שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא
13 ביוני 2017
כל תא הקלטות של תסיסנית melanogaster photoreceptors לאפשר מדידה של ספונטני בליטות כהה, בליטות קוונטיות, תגובות מאקרוסקופיות לאור, ואת המתח הנוכחי היחסים בתנאים שונים. בשילוב עם ד melanogaster כלים מניפולציה גנטית, שיטה זו מאפשרת את המחקר של inositol- השומן ליפיד המסלול נתיב היעד שלה, ערוץ TRP.
המטרה הכללית של הליך זה היא להשיג רישומי סגירת מתח (voltage clamp) של התא השלם מתא פוטורצפטור בודד, כדי למדוד זרמים המושרים על ידי אור הנובעים מבליעה של פוטון בודד ומתגובות חוזרות לאור עז. שיטה זו יכולה לסייע בטיפול בנושאים מרכזיים בתחום ההעברה החושית, כגון התעתוק הראייתי עבור המנגנונים הפיזיים והיוניים העומדים בבסיס הפוטוטרנסדוקציה, ומאפייני תעלות TRP. היתרונות בשימוש בטכניקה זו כוללים שליטה מלאה במתח הממברנה, יחס אות-רעש גבוה ביותר והיכולת להחדיר אינדיקטורים ספציפיים למדידות אופטיות.
בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקשו עם גודלה הזעיר של הדגימה ועם הצורך לבצע את הניתוח במהירות בשל פגיעות מטבולית תלוית-זמן. לצורך הליך זה, יש לגדל זבובים בצפיפות של כ-20 למבחנה. בעת הניסוי, יש להכין מספר מבחנות עם בובות העומדות להיסגר, אשר שהו בחשכה רציפה למשך 24 שעות לפחות.
שעתיים לפני איסוף הפרטים הבוגרים, הסירו את כל הבוגרים שכבר בקעו. טיפלו ב flies שהותאמו לחושך תמיד תחת תאורה של אור אדום. בזמן ההמתנה לבקיעת זבובים טריים, הכינו את תא ההקלטה.
הדביקו את כיסוי הזכוכית (coverslip) לתחתית התא באמצעות פאראפין מומס או גריס סיליקון לוואקום גבוה כדי להשלים את בניית האמבט. לאחר מכן, חברו את האמבט לשולחנה של המיקרוסקופ ההפוך. הכניסו לתוך האמבט את צינור מערכת הפרפוזיה, את צינור מערכת השאיבה ואת חוט ההארקה עבור מערך האלקטרופיזיולוגיה.
לפני תחילת הנתיחה, הכינו מספר תמיסות בגב של צלחת פטרי בקוטר 60 מילימטר. טפטפו ארבע טיפות נפרדות של ES נטול סידן וטיפה אחת של TS. כעת, בעזרת פינצטה גסה, תפסו זבוב שזה עתה בקע על ידי כנפיו או גופו. לאחר מכן, בעזרת פינצטה עדינה, נתקו את הראש והעבירו אותו במהירות לטיפה הראשונה של ES נטול סידן. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, נתחו את הראש לחצי לאורך המישור הסגיטלי בעזרת זוג שני של פינצטה עדינה.
וודאו ששתי העיניים נותרו שלמות. כעת העבירו חצי מהראש לטיפת ES שנייה נטולת סידן, ואת החצי השני של הראש לטיפת ES שלישית נטולת סידן. לאחר מכן המשיכו בניתוח של אחת משתי העיניים.
באמצעות פינצטה עדינה, הסר כמה שיותר מרקמה מסביב לעין כדי להבטיח שלא ייגרם נזק לרשתית. לאחר מכן, אחז בחוזקה בקצה הקרנית באמצעות פינצטה עדינה והוצא החוצה את הרשתית. התוצאה צריכה להיות קרנית ריקה ושלמה המופרדת מרשתית שלמה.
הפיפטות נשמרות באתנול, לכן, בעת שימוש בפיפטת טריטורציה חדשה, יש לשטוף אותה תמיד במים תחילה. כעת מלאו את הפיפטה השטופה בנפח קטן של ES נטול סידן, החל מהטיפה הרביעית. לאחר מכן, באמצעות שאיבה עדינה עם הפה, שאבו את הרשתית המבודדת לתוך הפיפטה.
יש להימנע מלכוד בועות אוויר בזהירות רבה. לאחר מכן, העבירו את הרשתית לתוך טיפת ה-TS. בשלב הבא, חזרו על בידוד הרשתית בעין השנייה, כך ששתי הרשתיות יהיו כעת בטיפת ה-TS. לאחר מכן, נגבו בעדינות רק את ה-ES נטול הסידן מפתיח Petri והוסיפו שש טיפות נוספות של TS לפני השטח של הצלחת.
העבירו את שתי הרשתות לעטיפות חדשות של TS. לאחר מכן, החליפו את פיפטת הטריטורציה בפיפטה בעלת פתח בעל קוטר קטן. לאחר שטיפה של הפיפטה, מלאו אותה בטיפה של TS. באמצעות פיפטה זו, בצעו שאיבה והזרקה מהירות וחוזרת של שתי הרשתות כדי להפריד חלק מה-ommatidia מתאי הפיגמנט. ה-TS יעכיר ככל שפעולה זו תתרחש.
בשלב הבא, העבירו את שאריות שתי הרשתות לטיפה נוספת של TS. לאחר מכן, שאבו לבבונבט את טיפת ה-TS העכורה המכילה את האומטידיה המבודדים. פלטו את התמיסה אל תוך תא הרחצה. חזרו על הליך זה עם פיפטות טריטורציה בעלות קוטר קטן יותר ויורד, עד לרשת תתמוסס לחלוטין.
כעת, המתינו דקה אחת. במהלך הפסקה זו, האומטידיה (ommatidia) המבודדים ייקשרו לתחתית התא. לאחר דקה, התחילו להזרים ES המכיל 1.5 millimolar סידן באמצעות מערכת הפרפוזיה.
בעת מילוי התא, ודאו שחוט ההארקה וצינור השאיבה טבולים. אפשרו לתמיסה לזרום במשך 60 עד 90 שניות לפני ההמשך. כדי להתחיל, השתמשו בעדשה של 40x כדי לבחון בזהירות את האומטידיה (ommatidia) באמבט.
שימו לב כי גופי התאים המוארכים של הפוטורצפטורים המרכיבים את האומטידיום מנותקים מהאקסונים שלהם אך נותרים חיוניים. כעת בחרו אומטידיום מתאים לניסוי. בצעו את הבחירה כאשר הוא עומד בקריטריונים הבאים.
המעטפת החיצונית חייבת להיות חלקה ושלמה. הציר הארוך חייב להיות כמעט בזווית ישרה ביחס לגישת האלקטרודה מהצד הדיסטלי. כמו כן, האומטידיום לא צריך להיות מוקף ברקמה עודפת כלשהי.
לאחר הבחירה, מרכזו את האומטדיום (ommatidium) בשדה הראייה. כעת מלאו פיפטה בתמיסה התאי-פנימית המתאימה לניסוי, והצמידו את הפיפטה למחזיק האלקטרודה.
לאחר מכן, נשפו לתוך צינור הפ pipette כדי ליצור לחץ חיובי ונעלו את הלחץ על ידי סגירת שסתום הצינור. כעת, הכניסו את ה-pipette לתא הרחצה והנחיתו אותה קרוב למקטע הדיסטלי של ה-ommatidium עד שתיראה שקע קטן בממברנה, הנובע מהלחץ החיובי של ה-pipette המחוברת. כעת פתחו את מודול בדיקת הממברנה בתוכנת ההקלטה כדי להחיל פולסי מתח מרובעים רציפים של 2 mV בקצב של 100 Hz.
בשלב הבא, באמצעות בקרים של מגבר ה-patch clamp, הגדירו את פוטנציאל הצומת (junction potential) לאפס, כדי להגדיר את בסיס פעימת הריבוע (square pulse) לזרם אפס. לאחר מכן, פתחו את השסתום כדי לשחרר את הלחץ בפיפטה ושאבו בעדינות כדי ליצור לחץ שלילי. הפיפטה אמורה כעת להיצמד לממברנת התא.
ברגע שזה קורה, סגרו את השסתום כדי לנעול את הלחץ. כעת בדקו את התנגדות האלקטרודה. היא אמורה לעלות לערך שבין 100 ל-150 megaohms.
לאחר מכן, שחרר את הלחץ השלילי בפיפט על ידי פתיחה חוזרת של השסתום. ההתנגדות צריכה כעת לקפוץ לערך שבין ג'יגה-אוהם אחד לשניים, דבר המעיד על היווצרות C בין הפיפט לתא. לאחר מכן, באמצעות מגבר ה-patch clamp, בצע קיזוז (offset) לזרם הקבל של הפיפט.
כדי להגיע לתצורת תא שלם (whole-cell configuration), יש לשבור את ממבט התא באמצעות שאיבה עם הפה. צור פרצי לחץ שלילי קצרים, מהירים וחזקים בתוך האלקטרודה. עם השגת תצורת התא השלם, תתרחש עלייה פתאומית בקיבול (capacitance).
לאחר מכן, באמצעות מגבר ה-patch clamp, הגדירו את פוטנציאל ההחזקה למתח הנדרש ובצעו קיזוז של זרמי הקיבול (capacitive currents) בהתנגדות טורית. כעת סגרו את הווילון השחור של כלוב פאראדיי והתחילו בניסוי. לאחר השגת קונפיגורציית תא שלם (whole-cell) באמצעות פיפטת patch המכילה את הצבע הפלואורסצנטי, Lucifer yellow, ניתן לראות שרק אחד מהפוטורצפטורים המרכיבים את האומטידיום נטען בצבע.
פוטורספטור זה יהיה מבודד חשמלית משכניו באומטידיום. אומטידיה עם קיבוע מתח של תא שלם (Whole-cell voltage clamped) מזבובים מסוג בר (wild type) ומזבובים עם מוטציות בגנים InaC או InaD הראו בליטות קוונטיות (quantum bumps) בתגובה לאור עמום רציף. סיום איטי של הבליטות נצפה בשני המוטנטים ביחס לזבובים מסוג בר.
התגובות הנורמליזציה לפולסי אור של 500 מילי-שניות שסופקו ב-150,000 פוטונים לשנייה ממחישות בצורה ברורה את הפיזיולוגיות השינויות. באמצעות ההכנה, ניתן היה אפילו למדוד תגובות "quantum bump" בקיבוע מתח של התא השלם לאור עמום קצר של מילי-שנייה אחת. תגובות פוטון בודד כאלה הושוו בזבובים מסוג wild type, במוטנטים של arrestin ובמוטנטים של ninaC.
שני המוטנטים הגיבו ברצף של בליטות. תגובות מנורמלות לפולס אור של 500 מילישניות שסופק ב-15,000 פוטונים לשנייה. לפיכך, סיום איטי של התגובה המקרוסקופית נצפה במוטנטים של arrestin-2 ו-ninaC.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד לבצע הקלטות מתאי-שלמים (whole-cell recordings) מתאי פוטורספטורים של Drosophila. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים להבין טוב יותר את תעלות ה-TRP ואת העברה של אותות ליפידי אינוזיטול, כמו גם את תפקידם של תאי גנגליון רשתים רגישים לאור באופן טבעי הנמצאים ביונקים, המעורבים בפעילויות תלויות-אור שאינן יוצרות תמונה.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה להקלטות של קיבוע מתח של תא שלם (whole-cell voltage clamp) מקולטני אור של Drosophila melanogaster. הטכניקה מאפשרת מדידה של זרמים המושרים על ידי אור וחקר של מנגנוני פוטוטרנסדוקציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- פוטוטרנסדוקציה
רקע
- Drosophila melanogaster משמש כאורגניזם מודל לחקר התמרות חושיות.
- הקלטות של תא שלם (Whole-cell recordings) מספקות תובנות לגבי המנגנונים היוניים של התמרות אור.
- תעלת ה-TRP היא יעד מרכזי במסלול השליח של אינוזיטול-ליפידים.
- הבנת מנגנונים אלו היא חיונית להבהרת העיבוד הוויזואלי.
מטרת המחקר
- למדידת bumps כהים ספונטניים ו-quantum bumps בפוטורצפטורים.
- לחקירת תגובות מקרוסקופיות לאור תחת תנאים מבוקרים.
- לבחינת התכונות של תעלות TRP בהקשר של טרנסדוקציה חושית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של Drosophila melanogaster תחת תנאים ספציפיים.
- דיסקציה של תאי פוטורצפטורים לצורך רישומי whole-cell.
- יישום של טכניקות voltage clamp למדידת זרמים יוניים.
- שימוש בתמיסות ספציפיות לשמירה על חיוניות התאים במהלך הניסויים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של אומאטידיות (ommatidia) לצורך אנליזה אלקטרופיזיולוגית.
- מדידה של זרמים מושרי אור ומאפייניהם.
- הדגמת היתרונות של יחס אות לרעש גבוה בהקלטות.
- תובנות לגבי התכונות התפקודיות של תעלות TRP בתהליך הפוטוטרנסדוקציה.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה חסונה לחקר התמסור הפוטוני (phototransduction) ב-Drosophila.
- הממצאים תורמים להבנת מסלולי איתות תחושתיים.
- ניתן להחיל טכניקה זו כדי לחקור באופן מעמיק יותר את תפקידם של תעלות TRP.
שאלות נשאלותFrequently Asked Questions
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה אלקטרופיזיולוגית זו מאפשרת מדידה מדויקת של זרמים המושרים על ידי אור בפוטורצפטורים של Drosophila, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מנגנונית של מטרות ערוצי TRP במסלולי התעתוק הוויזואליים. יחס אות לרעש הגבוה והבקרת המתח מספקים ביטחון ניבוי לתיקוף מטרות בשלבי הגילוי המוקדמים, במיוחד עבור מודולטורים של ערוצי יונים. הגישה מקלה על הערכה כמותית של השפעות תרכובות על תגובות לפוטון בודד, ובכך מסייעת בקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) במיון תיקי הפיתוח הפרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של תפקוד תעלות TRP ומנגנוני איתות של אינוזיטול-ליפיד ברזולוציית מולקולה בודדת.
- ערך תפעולי: מספק קריאות כמותיות של זרמים יחידתיים ומקרוסקופיים לצורך הערכת מעורבות המטרה (target engagement).
- ערך אסטרטגי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים של מטרות פוטוטרנסדוקציה באמצעות מדידה ישירה של תגובות מושראות באור.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר מדידות הדירות בעלות נאמנות גבוהה של זרמים ספונטניים וזרמים מושרי-אור לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מאפשר יישום ושטיפה מהירים של תרכובות לאפיון תגובת מינון-מענה באומטידיה (ommatidia) מבודדות.
- ערך אסטרטגי: מקל על המוכנות לסריקת מודולטורים של קינטיקה של תעלות יונים והגבר של התמרה פוטית (phototransduction gain).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: ביסוס של מערכת רלוונטית למחלה לצורך חקר מנגנוני פוטוטרנסדוקציה שמורים, עם השלכות על הפרעות רטינאליות בבני יונקים.
- ערך תפעולי: תמיכה ברצף מהשלב של תיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, באמצעות ביולוגיה שמורה של תעלות TRP.
- ערך אסטרטגי: סיוע בקבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון על ידי כימות של הצלה תפקודית ברקעים מוטנטיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת מדדים אלקטרופיזיולוגיים כמותיים המגשרים בין מניפולציה גנטית לבין פלט תפקודי במסלולי התמרות תחושתיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבחינת השערות לגבי תפקיד תעלות TRP בתהליך הפוטוטרנסדוקציה באמצעות מדידה ישירה של זרם.
- סריקה: מאפשר פיתוח של בדיקה (assay) עבור תרכובות המשפיעות על התדירות והאמפליטודה של ה-quantum bump.
- אנליזה: מספק מדידות מדויקות של זרמים מושרי אור וטרנזיינטים קיבוליים לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים ב-Drosophila לביולוגיה של תעלות TRP ביונקים באמצעות מנגנוני סיגנלינג שמורים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לאפיון תעלות יונים במגוון מוטנטים של פוטוטרנסדוקציה ובתנאים פרמקולוגיים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות מדידות עם יחס אות לרעש גבוה של אירועים יחידתיים.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות נהלי דיסקציה, פרפוזיה ו-voltage clamp סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: מפחית עמימות מכניסטית בגילוי תרופות לתעלות יונים על ידי בידוד תגובות של פוטון בודד.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודף מונחה-נתונים של מודולטורים של תעלות TRP בהתבסס על קינטיקת quantum bump ופרופילים של זרם מקרוסקופי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, מיקרו-כירורגיה וטיפול ב-Drosophila בתנאי הסתגלות לחושך.
- תלוי במערכות פרפוזיה יציבות, מגברים בעלי רעש נמוך ומיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה לצורך ויזואליזציה של אומטידיה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת תמיסות, הכנת פיפטות ובקרות סביבתיות.
- כולל שיקולי התאמה עבור זני מוטנטים שונים ופרוטוקולים של טעינת צבעי אינדיקטור.
- מוגבל בשל פגיעות מטבולית של הדגימות, מה שדורש דיסקציה מהירה וחלונות זמן ניסויים קצרים.
