Name: מבטל Multi-חור cryovial הקפאת חפצים כאשר השרירים שקועים ישירות בחנקן נוזלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: למדו פרוטוקול הקפאת רקמות שריר בחנקן נוזלי ללא ארטיפקטים קיפאון. השיטה מציגה צנצנת קריוגנית חדשה המונעת אפקט השמיכה של גז חנקן ומשפרת את שלמות הדגימה לניתוח עתידי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (NSFC): 31,301,950 ו 31,671,288.

השיטה הנוכחית כבר נקבעה ומאומתת לקצור ולאחסן יותר מ -1,000 דגימות שריר מכתים היסטולוגית במעבדה שלנו. כל הנהלים הקשורים לטיפול בבעלי חיים ושימוש בעקבות ההנחיות שנקבעו על ידי משרד החקלאות של סין. ציוד 1. עבור אוסף דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית הזהות מדגם על כל בקבוקון קריוגני. הערה: בקבוקון קריוגני תוכנן במיוחד כדי להקפיא דגימות רקמה טריות עבור הליך cryosection (איור 1A). צלוחיות עשויות פוליפרופילן במפעל עובש (איור 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את הציוד הבא: חנקן נוזלי במיכל חנקן נוזלי המתאים, משקפי בטיחות או מגן פנים, כפפות מקפיא, 10 מלקחיים ס&quot;מ, 25 פינצטה ס&quot;מ, צידנית קלקר (מידות פנימיות: 20 ס&quot;מ x 12 ס&quot;מ רוחב x 13.5 ס&quot;מ ; הממדים החיצוניים: 24 ס&quot;מ x 16 ס&quot;מ רוחב x 15 ס&quot;מ), סרט פלסטי (2.5 ס&quot;מ x 0.8 ס&quot;מ רוחב X 0.1 מ&quot;מ עובי),אזמל, וכיסויים מחייב A4 PVC (21 ס&quot;מ x 29.5 ס&quot;מ) (איור 1B). </li></ol> 2. הכנת דוגמאות שרירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הקל-קר עם דק 5 חנקן נוזלי לפני איסוף דגימה. הערה: העמודה הגדולה של חנקן נוזלי היא חיונית כי חלק החנקן הנוזלי שחין משם והופך לגז כאשר דגימות טריות לגעת בו. על מנת להפחית את התדירות של העברת חנקן נוזלי כדי לחדש את ההפסד, מצנן קלקר בגודל מתאים חייב להיות רכשה מראש לפי מספר דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טיפוס מתקבל, בעדינות ומניחים אותו על פיסת A4 PVC מחייב כיסוי ולבחון את הכיוון של סיבי שריר. הערה: הנה, השתמשנו החתך של שריר longissimus דוריס מן הראשונים החוליה המותני האחרונה בחזירים. דגימות עומדים ארוכה 12 ס&quot;מ, 8 ס&quot;מ רוחב, ו 5 ס&quot;מ גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אזמל לעשות שני חתכים מקבילים דרך i הדגימהn בכיוון של סיבי שריר, כ 3 ס&quot;מ אורך ו 0.6 ס&quot;מ זה מזה. חתוך את השריר חרות למלבן כ 0.6 ס&quot;מ x 0.6 ס&quot;מ x גבוה ארוך 1.5 ס&quot;מ. הערה: האמינות של מדידת שטח החתך של סיבי השריר בעיקר תלוי כיוון הסיבים של השריר החרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשו 10 ס&quot;מ מלקחיים לשים המדגם בעדינות על פיסת סרט פלסטי, עם ציר האורך של מקבילים שרירים חרוט אל הקצה הארוך של (איור 2 א) הסרט. הערה: סרט הפלסטיק יש שתי פונקציות: פונקציה חזקה המסייע בתיקון האורינטציה של סיבי שריר ואת תפקיד הדבקה שמונע סדקים במדגם בשל להקפאה מהירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, למקם את רקמת השריר לתוך באמצע התחתון של בקבוקון קריוגני שכותרתו, רק בין החורים מפרצון, ואז בחוזקה מכסה את בקבוקון (איור 2B). </li></ol> מקפיא 3. ומדגם שרירי אחסוןהים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 25 פינצטה ס&quot;מ, במהירות להטביע את הבקבוקון קריוגני כולו בחנקן נוזלי ב הקל-קר טרום מקורר, מחכה עד חנקן נוזלי לא להרתיח (כ 10-20 s). הערה: cryovial יצוף כאשר החנקן הנוזלי רותח, כך בזהירות לטבול את הבקבוקון של חנקן הנוזל רותח במשך 10-20 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות שריר למיכל האחסון בחנקן נוזלי או במקפיא -80 ° C לאחסון ארוך טווח. </li></ol> 4. שקופיות כנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precool cryostat ל בין C ° -20 ו -22 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר וזורקים את הלהב microtome הישן, לנגב בעל סכין צלחת אנטי רול ב cryostat, להתקין להב microtome חדש ב cryostat, ולהגדיר את עובי חיתוך כדי 8 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימת שריר בבקבוקון קריוגני מהמיכל אחסון חנקן נוזלי או -80 ° C במקפיא עד cryostat, והובלתו בחנקן נוזלי או על קרח יבש. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 30 דקות עבור הדגימה לאזן עם הטמפרטורה של cryostat. הערה: כל ציוד שעשויה לגעת הדגימה חייבת להיות טרום מקוררת, בגלל טמפרטורה גבוהה עלולה לגרום להיווצרות גבישי קרח הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר המדגם בעל דגימה תחת ניסוח טמפרטורת חיתוך האופטימלי של glycols מסיס במים שרפים (אוקטובר). חותכים סעיפים 8-מיקרומטר. הערה: כוונן את זווית החיתוך בניצב לכיוון של סיבי השריר, משום CSAF הוא שטח החתך של סיבי שריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בסעיפים לכיוון המרכז של microslide טמפרטורה בחדר. מיד במקום להחליק לתוך קופסת שקופיות במקפיא -80 מעלות צלזיוס. אל תאפשרו את השקופית לייבש ב RT. </li></ol>

<ol><li>Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+fresh+meat+quality+through+manipulation+of+muscle+fiber+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics.</a> Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).</li>
<li>Lefaucheur, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+look+into+fibre+typing--relation+to+meat+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">A second look into fibre typing--relation to meat quality.</a> Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).</li>
<li>Fiems, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+Muscling+in+Cattle%3A+Genes%2C+Husbandry%2C+Carcasses+and+Meat%5BTitle%5D)+AND+%22Animals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat.</a> Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).</li>
<li>Cockett, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+callipyge+mutation+and+other+genes+that+affect+muscle+hypertrophy+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Sel+Evol%22%5BJournal%5D)">The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep.</a> Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).</li>
<li>Stinckens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RYR1+g.1843C%3ET+mutation+is+associated+with+the+effect+of+the+IGF2+intron3-g.3072G%3EA+mutation+on+muscle+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Genet%22%5BJournal%5D)">The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy.</a> Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).</li>
<li>Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+and+hormonal+control+of+skeletal-muscle+cell+growth+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nutr+Soc%22%5BJournal%5D)">Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation.</a> Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).</li>
<li>Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+water+content+in+rats+measured+by+desiccation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue water content in rats measured by desiccation.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).</li>
<li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+triage+and+freezing+for+models+of+skeletal+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), e52793(2015).</li>
<li>Meijer, A. E., Vloedman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histochemical+characterization+of+the+coupling+state+of+skeletal+muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria.</a> Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).</li>
<li>Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201500156343">Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis).</a> Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).</li>
<li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDubowitz%2C+V+%22Muscle+Biopsy%3A+A+Practical+Approach%22">Muscle Biopsy: A Practical Approach</a>. , Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).</li>
<li>Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.elsevier.ca/ISBN/9780702042263/Bancrofts-Theory-and-Practice-of-Histological-Techniques">Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e</a>. , Elsevier. (2008).</li>
<li>Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/222964817_Bubble_Size_in_Coalescence_Dominant_Regime_of_Turbulent_Air-Water_Flow_Through_Horizontal_Pipes">Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe.</a> J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).</li>
<li>Fukutomi, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/kikaib1979/53/496/53_496_3516/_article">A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field.</a> Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).</li>
<li>Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201500029141">Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation.</a> Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים, כספי או אחר, הם הכריזו על ידי המחברים.

כאן, אנו מתארים cryovial החדש, רב-חור להקפאה ואחסון רקמות השריר לבצע הערכות היסטולוגית של תפקוד השרירים. הצעד שונה קריטי פרוטוקול זה הוא כי המדגם של cryovial רב-חור שקוע ישירות בחנקן נוזלי. למיטב ידיעתנו, זוהי הדרך הפשוטה rapidest להשיג דגימות קפואות מצוינות cryosectioning השריר בין שיטות הקפאה הקיימות (ראה את תוצאות הנציג). האתגר הטכני בפני חוקרים שרירים הוא כי גבישי קרח הם סיכוי טובים ביותר להרכיב בעת השימוש מק...

שריר שלד הוא המרכיב היקר ביותר של בעלי חיים לייצור בשר מהנקודה התזונתית ועיבוד של השקפה. בתעשיית הבשר, ישנם שני היבטים קריטיים במיוחד: את היעילות של צמיחת שרירים ואיכות הבשר והתוצאה. כרכיב עיקרי של השריר, סיבי שריר שקשורים באופן ישיר על ביצועי צמיחה ואיכות בשר טרי בחי 1. לדוגמא, המספר הכולל של סיבים (TNF) ואת שטח החתך של סיבים (CSAF) בעיקר לקביעת מסת שריר ואיכות בשר; גם, רכב סוג הסיבים (FTC) בחריפות משפיע איכות בשר טרי 2. לכן, המניפולציה של מאפייני סיב שריר בבעלי חיים היא שיטה יעילה מאוד כדי להגדיל את רווחיות ליבה ואת התחרותיות של משקי 1. נכון להיום, מספר גורמים פנימיים וחיצוניים זוהו לתמרן characterist סיב שרירICS 1. מניפולציה זו יכולה להיות מושגת באמצעות הבחירה של חיות הממוקדות עם גנים ספציפיים, כגון גן מיוסטטין בבקר 3, גן Callipyge בכבשים 4, ואת RYR1 וגני IGF2 בחזירים 5. כמו כן, שליטת דיאטה וטיפולים עם הורמונים ספציפיים לשחק תפקיד חשוב מאפייני סיב שריר 6. לפיכך, גישה משלבת גורמים גנטיים ותזונתיים יוכל לשפר תוכן ואיכות בשר בשר רזה. עם זאת, מחקרים על סיבי שריר מוגבלים תעשיית הבשר משום ההבהרה של המבנה סיבי שריר עדיין מהווה אתגר. תכונות סיב השריר מזוהים באמצעות שיטות histochemical, כגון triphosphatase אדנוזין שרירן (ATPase) assay. שיטה זו מסתמכת על העובדה כי אנזימים הממוקם דקים (6-8 מיקרומטר) קפוא קטעיםסיבי שריר ניתן הגיבו כימי עם מוצרים מסוימים. עם זאת, תכולת המים של שרירים עולה 75% בחזירים, ארנבים, עכברים, ובני אדם, ללא קשר לתפקיד (כלומר, גב, בטן, או hindlimb) 7. לעתים קרובות תוכן לחות גבוה בשרירים גורם לבעיה זו בדרך כלל - הקפאת חפצים - במהלך תקופת ההכנה של cryosections, כפי שתואר לעיל 8, 9. ברוב המקרים, זה כמעט בלתי אפשרי להקפיא כראוי ברקמות שרירות בקו ייצור מטבחיים, על פי הניסיון שלנו. הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה פשוטה ויעילה בשימוש במעבדה שלנו להקפיא רקמות שריר עבור Cryosectioning באופן תפוקה גבוהה. גולת הכותרת של שיטה זו היא cryovial חדש אשר נועד עבור רקמות פלאש-הקפאת שרירים בחנקן נוזלי. זרימת העבודה הנוכחית במקביל יכולה להקל רקמותהקפאה ועיבוד עבור cryosection שרירים מעולה, עם תא ציטופלסמית נראה בבירור ואת הפרד ההדוק של myofibers אל הרקמה שמסביב. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של אפשרויות עבור בדיקת רקמות משום חנקן נוזלי אינו מתערבב עם רקמות.

<table><tbody><tr><td>מיקרוטום קריוסטט</td><td>&nbsp; מיקרוסקופ דיגיטלי Leica</td><td>Leica CM1950</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ניקון</td><td>ניקון DS-U3</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; בקבוקון קריוגני&nbsp; &nbsp; סרט</td><td></td><td></td> פלסטיק <td>מעוצב על ידי עצמנו</td></tr><tr><td>חנקן</td><td></td><td></td> נוזלי <td>בשימוש</td></tr><tr><td>קומומלי אזמל</td><td></td><td></td><td>בשימוש קומומלי</td></tr><tr><td>10 ס"מ מלקחיים</td><td></td><td></td><td>בשימוש קומומלי</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td></td><td></td> 25 ס"מ <td>בשימוש</td></tr> קומומלי <tr><td>זכוכית</td><td></td><td></td> בטיחות כפפות <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>מקפיא בשימוש קומומלי</td><td>בשימוש משותף</td></tr></tbody></table>

מבטל multi-חור cryovial הקפאת חפצים כאשר השרירים שקועים ישירות בחנקן נוזלי

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

מחקרים על פיזיולוגית שרירי שלד להתמודד עם האתגר הטכני של עיבוד הדגימות כראוי להשיג חלקים עם תאי ציטופלסמית נראו בבירור. משוכה נוספת היא למגע ההדוק של myofibers אל הרקמות הסובבות. בגלל התהליך של קיבוע רקמה והטבעת פרפין מוביל ההצטמקות של סיבי שריר, הקפאה היא אמצעי אופטימלי של התקשות רקמת שריר עבור חתך. עם זאת, סוגיה בדרך נתקל, היווצרות של גבישי קרח, מתרחשת במהלך תקופת ההכנה של חלקים קפואים בגלל תכולת מים גבוהה של השריר. הפרוטוקול המובא כאן לראשונה מתאר שיטה פשוטה ויעילה עבור מקפיא כראוי ברקמות שרירות על ידי השיקוע שלהם חנקן נוזלי. הבעיה בשימוש בחנקן נוזלי לבד היא שזה גורם להיווצרות מחסום גז חנקן ליד רקמות, אשר משמש כמבודד ומעכבת את הקירור של רקמות. כדי למנוע זאת השפעה &quot;אדי שמיכה&quot;, התחלה חדשהcryovial w נועד להגדיל את מהירות זרימת הנוזל סביב משטח רקמה. זו הושגה על ידי ניקוב סך של 14 חורים מפרצון בקיר של הבקבוקון. על פי דינמיקת בועה, שיעור גבוה של תוצאות זרימת נוזל בבועות קטנות סיכויים פחות כדי ליצור מחסום גז. כאשר חנקן נוזלי זורם לתוך cryovial דרך חורי המפרצון, מהירות הזרימה סביב הרקמה היא מהירה מספיק כדי לבטל מחסומי גז. לעומת השיטה של ​​הקפאת רקמות שרירות באמצעות איזופנטאן טרום צונן, פרוטוקול זה הוא פשוט ויעיל יותר וניתן להשתמש בו כדי להקפיא שריר באופן תפוקה. יתר על כן, שיטה זו היא אופטימלית עבור מוסדות שאין להם גישה איזופנטאן, המהווה דליק מאוד בטמפרטורת החדר.

איור cryovial וציוד המעבדה המשותף מקפיא שרירים במהלך תקופת ההכנה של חלקים קפואים מוצגים באיור 1. Cryovials עשויים פוליפרופילן במפעל עובש. לכל בקבוקון סך של 14 חורי מפרצון: אחד הוא על הכובע; עוד נמצא בתחתית; ואת הארבע השורות המקבילות 12 הטופס הנותר, כל אחד עם ארבעה חורים ב 90 מעלות זה לזה. חורי מפרצון אלה יכולים להאיץ את מהירות הזרימה של חנקן נוזלי ליד הרקמות כדי למנוע את האפקט &quot;שמיכת אדי&quot; כאשר מגעי חנקן נוזלי הרקמה. כתוצא...

פרוטוקול זה מתאר הליך להקפיא רקמות שרירות על ידי ותקע אותם ישירות לתוך חנקן נוזלי. פרוטוקול זה גם מדגיש cryovial חדש שיכול למנוע את &quot;אפקט השמיכה&quot; של גז חנקן כאשר מגעי חנקן נוזליים על פני שטח הרקמות של דגימה.

מבטל Multi-חור cryovial הקפאת חפצים כאשר השרירים שקועים ישירות בחנקן נוזלי

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקפיא רקמות שריר על ידי טבילה ישירה בחנקן נוזלי תוך מניעת ארטיפקטים של הקפאה. Maozhang He, סטודנט מהמעבדה שלי, ידגים פרוצדורה זו יחד עם Yizhong Huang. לתחילת הדברים, סמנו את זהות הדגימה על כל מבחנה קריוגנית.לאחר מכן, הכינו את הציוד הבא: מיכל חנקן נוזלי, משקפי מגן או מגן פנים, כפפות למקפיא, פינצטה באורך 10 סנטימטר ופינצטה באורך 25 סנטימטר. כמו כן, הכינו קירור קלקר, ניילון נצמד, סכין מנתח וכריכות PVC במידה A4. כדי להכין את דגימות השריר, התחילו במילוי הקירור בחנקן נוזלי.בתוך חמש דקות מקבלת הדגימה, הניחו בעדינות את הדגימה על פיסת כריכת PVC בגודל A4, והתבוננו בכיוון סיבי השריר. לאחר מכן, השתמשו בסכין מנתחים כדי לבצע שני חתכים מקבילים דרך הדגימה בכיוון סיבי השריר, באורך של כ-3 סנטימטרים ובמרחק של 0.6 סנטימטרים זה מזה. גזרו את השריר שנחתך למלבן ברוחב של כ-0.6 סנטימטרים, גובה של 0.6 סנטימטרים ואורך של 1.5 סנטימטרים.לאחר מכן, באמצעות פינצטה של עשרה סנטימטרים, הניחו בעדינות את הדגימה על פיסת ניילון, כאשר הציר האורכי של השריר החתוך מקביל לקצה הארוך של הניילון. הניחו את רקמת השריר בחלק התחתון-מרכזי של מבחנה קריוגנית מסומנת, בדיוק בין חורי הכניסה, וסגרו את פקק המבחנה היטב. כדי להקפיא את דגימת הרקמה, השתמשו בפינצטה של 25 סנטימטרים כדי לטבול במהירות את כל המבחנה הקריוגנית בחנקן נוזלי, בתוך צידנית קלקר שהוקררה מראש, והמתינו עד שחנקן הנוזלי יפסיק לרתוח.כמות החנקן הנוזלי צריכה להיות מספיקה כדי להטביע את כל המבחנה הקריוגנית, והמבחנה הקריוגנית צריכה להיות נמוכה לחלוטין ממפלס הנוזל. העבירו את דגימות השריר למיכל אחסון של חנקן נוזלי, או למקפיא בטמפרטורה של 80- degree celsius לאחסון לטווח ארוך. חשוב למנוע מגע מקרי בין השרירים הקפואים למכלים או למכשירים בטמפרטורת החדר.להכנת השקופיות, קהלו מראש קריוסטט לטמפרטורה שבין 20 °C ל-22 °C. הסירו והשליכו את להב המיקרוטום הישן, ונגבו את מחזיק הסכין ואת לוחית מניעת הגלילה (anti-roll plate) בקריוסטט. לאחר מכן, התקינו להב מיקרוטום חדש בקריוסטט, והגדירו את עובי החיתוך ל-8 µm.הוציאו את המבחנה הקריוגנית עם דגימת השריר ממכל אחסון החנקן הנוזלי, או ממקפיא של 80- מעלות צלזיוס, והניחו אותה בחנקן נוזלי או על קרח יבש. לאחר מכן, העבירו את הדגימה לקריוסטט, והמתינו 30 דקות עד שהדגימה תגיע לשיווי משקל תרמי עם טמפרטורת הקריוסטט. לאחר שיבוץ הדגימה באמצעות OCT, רכבו את הדגימה על תומך הדגימות.לאחר מכן, בצעו חיתוך של פלחים בעובי שמונה מיקרומטרים. הצמידו את הפלחים לעבר מרכז של שקופית מיקרוסקופית בטמפרטורת החדר. הניחו מיד את השקופית לתוך קופסת שקופיות.לאחר מכן, הניחו את קופסת השקופיות במקפיא של 80- degree celsius. אין לאפשר לשקופיות להתייבש בטמפרטורת החדר. כפי שניתן לראות כאן, גבישי קרח נוצרו כאשר דגימה של שריר longissimus dorsi מחזירים הונחה ישירות במקפיא של 80- degree celsius, מה שגרם לאפקט "גבינת השוויצרית" המוכר בפרוזות הקפאות של השריר.גבישי קרח נוצרו גם כאשר רקמת השריר הוטבלה ישירות בחנקן נוזלי. בשיטה אחרת, גבישי קרח רבים דמויי מחט נוצרו במדור הציטופלזמי של סיבי שריר (myofibers) כאשר הרקמה הוטבלה במצע קיבוע OCT בכיוון הנכון, ואז הוקפאה במהירות בתערובת של איזופנטאן. הקפאת הרקמה לתוך קריו-מבחנה בעלת חורים מרובים משיגה שלמות מצוינת של הדגימה, עם מדור ציטופלזמי הנראה בבירור והצמדה הדוקה של סיבי השריר לרקמה שסביבם.באמצעות שיטה זו, נותחה פעילות ה-ATPase בסיבי שריר בעלי כיווץ מהיר ובעלי כיווץ איטי. כאשר ניתנים זמנים שווי ערך, סיבים בעלי כיווץ מהיר נראים בהירים, עם שני דרגות, וסיבים בעלי כיווץ איטי נראים שחורים. בשיטת ההקפאה הסטנדרטית המוצגת כאן, רקמת השריר הושקעה בתמיסה (slurry) של isopentane ללא מגע ישיר עם מדיום הקיבוע OCT, עם זאת, קשה לשמור על מצב תמיסה נוזלית-מוצקה של isopentane למשך יותר משעה, ו-isopentane אינו תמיד זמין.

a-multi-hole-cryovial-eliminates-freezing-artifacts-when-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה, אנו מדגימים שיטת ויטריפיקציה קריוגרפית מהירה במיוחד לשימור דגימות ביולוגיות. השיטה כוללת שימוש בשילוב של cryoprotectants כדי להגן על הרקמה הביולוגית מפני נזקי קיפאון על ידי מניעת היווצרות גבישי קרח תוך תאיים.

שימור בהקפאה מבוסס ויטריפיקציה: טכניקת קירור מהירה במיוחד לשימור דגימות ביולוגיות בטמפרטורות נמוכות מאוד לאחסון לטווח ארוך

סרטון זה מתאר את הליך הקפאת רקמת השריר והשגת החלקים הדקים שלה. הטכניקה יכולה לסייע בחקר קכקסיה הקשורה לסרטן במודלים של עכברים לסרטן המעי הגס.

הקפאה מהירה של רקמת שריר לצורך חיתוך: פרוטוקול להשגת מקטעים דקים במיוחד של רקמת שריר מורין שהוקפאה במהירות

ניתוח רקמות שריר השלד לקביעת תכונות מבניות, תפקודיות וביוכימיות מקל מאוד על ידי הכנה מתאימה.  פרוטוקול זה מתאר שיטות מתאימות להכנת רקמת שריר השלד למגוון רחב של מחקרי פנוטיפ.

Triage רקמות ומקפיאים למודלים של מחלות שרירי שלד

השגת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים באיכות גבוהה היא מאתגרת, במיוחד במקרה של תאי צמחים, שיש להם שפע של ואקואולים גדולים מלאים במים וחללים מאווררים. הקפאה בלחץ גבוה טנדם והחלפת הקפאה מהירה מפחיתים מאוד את זמן ההכנה של דגימות צמחים ל-TEM תוך הפקת דגימות עם שימור אולטרה-מבני מעולה.

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

כאן אנו מדגימים את השיטות היעילות ביותר להקפאה, הטמעה, הקפאה וצביעה של ביופסיות שריר כדי למנוע הקפאת חפצים.

עשה ואל תעשה בהכנת השריר cryosections לניתוח היסטולוגית

כתב יד זה מתאר שיטה קלה לשימוש בעלות הנמוכה cryofixation המאפשרת הדמית תאי השעיה ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים.

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

קריו-סעיפים רצופים נאספים כדי לאפשר יישומים היסטולוגית והעשרה של RNA למדידות ביטוי גנים באמצעות אזורים סמוכים מתוך שרירי שלד יחיד עכבר. RNA באיכות גבוהה מתקבל מ 20 - 30 מ"ג של cryosections ומדידות ונקווה מושווים ישירות בין יישומים.

Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית

מוצג כאן פרוטוקול להעברה קריוגנית של דגימות קפואות לזווית הקסם הדינמית של הקיטוב הגרעיני (DNP) המסתובב (MAS) גשושית תהודה מגנטית גרעינית (NMR). הפרוטוקול כולל הוראות לאחסון רוטור לפני הניסוי וכיוונים למדידות כדאיות לפני ואחרי הניסוי.

דגימה קריוגנית נטענת לתוך זווית קסם ספינינג ספקטרומטר תהודה מגנטית גרעינית המשמרת את הכדאיות התאית

כתב יד זה מתאר את שיטת הכתם וצלילה להקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד.

הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד

פרוטוקול זה מתאר מודל תרבית תלת מימדי חדש (3-D) המשתמש בהידרוג'ל היאלורונן המקושר לטירמין כדי לעטוף ולתרבית זקיקים פרה-אנטרליים משחלת העכבר. אנו מפרטים גם שתי גישות לשימור הקפאה של זקיקי השחלות על ידי ויטריפיקציה.

יישום של הידרוג'ל היאלורונן חדשני לתרבית זקיקים תלת מימדית ומתודולוגיה לשימור הקפאה של זקיקי שחלות עכבר

למדו פרוטוקול הקפאת רקמות שריר בחנקן נוזלי ללא ארטיפקטים קיפאון. השיטה מציגה צנצנת קריוגנית חדשה המונעת אפקט השמיכה של גז חנקן ומשפרת את שלמות הדגימה לניתוח עתידי.

מבטל Multi-חור cryovial הקפאת חפצים כאשר השרירים שקועים ישירות בחנקן נוזלי

גלה סרטונים נוספים