מבטל Multi-חור cryovial הקפאת חפצים כאשר השרירים שקועים ישירות בחנקן נוזלי

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקפיא רקמות שריר על ידי טבילה ישירה בחנקן נוזלי תוך מניעת ארטיפקטים של הקפאה. Maozhang He, סטודנט מהמעבדה שלי, ידגים פרוצדורה זו יחד עם Yizhong Huang. לתחילת הדברים, סמנו את זהות הדגימה על כל מבחנה קריוגנית.

לאחר מכן, הכינו את הציוד הבא: מיכל חנקן נוזלי, משקפי מגן או מגן פנים, כפפות למקפיא, פינצטה באורך 10 סנטימטר ופינצטה באורך 25 סנטימטר. כמו כן, הכינו קירור קלקר, ניילון נצמד, סכין מנתח וכריכות PVC במידה A4. כדי להכין את דגימות השריר, התחילו במילוי הקירור בחנקן נוזלי.

בתוך חמש דקות מקבלת הדגימה, הניחו בעדינות את הדגימה על פיסת כריכת PVC בגודל A4, והתבוננו בכיוון סיבי השריר. לאחר מכן, השתמשו בסכין מנתחים כדי לבצע שני חתכים מקבילים דרך הדגימה בכיוון סיבי השריר, באורך של כ-3 סנטימטרים ובמרחק של 0.6 סנטימטרים זה מזה. גזרו את השריר שנחתך למלבן ברוחב של כ-0.6 סנטימטרים, גובה של 0.6 סנטימטרים ואורך של 1.5 סנטימטרים.

לאחר מכן, באמצעות פינצטה של עשרה סנטימטרים, הניחו בעדינות את הדגימה על פיסת ניילון, כאשר הציר האורכי של השריר החתוך מקביל לקצה הארוך של הניילון. הניחו את רקמת השריר בחלק התחתון-מרכזי של מבחנה קריוגנית מסומנת, בדיוק בין חורי הכניסה, וסגרו את פקק המבחנה היטב. כדי להקפיא את דגימת הרקמה, השתמשו בפינצטה של 25 סנטימטרים כדי לטבול במהירות את כל המבחנה הקריוגנית בחנקן נוזלי, בתוך צידנית קלקר שהוקררה מראש, והמתינו עד שחנקן הנוזלי יפסיק לרתוח.

כמות החנקן הנוזלי צריכה להיות מספיקה כדי להטביע את כל המבחנה הקריוגנית, והמבחנה הקריוגנית צריכה להיות נמוכה לחלוטין ממפלס הנוזל. העבירו את דגימות השריר למיכל אחסון של חנקן נוזלי, או למקפיא בטמפרטורה של 80- degree celsius לאחסון לטווח ארוך. חשוב למנוע מגע מקרי בין השרירים הקפואים למכלים או למכשירים בטמפרטורת החדר.

להכנת השקופיות, קהלו מראש קריוסטט לטמפרטורה שבין 20 °C ל-22 °C. הסירו והשליכו את להב המיקרוטום הישן, ונגבו את מחזיק הסכין ואת לוחית מניעת הגלילה (anti-roll plate) בקריוסטט. לאחר מכן, התקינו להב מיקרוטום חדש בקריוסטט, והגדירו את עובי החיתוך ל-8 µm.

הוציאו את המבחנה הקריוגנית עם דגימת השריר ממכל אחסון החנקן הנוזלי, או ממקפיא של 80- מעלות צלזיוס, והניחו אותה בחנקן נוזלי או על קרח יבש. לאחר מכן, העבירו את הדגימה לקריוסטט, והמתינו 30 דקות עד שהדגימה תגיע לשיווי משקל תרמי עם טמפרטורת הקריוסטט. לאחר שיבוץ הדגימה באמצעות OCT, רכבו את הדגימה על תומך הדגימות.

לאחר מכן, בצעו חיתוך של פלחים בעובי שמונה מיקרומטרים. הצמידו את הפלחים לעבר מרכז של שקופית מיקרוסקופית בטמפרטורת החדר. הניחו מיד את השקופית לתוך קופסת שקופיות.

לאחר מכן, הניחו את קופסת השקופיות במקפיא של 80- degree celsius. אין לאפשר לשקופיות להתייבש בטמפרטורת החדר. כפי שניתן לראות כאן, גבישי קרח נוצרו כאשר דגימה של שריר longissimus dorsi מחזירים הונחה ישירות במקפיא של 80- degree celsius, מה שגרם לאפקט "גבינת השוויצרית" המוכר בפרוזות הקפאות של השריר.

גבישי קרח נוצרו גם כאשר רקמת השריר הוטבלה ישירות בחנקן נוזלי. בשיטה אחרת, גבישי קרח רבים דמויי מחט נוצרו במדור הציטופלזמי של סיבי שריר (myofibers) כאשר הרקמה הוטבלה במצע קיבוע OCT בכיוון הנכון, ואז הוקפאה במהירות בתערובת של איזופנטאן. הקפאת הרקמה לתוך קריו-מבחנה בעלת חורים מרובים משיגה שלמות מצוינת של הדגימה, עם מדור ציטופלזמי הנראה בבירור והצמדה הדוקה של סיבי השריר לרקמה שסביבם.

באמצעות שיטה זו, נותחה פעילות ה-ATPase בסיבי שריר בעלי כיווץ מהיר ובעלי כיווץ איטי. כאשר ניתנים זמנים שווי ערך, סיבים בעלי כיווץ מהיר נראים בהירים, עם שני דרגות, וסיבים בעלי כיווץ איטי נראים שחורים. בשיטת ההקפאה הסטנדרטית המוצגת כאן, רקמת השריר הושקעה בתמיסה (slurry) של isopentane ללא מגע ישיר עם מדיום הקיבוע OCT, עם זאת, קשה לשמור על מצב תמיסה נוזלית-מוצקה של isopentane למשך יותר משעה, ו-isopentane אינו תמיד זמין.