הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד את הדינמיקה של מיקרוטובוליים בתאי שמרים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום המיקרוטובוליים, כגון האופן שבו מוטציות בטובולים ובמבקרים של מיקרוטובוליים מווסתות את הדינמיקה של המיקרוטובוליים בתא חי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתאי שמרים חיים מיוצבים בתמונה.

במקום זאת, רזולוציית זמן גבוהה למשך עשר דקות, או רזולוציית זמן נמוכה למשך מספר שעות. את הפרוצדורה ידגימו Colby Fees ו-Cassi Estrem, שני סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי. תאי השמרים ששימשו בניסוי זה נבנו כדי לבטא באופן קוסטטיבי tubulin המסומן ב-GFP.

החדילו כ-1 µL של תאי שמרים מקולוניה בודדת על מצע לתוך 3 mL של מצע סינתטי מלא (synthetic complete medium). אפשרו לתאים לגדול למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C עם ניעור ב-250 RPM. למחרת, דללו את התרבית הרוויה במצע עד ל-OD600 של פחות מ-0.1.

החזירו את התרבית המדוללת למנער בטמפרטורה של 30 degree Celsius למשך שלוש עד ארבע שעות, או עד שה-OD600 יהיה בין 0.4 ל-0.8. התחילו בהכנת שקופיות לתא זרימה על ידי גזירת יריעת סרט פראפין לחתיכה ברוחב של ארבעה אינץ' ובאורך של שבעה אינץ'. הניחו שקופית מיקרוסקופ סטנדרטית לאורכה על רוחב ארבעת האינצ'ים של סרט הפראפין ועטפו את הסרט סביב השקופית שלוש עד ארבע פעמים, כך שהשקופית תהיה מכוסה בשכבות של סרט בעובי של שלוש עד ארבע שכבות.

הדקו את השכבות זו לזו כדי להבטיח איטום סביר, אך הימנעו מלחיצה חזקה מדי או מגרימה לקמטות בסרט. בעזרת להב של סכין יפית נקייה, וזכוכית אחרת שתשמש כקצה ישר לחיתוך, חתכו את סרט הפרפין לאורך הקצוות החיצוניים של הזכוכית. קלפו את שארית הסרט מהזכוכית שבה עובדים והשליכו אותה.

בעזרת השקופית השנייה כסרגל, חתכו את שכבות הסרט המונחות אחת על השנייה לאורך הציר הארוך של השקופית לכ-10 רצועות, שרוחב כל אחת מהן הוא שני עד ארבעה מילימטרים. לאחר מכן, חתכו את שכבות סרט הפרפין המונחות זו על זו בניצב לחתכים הקודמים, לאורך הציר הקצר של השקופית, כדי ליצור רצועות ברוחב של שני עד ארבעה מילימטרים, באורך של 23 עד 24 מילימטרים, ובעובי של שלוש עד ארבע שכבות. השתמשו בתער בזווית של 45 מעלות כדי לקלף את רצועות הסרט שנחתכו.

לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי לפזר באופן אחיד את הרצועות הגזורות על עלית מיקרוסקופ נקייה כדי ליצור את מספר התאים הרצוי. בדוגמה זו, ייעשה שימוש בארבע רצועות סרט ליצירת שלושה תאים. הניחו עלית כיסוי אחת מעל רצועות הסרט, והזיזו אותה למקומה באמצעות פינצטה.

הניחו את השקופית המוכנה, כאשר זכוכית הכיסוי פונה כלפי מעלה, על פלטה מחממת המכוונת לכ-95 degrees celsius, וחממו את השקופית למשך כשלוש דקות עד שפסי הסרט יהיו שקופים. אטמו את השקופית ואת זכוכית הכיסוי יחד באמצעות פינצטה על ידי לחיצה עדינה על אזורי זכוכית הכיסוי שנמצאים ישירות מעל פסי סרט הפרפין. השתמשו בפינצטה כדי להסיר את השקופית מהפלטה המחממת, והניחו אותה בצד להתקרר כאשר צד זכוכית הכיסוי פונה כלפי מעלה.

בעוד השקופית מתקררת, הסרט יחזור לצבע לבן אטום. כדי להתחיל בהליך זה, הפשיר במטמפר חדר מנבוב קפוא של 200 microliter של Concanavalin A. הוסף כ-100 microliter של Concanavalin A מופשר לכל תא בשקופית המוכנה על ידי פיפטור לאחד הקצוות הפתוחים.

לאחר מכן, תלו את הזכוכית, כאשר כיסוי הזכוכית פונה כלפי מטה, בין שני מתקני מבחנות למיקרופוגה למשך חמש דקות כדי לאפשר ל-Concanavalin A להיקשר לכיסוי הזכוכית. החזירו את הזכוכית למצב שבו כיסוי הזכוכית פונה כלפי מעלה, והסירו את ה-Concanavalin A על ידי שטיפת התא במצע מלא סינתטי. העבירו דרך התא כמות של מצע השווה לפעמיים נפח התא, באמצעות שימוש בפינה של נייר סופג לשאיבת הנוזל מקצה אחד של התא, תוך כדי הזרקת נוזל טרי בעזרת פיפט לקצה השני של התא.

טען את התאים על ידי הזרימה של נפח כפול מנפח התא של תרחיף תאים באמצעות שיטת הזרימה המכוונת. תלה את השקופית, כאשר כיסוי הזכוכית פונה כלפי מטה, למשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד לכיסוי הזכוכית. שטוף החוצה תאים שאינם נצמדים על ידי הזרימה של נפח פי ארבעה מנפח התא של מצע סינתטי מלא (synthetic complete medium).

ייבשו בזהירות כל קצה של התא בעזרת פינה נקייה של נייר סופג, תוך הבאת המניסקוס עד לקצה של זכוכית הכיסוי. אטמו כל קצה של התא בעזרת חומר איטום חמים. רכישת הדמויות תבוצע באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד בעדשת אובייקטיב CFI Plan Apo 100X עם 1.45 NA, במבמה פ piezoelectric, ביחידת סריקה קונפוקלית עם דיסקה מסתובבת, בלייזר תאורה ובמצלמת EMCCD.

שמר את טמפרטורת הבמה בטמפרטורת החדר במהלך רכישת התמונות. התאם את התאים למיקוד וחפש בנסף תאים המקובצים יחד, כדי להבטיח שבשדה הרכישה ישנם לפחות חמישה עד שישה תאים הצמודים זה לזה באותו מישור מיקוד. תכנן רכישה רב-ממדית לאיסוף מספר zSeries לאורך זמן.

כווננו את ההגדרות בתוך הגדרות הרכישה הפעילות באופן הבא: עומק Z כולל של 6 µm כדי להקיף את תא השמר כולו, גודל צעד Z של 300 nm כדי למקסם את איסוף האור ללא דגימת יתר, משך זמן כולל של 10 דקות, מרווחי זמן של 4 שניות בין סדרות zSeries, וזמן חשיפה של 90 ms עבור כל מישור Z. התחילו את הרכישה על ידי לחיצה על Run, והניחו לה לרוץ למשך מלוא 10 הדקות. הנתונים נשמרים כסדרת תמונות, ודוגמה לתוצאה של דימוי Time-lapse מוצגת כאן.

התחילו את ניתוח התמונה על ידי פתיחת ImageJ וגרירת ערימת התמונות שנרכשה ישירות אל לוח הבקרה. ייבוא ה-bio formats יתחיל באופן אוטומטי. בחרו ב-"Okay" כדי לטעון את ערימת התמונות כ-hyperstack.

באמצעות פונקציית ZProject, הפכו כל zSeries להטלה דו-ממדית של עוצמה מקסימלית. החילו מסנן חציוני (medium filter) על מחסנית התמונות כדי להפחית רעשי ניקוד (speckling noise) על ידי בחירה בתפריט process, בתפריט המשנה filter ובמאפיין median. הזינו 2.0 pixels בתיבת הרדיוס ולחצו על Okay. זהו תאי pre-NFA בשדה.

אלו מאופיינים בניצנים בגודל בינוני ובכישס מיטוטי קצר באורך של כ-1 עד 1.5 µm. החל מנקודת הזמן הראשונה של סדרת התמונות, השתמש בכלי הקו המקוטע (segmented line tool) כדי לשרטט קו לאורך מיקרוטובולו אסטרלי בודד, מהמפגש שבין המיקרוטובולו האסטרלי למיקרוטובולו הכישס המסומנים בעוצמה רבה יותר, ועד לקצה הפלוס, הנמצא בציטופלזמה. לחץ פעמיים על קצה המיקרוטובולו כדי להשלים את הקו המקוטע.

יש לרשום את המדידה בטבלת התוצאות באמצעות תכונת המדידה על ידי לחיצה על מקש M במקלדת. לאחר ביצוע המדידות עבור כל נקודות הזמן, העתיקו את הנתונים מטבלת התוצאות, הדביקו אותם בגיליון אלקטרוני ובחרו ב-"Save As" כדי לשמור את הנתונים. גרפיקה זו מציגה סדרה של מדידות לאורך זמן של דינמיקת מיקרוטובוליים אסטרליים בתא מסוג בר (wild type), ובזן מוטנטי שהוכח בעבר כבעל מיקרוטובוליים יציבים יותר.

מיקרוטובוליים מסומנים באמצעות alpha tubulin תגית GFP כדי להדמיא את אורך המיקרוטובוליים. החצים האדומים מתווים את האורך הכולל של מיקרוטובול אסטרלי, כאשר ראשי החצים מציינים את קצות הפלוס. אורכי המיקרוטובוליים נמדדו בכל נקודת זמן במשך שמונה דקות, ואורכים אלו, לאחר ריכוזם, מוצגים בתרשימי חיים (life plots).

הנקודות הירוקות מציינות פולימריזציה, והנקודות הוורודות מציינות דפולימריזציה. אירועי קטסטרופה מסומנים בחצי חצים. גרפים אלו מראים כי המיקרוטובולי במוטנט ארוך יותר, ומפגין פחות אירועי קטסטרופה מאשר המיקרוטובולי של סוג הבר (wild type).

בנוסף, קצבי הפולימריזציה והדפולימריזציה שנקבעו על פי השיפועים של אורכי המיקרוטובולים בעלייה ובירידה נמוכים יותר במוטנט בהשוואה לסוג הבר (wild type). מדידות של דינמיקת המיקרוטובולים מעלות גם כי למיקרוטובול בתא המוטנטי יש דינמיות מופחתת בהשוואה לסוג הבר. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את הכנת הפרוסה, טעינת התאים ורכישת התמונות בתוך 30 דקות, מה שמאפשר לדגום תמונות של דגימות רבות ושונות ביום אחד.

ניתן להכין ולאחסן את תאי השקופית מראש, לפני הוספת Concanavalin A. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מייצבים תאי שמרים בתאי שקופית פשוטים, מבצעים דימות בארבעה ממדים ומודדים דינמיקה של מיקרוטובוליים בתאים חיים. בנוסף למיקרוטובוליים, ניתן להתאים את פרוטוקול זה למדידת הדינמיקה של חלבונים אחרים המסומנים פלואורסצנטית בתאי שמרים חיים בטווחי זמן הנעים משניות ועד שעות.