendorff.בצעו עיכול של פרגמנטי הרקמה בבן-מריה למשך חמש עד 10 דקות, תוך ערבוב מדי פעם בעזרת פיפטת פלסטיק חד-פעמית של 5 ml. לאחר מכן, סננו את תרחיף התאים דרך נפה של 100 µm לתוך מבחנה קונית של 50 ml. שטפו את מערכת הפרפוזיה עם לפחות 1 L של מים מזוקקים, ולאחר מכן עם 100 ml של נתרן הידרוקסיד בריכוז 0.1 N למשך 30 דקות; שטפו את המערכת שוב עם שניים עד שלושה ליטרים נוספים של מים מזוקקים, וייבשו את המכשיר באמצעות זרימת אוויר.אספו את התאים המסוננים באמצעות סנטריפוגציה, והשתמשו בפיפט חד-פעמי כדי להעביר בזהירות את העילוי המכיל את תאי האנדותל ואת הפיברובלסטים למבחנה חדשה של 50 milliliters. השעיו מחדש את המשקע בשישה milliliters של תמיסת סידן אחת. לאחר דקה אחת, אספו את התאים בסנטריפוגציה שנייה, והשעיו מחדש את המשקע בשישה milliliters של תמיסת סידן שתיים.לאחר דקה אחת, דללו את תרחיף התאים על ידי הוספה של 12 milliliters של תמיסת סידן שלוש, וערבבו היטב באמצעות הטיה עדינה. לאחר צנטריפוגה נוספת, השעיו את המשקע ב-20 milliliters של מצע CCT שחומם מראש. לאחר מכן, חלקו אליקוט של מיליליטר אחד של תאים לכל אחת מ-20 צלחות תרבית תאים סטריליות בנפח 35 millimeter המצופות מראש בלמינין, והניחו את התאים באינקובטור לתרבית תאים ללא פחמן דו-חמצמני, והחליפו את המצע בשני milliliters של מצע CCT טרי להסרת תאים מתים לאחר שעתיים.כעת סנטריפוז את העל-נוזל המכיל את התאים האנדותליאליים והפיברובלסטים, והשהה מחדש את המשקע ב-1.5 milliliters של בופר לבידוד תאים אנדותליאליים. העבר את התאים לפח שמיכה של שני מיליליטר, והוסף לתאים נוגדן mouse anti-rat CD31 לדגירה של 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב מקצה לקצה. בסיום הדגירה, הוסף חרוזי Pan anti-mouse IGG לדגירה של 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, עם סיבוב מקצה לקצה.בסיום הדגירה עם החרוזים, הניחו את התאים במעמד מגנטי למשך שתי דקות, והשתמשו בפיפטה של 1 mL כדי להסיר בזהירות את העליון המכיל בעיקר פיברובלסטים. העבירו את הפיברובלסטים לצלח תרבית בן 10 cm המכיל 10 mL של מצע תרבית לתאי פיברובלסט, והניחו את התאים באינקובטור לתרבית תאים בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של באפר שטיפה למבחנה עם התאים האנדותליאליים וסגרו את המבחנה.נער את התאים בעדינות ארבע עד חמש פעמים כדי להשעות מחדש את החרוזיים. לאחר מכן, החזר את המבחנה למגנט, והסר את תמיסת השטיפה לאחר דקה אחת. לאחר השטיפה האחרונה, החלף את תמיסת השטיפה ב-1 mL של מצע גידול לתאי אנדותל מסוג MV2, והשתיל את תאי האנדותל לתוך באער אחת של פלטת 12 באערים, לצורך גידול למשך לילה באינקובטור לתרביות תאים.בסיום דגירת הפיברובלסטים, שטפו את התאים ההיצמדים עם נפח מתאים של PBS שחומם מראש, פעמיים עד שלוש. לאחר מכן, הוסיפו לתאים מצע גידול טרי ומחומם מראש עבור תאי פיברובלסטים, והחזירו את הפיברובלסטים לאינקובטור לתרבית תאים. למחרת בבוקר, החליפו את העל-נוזל (supernatant) בתרבית התאים האנדותליאליים במצע גידול טרי עבור תאים אנדותליאליים, והחזירו את התאים לאינקובטור, תוך החלפת המצע מדי יומיים עד שלושה, עד להגעה למצב של חצי-הסנכיות (semi-confluency).לאחר מכן, שטפו את תרבית תאי הפיברובלסטים ההדבקים עם PBS טרי ומוחמם מראש כפי שהודגם זה עתה, והזינו את התאים במצע טרי ומוחמם מראש. פרוצדורת בידוד הקרדיומיוציטים מניבה אוכלוסייה של תאי לב מופסננים, דמויי מוט, חיוניים ובדרגת טוהר של 70 עד 80%. כעת ניתן לבצע ניתוח של תנודות סידן תוך-תאיים בקרדיומיוציטים מבודדים שנטענו ב-fura AM, בתגובה לאיסכמיה וreperfusion בקרדיומיוציטים, וכן ניתוח של שינויים באיתות סידן בתאי אנדותל ובפיברובלסטים שבודדו באמצעות חרוזי מגנט, לאחר הוספת ATP.לאחר שליטה בטכניקה, ניתן להשלימה תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להגדיר את מערכת הפרפוזיה בצורה נכונה, ולקבע את הלב במערכת באופן מיידי ברגע שהיא מוכנה. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מחקר המערכת קרדיו-וסקולרית לבחון את השליחויות המעורבות בפתולוגיות קרדיו-וסקולריות שונות.לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להגיע להבנה טובה של העקרונות הבסיסיים של בידוד ותרבית תאי לב. זכרו כי עבודה עם מכשירים כירורגיים וריאגנטים לתרבית תאים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש זהיר במכשירים והרכבת כפפות, בעת ביצוע הליך זה.

simultaneous-isolation-high-quality-cardiomyocytes-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר זה תיארנו את הדרך טיפוסי לבודד תרבות עכברוש מבוגר myocytes לב. Collagenase ו פרוטאז משמשים לעכל לבודד myocytes יחיד. Myocytes תרבותי לעקוב בפרוטוקול זה לעמוד בדרישות הניסוי ביותר.

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Myocytes לב למבוגרים הם תאים ראשוניים, כי יכול להיות מבודד לבבות בעלי חיים מתורבתים במשך כמה ימים. במהלך תקופה זו תרבות העברת גנים adenoviral ניתן להשתמש בהם כדי להביע biosensors מקודדים גנטית (GEBs) או חלבונים היתוך ניאון. שתי הגישות לאפשר חקירות הסלולר באמצעות מיקרוסקופיה confocal.

בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal

אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של שריר לב עכבר בוגר. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית לתרבות של שריר לב בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

פרוטוקול זה מתאר שיטה שלב אחר שלב לבידוד הניתן לשחזור ותרבית ארוכת טווח של קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים עם תפוקה, טוהר וכדאיות גבוהים.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

כאן, אנו מציגים עבור בידוד של טיפוח של עכברים בוגרים חדרית cardiomyocytes (ARVC) פרוטוקול. ניתן להשתמש ARVC מבודד לטיפוח לטווח הקצר ולטווח הארוך. בידוד של טיפוח של ARVC יכול לשחק תפקיד מפתח בפיתוח משטרי הטיפול החדש למחלות לב.

בידוד, טיפוח של עכברים בוגרים Cardiomyocytes

כאן, אנו מתארים הליך ממוטבת, המבוססים על Langendorff על בידודו של תא בודד cardiomyocytes פרפור ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר. תקנה ידנית בלחץ intraluminal של חללים לב מיושם להניב המתאימים עירור-התכווצות-מצמד לימודי תקין מבחינה פונקציונלית נייטרלים.

בידוד של פרפור Cardiomyocytes ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד, טרנס-תירטוי ותרבות ארוכת טווח של עכבר בוגר וקרדיומיוציטים של חולדות.

בידוד, טרנס-תירבה ותרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר וקרדיומיוציטים עכברים וחולדות

אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד של אנדוקקרודיאל ותאי הכליליים כלילית מלבבות חולדה באמצעות עיכול הרקמה הסדרתית במאגר העיכול, איסוף תא מחזורי צנטריפוגה חוזרים, וטיהור תאים באמצעות anti-rat CD31 microbeads.

בידוד של תאי כלילית ותאים כליליים מהקיר החופשי של לב החולדה

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

תקן הזהב בקרדיולוגיה לניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים הוא קרדיומיוציטים. מאמר זה מתאר התאמות לטכניקה שאינה לנגנדורף לבידוד קרדיומיוציטים של עכברים.

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

למדו לבודד בו-זמנית קרדיומיוציטים, תאים אנדותל ופיברובלסטים מלב עכברוש מבוגר בשיטה יעילה. פרוטוקול זה מפחית עלויות מחקר ומספר בעלי חיים נדרשים לניסויים בקרדיולוגיה.

בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

גלה סרטונים נוספים