Name: הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: למד שיטה כמותית להערכת השטף האוטופגי באמצעות מדידת שיתוף מקום של LC3, p62 ו-LAMP1 בזרימת ציטומטריה עם הדמיה מולטי-ספקטרלית. הטכניקה מאפשרת זיהוי אובייקטיבי וסטטיסטי של תת-אוכלוסיות תאים ושינויים עדינים בתהליך האוטופגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אני רוצה להודות לעמיתים לעבודה במיליפור סיגמה, פיליפ ג &#39;מוריסי ושרי ל&#39;, על תמיכתם והדרכתם לאורך השנים. אני גם רוצה להודות Vidya Venkatachalam ו בריאן ר דוידסון על עזרתם עם תכונה BDC3 בתוכנה IDEAS , ראיין פ Jessup לעזרה בעריכת כתב היד הזה, ריימונד קונג לעזרה ביום הירי, תודה מיוחדת לך האמן סינתיה Xamonthiene.

<ol><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+by+self-digestion%3A+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li>
<li>Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+should+autophagic+flux+be+assessed%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Why should autophagic flux be assessed?</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).</li>
<li>Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18425443">LC3 and Autophagy.</a> Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).</li>
<li>Larsen, K. B., Lamark, T., Øvervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bjørkøy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reporter+cell+system+to+monitor+autophagy+based+on+p62%2FSQSTM1%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1.</a> Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).</li>
<li>Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+flow+cytometry+for+measurement+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Applications of flow cytometry for measurement of autophagy.</a> Methods. 75, 87-95 (2015).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+mammalian+autophagy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).</li>
<li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC-mediated+transgenic+expression+of+fluorescent+autophagic+protein+Beclin+1+reveals+a+role+for+Beclin+1+in+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development.</a> Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).</li>
<li>Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+death+pathways+in+desmin-related+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy.</a> Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).</li>
<li>Altman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+essential+to+suppress+cell+stress+and+to+allow+BCR-Abl-mediated+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis.</a> Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).</li>
<li>Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gammaherpesvirus+68+infection+of+endothelial+cells+requires+both+host+autophagy+genes+and+viral+oncogenes+for+optimal+survival+and+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence.</a> J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).</li>
<li>Tra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li>
<li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li>
<li>Leveque-El Mouttie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+required+for+stem+cell+mobilization+by+G-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF.</a> Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).</li>
<li>Watson, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+limits+proliferation+and+glycolytic+metabolism+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia.</a> Cell Death Discov. 1, 15008(2015).</li>
<li>Stranks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+Controls+Acquisition+of+Aging+Features+in+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages.</a> J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).</li>
<li>Clarke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+activated+in+systemic+lupus+erythematosus+and+required+for+plasmablast+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development.</a> Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).</li>
<li>Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+assays+for+the+study+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric assays for the study of autophagy.</a> Methods. 82, 21-28 (2015).</li>
<li>Bjørkøy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p62%2FSQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).</li>
<li>Phadwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+autophagy+detection+in+primary+cells%3A+Impaired+levels+of+macroautophagy+in+immunosenescent+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells.</a> Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).</li>
<li>Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+autophagosomes+and+autolysosomes+in+cells+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).</li>
<li>Kwok, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HspB8+mutation+causing+hereditary+distal+motor+neuropathy+impairs+lysosomal+delivery+of+autophagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes.</a> J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).</li>
<li>Lopez-Herrera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleterious+Mutations+in+LRBA+Are+Associated+with+a+Syndrome+of+Immune+Deficiency+and+Autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity.</a> Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).</li>
<li>Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF4+orchestrates+a+program+of+BH3-only+protein+expression+in+severe+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia.</a> Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).</li>
<li>Pike, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+up-regulation+of+ULK1+by+ATF4+contributes+to+cancer+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival.</a> Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).</li>
<li>Pugsley, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+autophagy%3A+Measuring+LC3+puncta+and+autolysosome+formation+in+cells+using+multispectral+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry.</a> Methods. 112, 147-156 (2017).</li>
<li>IDEAS. <a target="_blank" href="https://www.amnis.com/images/PN_780-00959-00_RevC_IDEAS_User_Manual.pdf">Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2</a>. , (2015).</li>
</ol>

אני מועסק על ידי MilliporeSigma, יצרנית של ImageStream המותג Amnis, אשר שימש במחקר זה.

בעת ביצוע ניתוח זה, יש כמה דברים לשקול. חשוב שיהיה דגימות בקרה מתאימות. עבור ניסוי זה, שני בקרות שונות שימשו: שליטה ובקרה + Chloroquine. מדגם הבקרה שימש לקביעת הסף עבור האזורים. הוא מייצג את רמת הבסיס של autophagy מבלי לעצור השפלה ליזוזומלית היא שליטה על המדגם מורעב. עם זאת, מדגם בקרה אינו שליטה נאותה להשוות עם התוצאות מדגם מורעב + כלורוקווין כי chloroquine עצמה משפיעה על מדגם שליטה. לכן, היה צורך להיות מדגם + כלורוקואין בקרה. לפני ביצוע כל ניתוח עבור autophagy, חשוב לנתח רק / שער על תאים בודדים ממוקדים ( כלומר, RMS שיפוע גדול מ -60), כמו התוצאות יכול להיות מושפע אם יש יותר מתא אחד או התמונות לא ממוקד. זה חיוני כי autophagosomEs ו lysosomes ממוקדים ספירת ספוט הנכון ניתוח BDC3. תאים אפופטוטיים יש להסיר לפני ניתוח autophagy, כפי שהם עשויים להטות תוצאות ולא צריך להיכלל. לא צריך להיות מכתים המתאים לכל שלושת הסמנים ( כלומר, LC3, p62, LAMP1). לדוגמה, כל שלושת הסמנים הם תאיים, ויש להם אות נקודתי; אם האות לא לדקלם, או אם הוא על פני השטח של התא, מכתים לא יהיה מתאים את הניסוי / מכתים צריך להיות משוחזר. בנוסף, עבור BDC3 להיות מדויק, זה חיוני השער על תאים בהירים עבור כל שלושה סמנים ניאון של עניין. Gating על אירועים חיוביים יש צורך למנוע את המדידה של BDC3 על שאינם ספציפיים מחייב, הדמיה artifacts, ו / או רעש. זה חיוני, כמו BDC3 יכול פוטנציאל להגביר artifacts שאינם אותות אמיתי. מאז BDC3 יכול להתבצע רק על אירועים חיוביים בהירים, תאים רבים עשויים שלא להיכלל בניתוח הסופי; זה especEly נכון לתאי בקרה שאין להם הצטברות של LC3, p62 ו / או LAMP1. לפיכך, הגבלה של assay זה הוא BDC3 רק בוחן תאים חיוביים עבור כל שלושת הסמנים, אשר עשוי שלא להיות מתאים לכל הניסויים autophagy. כמו BDS, אשר כבר דווחו בעבר 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 לבדו אינו לוקח בחשבון את מספר האורגנים autophagy שיתוף מקומי, וכתוצאה מכך במידה רבה של השתנות במספר האוטופגוזומים. לכן, הגישה הדו-כיוונית שהציג ראג&#39;אן ואח &#39; היה מועסק. בהסתכלות על המגרשים הדו-פעמיים, אפשר לשאול אםהתאים חייבים להיות חיוביים עבור LC3, p62 ו- LAMP1; למה יש כל כך הרבה תאים שיש להם 0 נקודות? הסיבה לכך היא כי האות LC3 עשוי להיות בהיר מספיק עבור שיתוף לוקליזציה, אבל זה לא יכול לענות על סף שנקבע על ידי מסיכת שיא (שיא (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) זה נחוץ כדי להיחשב לְזַהוֹת. הפרוטוקול שהוצג כאן השתמשו MIFC לספור LC3 puncta ואת שיתוף לוקליזציה של שלושה סמנים autophagy למדוד שטף autophagic. בתנאים הבסיסיים (מדגם בקרה), מספר האוטופגוזומים היה נמוך, ומעטים נמצאו תאים עם &quot;נקודות גבוהות&quot;. עם תוספת של chloroquine, אשר מעכב היתוך אוטופאגוזום / lysosome, חלה עלייה במספר כתמים LC3. מאז lysosome אינו מסוגל לשבור את autophagosome ואת p62, אשר מתגורר autophagosome, זה מוביל לעלייה של לוקליזציה של LC3, p62, ו LAMP1 autolysosome הצטברות. השפעה זו היתה מוגברת תחת starvat מזיןיון, אשר גורם autophagy. עם זאת, ללא תוספת של chloroquine, לא היה גידול משמעותי במספר autophagosomes, ככל הנראה בשל עלייה בשיעור של autophagic מחזור. כאשר התאים רעבו בנוכחות כלורוקין, חלה עלייה בלוקליזציה המשותפת ובמספר האוטופגוזומים, התומכת במסקנה שהרעבה מגבירה את השטף האוטופאגי. EBSS ידוע כגורם חזק של autophagy. לכן, צפוי כי הגידול יהיה גדול. אם שיטה אחרת, כגון אינדוקציה של סמים, משמשת להפקת אוטופאגי, ההבדל בין הדגימה לשליטה והדגימה עשוי להיות מתוחכם יותר. פרוטוקול מסוים זה נועד למדוד autophagy שורות תאים אנושיים, אבל assay יכול להיות מותאם למינים אחרים על ידי מעבר נוגדנים עבור מינים מסוימים. בנוסף, שיטת הניתוח יכול לשמש עבור כל יישום תאיים הדורש שיתוף לוקליזציהשל שלושה בדיקות / סמנים.

Macroautophagy, המכונה להלן autophagy, הוא מסלול קטבולית שבה רכיבים פגומים או מתפקדת, חלבונים ארוכי טווח, ואת האברונים מושפלים באמצעות lysosome ו ממוחזרים 1 . Autophagy הוא תהליך דינמי, רב-כיווני הכולל את היווצרותו של אוטופגוזום; את ההיתוך של האוטופגוזום עם הליזוזום, שיצר את האוטוליזוסום; ואת השפלה של התוכן של autolysosome 2 . סמן ביולוגי חיוני המשמש לזיהוי autophagy במערכות יונקים הוא חלבון המשויך microtubule 1A / 1B-Light שרשרת 3 (LC3), המהווה את הממברנה האוטופאגוסומלית. במהלך autophagy, cytosolic LC3-1 הוא מצומדות כדי phosphatidylethanolamine כדי ליצור LC3-II; LC3-II משולב אז לתוך קרום autophagosal 3 . סמן נוסף בשימוש נרחב עבור השטף autophagic הוא autophagy receptor sequestosome 1 (SQSTM1, p62) אשר פיזית liמטען אוטופאגית אל הממברנה האוטופאטית 4 , 5 . שיטות אשר שימשו באופן מסורתי למדוד autophagy הם כתמים המערבי מיקרוסקופ פלואורסצנטי 7 . עם זאת, אף אחת משיטות אלה נחשבים &quot;תקן הזהב&quot; , 2 , 6 כמו ישנם אתגרים הקשורים בשתי הטכניקות הללו. כתמים מערביים נותנים רק בממוצע משום שהם משתמשים במדגם הומוגני, כך שצופים לא יכולים לראות מה קורה בתאים בודדים. מצד שני, מיקרוסקופ פלואורסצנטי נותן מידע צופה ברמה אחת התא, אבל זה חסר יכולות התפוקה, מה שהופך אותו קשה להשיג אובייקטיבי הערכות סטטיסטית קפדנית. בשנים האחרונות, את המדידה של LC3 ו p62 על ידי cytometry זרימת multispectral הדמיה (MIFC, ראה טבלה של חומרים ) כבר צובר popuLarity בשל כוח כמותי, יכולות תפוקה גבוהה, פוטנציאל ריבוב, ואת היכולת התמונה כל תא. אחת השיטות הנפוצות ביותר למדידת autophagy באמצעות MIFC, יחד עם תוכנת ניתוח לוויה שלה (ראה טבלה של חומרים ), היא באמצעות ספירת ספוט של LC3 puncta או autophagosomes 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . עם זאת, עלייה autophagosomes לא בהכרח אומר כי קיימת עלייה autophagy, כפי שהוא יכול גם לייצג המצור בתהליך 2 . מחזור LC3-II הוא פרמטר שימושי למדוד שטף autophagic על ידי ניתוח תאים בנוכחות והיעדר מעכב השפלה ליזוזומלית, כגון כלורוקין. Chloroquine מעכב את היתוך של autophagosome כדי lysosome, ובכך לאפשר את quantitation של היווצרות autophagosome כמדד של מידת autophagy על ידי עצירת השטף autophagic לפני השפלה lysosomal יכול להתרחש 18 . בנוסף, p62 הוא מושפל בעיקר על ידי autophagy, ואם השפלה ליזוזומלית של autophagosome ותכולתו חסומה, הצטברות של p62 צפוי 17 , 19 . Autophagy הוא תהליך multistep, ואת המדידה של LC3 או p62 לבד אינו מספק תמונה מלאה של מה שקורה בתאים. פרסומים אחרונים הדגישו את הצורך לבחון את התהוות בו זמנית של autolysosome 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC הואבאופן ייחודי מסוגלים למדוד את ההיווצרות של autolysosome ידי הדמית שיתוף הלוקליזציה של autophagosome אל 15 הליזוזום - 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. בנוסף, שיתוף לוקליזציה של p62 ו LC3 באמצעות MIFC יש גם נחקרו למדוד שטף autophagic 5 . בתוכנה ניתוח הפניה, &quot;תכונה&quot; זה מודד שיתוף לוקליזציה נקרא &quot;פרט מפורטת הדמיון R3&quot; (BDS) ו תוכנן במיוחד כדי להשוות את הפרטים הקטנים, התמונה בהירים של שתי תמונות. BDS הוא מקדם המתאם של Pearson המתאם ביומן של נקודות האור המצויות עם רדיוס של 3 פיקסלים או פחות; במילים אחרות, BDS מחשבת את מידת oוריקלינג פיקסלים משני ערוצי ניאון שונים. נקודות האור הן מתואמות ( כלומר, מיקום מרחבי זהה) או בלתי מתואמות ( כלומר, מיקומים מרחביים שונים). לכן, מקדם המתאם משתנה בין 0 (לא מתואם) לבין 1 (קורלציה מושלמת). מקדם הוא יומן- transformed כדי להגדיל את טווח בין אפס לאינסוף 26 , 27 . BDS לבדה לא יכול להיות מספיק; Rajan et al. נמצא כי שימוש רק BDS יכול להוביל לתוצאות חיוביות שגויות או שגויות שלילי 21 . BDS מעריך את שיתוף לוקליזציה של שני סמנים של autophagy אבל לא מחשיב את מספר autophagosomes. כדי להסביר את מספר autophagosomes, Rajan et al. כללה ספירת ספוט של LC3 puncta 21 . Rajan et al. המוצע באמצעות פיזור bivariate העלילה של ספירה LC3 ספוט לעומת BDS. באמצעות העלילה דו-שנתית זו, שתי אוכלוסיותE מזוהה הראשון: אחד עם תאים בעלי רמה גבוהה של כתמים LC3 ואחד עם תאים בעלי רמה נמוכה של כתמים LC3. אוכלוסיית הנקודה הגבוהה של LC3 סווגה לשתי אוכלוסיות: תאים עם לוקליזציה משותפת נמוכה ( כלומר, הצטברות של אוטופגוזומים) ותאים בעלי לוקליזציה גבוהה ( כלומר, הצטברות של אוטוליזוזומים). זו העלילה bivariate מאפשר להבחין בין תאים עם מעט מאוד autophagosoms ותאים עם הצטברות של autophagosomes ו / או autolysosomes 21 . עד כה, לוקליזציה משותפת של LC3, p62, LAMP1 (סמן lysosomal) לא היה אפשרי באמצעות &quot;סוג תכונה&quot; יחיד בתוכנת ניתוח לוויה MIFC (ראה טבלה של חומרים ). עם זאת, תכונה חדשה, הציג לאחרונה בגירסה 6.1, נקרא Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 משווה את התמונות פירוט בהיר מכל אחת משלוש התמונות (במקרה זה, LC3, p62, ו LAMP1) וכימות co-localization של שלושה בדיקות ( כלומר, LC3, p62, LAMP1). תכונה BDC3 מחשב את מקדם המתאם של פירסון שונה כדי להאריך עד שלוש תמונות. מאחר והנקודות הבהירות בשלוש התמונות הן מתואמות או בלתי מתואמות, מקדם המתאם משתנה בין 0 (לא מתואם) לבין 1 (קורלציה מושלמת). מקדם הוא יומן- transformed כדי להגדיל את טווח דינמי בין 0 ו אינסוף. על ידי החלפת תכונה BDS עם תכונה BDC3, שיטת הניתוח שהוצגו על ידי Rajan et al. יכול כעת לשלב את שלושת הסמנים המשמשים ביותר למדוד autophagy במערכת אחת בעת ובעונה אחת. היכולת co-localize אלה שלושה סמנים של autophagy ב assay אחד יכול להוביל תובנות הרומן לתוך אינדוקציה ו הרגולציה של autophagy. הפרוטוקול הבא מתאר את השלבים כדי לגרום autophagy בתאי Jurkat; תווית התאים עם LC3, p62, ו LAMP1 נוגדנים; לרכוש נתונים על multispEctral זרימת הדמיה cytometer; ולנתח את הנתונים כדי להעריך שטף autophagic.

<table><tbody><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 50 מ"ל</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 מסומן חמור נגד עכבר - IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>חמור נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני, Alexa Fluor 647. קונקנטציה 2 מ"ג/מ"ל. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>CD107a-PE (LAMP1)BioLegend 328607</td><td></td><td></td> <td>שיבוט H4A3. ריכוז 400 ומיקרו; גרם/מ"ל. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>CD45 אנטי אנושי- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>שיבוט HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>CD45 אנטי אנושי- PE&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>שיבוט HI30.&nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>אנטי-אנושי CD45-AF647&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>שיבוט HI30.&nbsp; שיבוט</td></tr><tr><td>http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html אנטי-LC3 (אנושי) mAb 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>שיבוט 4E+12.&nbsp; ריכוז 2 מ"ג/מ"ל.&nbsp; נוגדן</td></tr><tr><td>https://www.mblintl.com/products/m152-3 Anti-SQSTM1 / p62 [EPR4844] - סמן אוטופאגוזום (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>שיבוט EPR4844.&nbsp; ריכוז: 0.5 מ"ג/מ"ל.&nbsp; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>תכשיר ניקוי מלח כלורוקווין דיפוספט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>- קולטר קלנז&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>מיכל מילוי 8546931 עם 200 מ"ל תכשיר ניקוי.&nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr> <tr><td>DAPI Stain 5 מ"ג/מ"ל</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td></td></tr><tr><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741 Debubbler - 70% איזופרופנול</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>מלא מיכל עם 200 מ"ל של מסיר בועות.&nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Sa Salt 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&nbsp; Ca++Mg++ Free&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת מלח פוספט בופר 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ Free&nbsp;</td></tr><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר</td><td>עוברי HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד, 10%, ללא מתנול, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>זה מה שמשמש לפורמלין 4% ו-1%. אזהרה: פורמלין/פורמלדהיד רעיל בשאיפה ובמקרה של בליעה.&nbsp; מגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור.&nbsp; עלול לגרום לרגישות בשאיפה או במגע עם העור. סכנת נזק חמור לעיניים.&nbsp; סכנת סרטן פוטנציאלית.&nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr> <tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152</td>)<td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>נעשה שימוש ב-2 מצלמות ImageStreamX Mark II המצוידות בלייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו-642 ננומטר.</td></tr><tr><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 תוכנת ניתוח MIFC - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>התוכנה הנלווית ל-MIFC (ImageStreamX MKII).&nbsp; IDEAS גרסה 6.2</td></tr><tr><td>תוכנת MIFC - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>זוהי התוכנה שמפעילה את ה-MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE גרסה 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE אנטי אנושי CD107a (LAMP-1) שיבוט נוגדנים H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html פניקלין/סטרפטומיצין/גלוטמין 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>שטיפה - מים טהורים במיוחד או מים נטולי יונים</td><td>NA</td><td></td> <td>NAניתן להשתמש בכל מים טהורים במיוחד או במים נטולי יונים.&nbsp; מלאו את המיכל ב-900 מ"ל שטיפה.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 בינוני 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>נדן - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>זהה לתמיסת מלח פוספט 1X&nbsp של Dulbecco; Ca++MG++ חינם.&nbsp; מלאו את המיכל ב-900 מ"ל נדן.</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה מפוליפרופילן סיליקון</td><td>פישרברנד</td><td>02-681-320</td><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה סיליקון סיליקון 1.5 מ"ל</td></tr>. <tr><td>תמיסת נתרן פירובט https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 (100 מ"מ)</td><td>מעקר HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>- 0.4 - 0.7% היפוכלוריט</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>זוהי למעשה אקונומיקה של 10% קלורוקס שניתן לייצר על ידי דילוף אקונומיקה קלורוקס במים. מלאו מיכל עם 200 מ"ל סטרילזר.</td></tr><tr><td>מגיב כיול מערכת - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>כל צינור מכיל ~10 מ"ל.&nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&nbsp;</td></tr><tr><td>בקבוק T75</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, חומר ניקוי בדרגת חלבון, תמיסה 10%,</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50 מ"ל</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>מים, דרגת תרבית תאים&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת השטף autofagic ידי מדידת lc3, p62, ו lamp1 co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Autophagy הוא מסלול קטבולית שבה רכיבים סלולריים נורמלי או מתפקדת כי לצבור במהלך הצמיחה והבחנה מושפלות באמצעות lysosome ו ממוחזרים. במהלך autophagy, חלבון LC3 cytoplasmic הוא lipidated וגויסו את הממברנות האוטופאגוסומליות. האוטופאגוזום מתמזג עם הליזוזום כדי ליצור את האוטוליזוזום, שם מתרחש התמוטטות שלפוחית ​​האוטופגוזום ותכולתו. חלבון ה- p62 הקשור ל- Ubiquitin, אשר נקשר ל- LC3, משמש גם לניטור השטף האוטופאגי. תאים שעוברים autophagy צריך להדגים את שיתוף לוקליזציה של p62, LC3, ו lysosomal סמנים. מיקרוסקופיה Immunofluorescence נעשה שימוש כדי לזהות חזותית LC3 puncta, p62, ו / או lysosomes על בסיס לכל תא. עם זאת, הערכה אובייקטיבית וסטטיסטית קפדנית יכול להיות קשה להשיג. כדי להתגבר על בעיות אלה, cytometry זרימת multispectral הדמיה שימש יחד עם תכונה אנליטית שמשווה את דה בהירהזנב תמונות של שלושה סמנים autophagy (LC3, p62 ו lysosomal LAMP1) ו לכמת שלהם שיתוף לוקליזציה, בשילוב עם ספירה LC3 ספירת למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

שיטה זו ניתוח משתמשת תכונות מרובות כדי התחת השטף autophagic. על מנת להבין את המגרש הדו-שנתי הסופי, יש לבחון תחילה את מאפייני הניתוח האינדיבידואליים. ספירת האוטופגוזומים היא דרך הגיונית למדידת אוטופאגי; עם זאת, גודל / צורה / בהירות של LC3 puncta יכול להשתנות באופן דרסטי בין תאים. וריאציה יכולה להקשות על ספירת האוטופגוזומים באופן ידני או באמצעות תכונה ספירת ספוט בתוכנת הניתוח. לכן, לא תכונה ספירת ספוט יהיה מושלם בשל השתנות זו גדולה autophagosomes. עם זאת, תכונה טובה ספירת נקודה יעבוד על רוב התאים 26 . איור 3 מציג דוגמאות של מסיכה ספוט של LC3 puncta בתאי Jurkat באמצעות מסכות ספוט שונים. התכונה ספירת ספוט שנבחרה עבור ערכת נתונים זו היא ספוט ספירת_מספר (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, כלומר התכונה ספירת ספירה ספרה את הנקודות שבהןAk מסומנת במסך ברירת המחדל של ערוץ 11 (M11) בערוץ 11 (Ch11-LC3-AF647) עם יחס רקע ל-תא של 4 (Bright, 4). איור 4 מציג ספירה ספירת היסטוגרמות ותמונות נציג עבור ספוט נקודה ממוצע של שליטה, שליטה + כלורוקווין, מורעב, מורעב + תאים כלורוקין Jurkat שכותרתו אנטי LC3-AF647. שליטה ומורעבת ספירת ספירת ממוצע אינם שונים באופן משמעותי; עם תוספת של chloroquine, יש הבדל גדול בממוצע של כלורוקין + שליטה לעומת כלורוקין מורעב +. התכונה הבאה לחקור היא BDC3. BDC3 הוא מדידה של שיתוף לוקליזציה של שלושה סמנים / בדיקות, במקרה זה, LC3, p62, ו LAMP1. איור 5A - 5D מציג היסטוגרמות BDC3 עבור שליטה, שליטה + כלורוקווין, מורעב, מורעב + תאים כלורוקווין Jurkat שכותרתו עם אנטי p62-AF488, אנטי LAMP1-PE, ו אנטי LC3-AF647. יש מעבר בין ממוצע שליטה לממוצע מורעב, כמו גם את השליטה + Chloroquine מתכוון למוות מורעב Chloroquine. עם זאת, מסתכל על התמונות של תאים מן הציונים BDC3 ממוצע בתרשים 5E - 5H , יש הבדל גדול יותר בין דגימות מאשר היסטוגרמות עשוי להוביל אחד להאמין. הסיבה לכך היא כי BDC3 אינו מחשיב את מספר האורגנים autophagy שיתוף מקומי, וכתוצאה מכך מידה רבה של השתנות במספר autophagosomes עבור ציון BDC3 אותו. ברוב המקרים, יש חפיפה בין כל שלושת הבדיקות, כי גם ברמות הבסיסיות, p62, LAMP1 ו- LC3 צריכים, במידה מסוימת, לשתף-מקום או להתגורר באזורים דומים בתאים. בניגוד לכך, דוגמה של שלושה בדיקות כי לא צריך שיתוף לוקליזציה הם אנטי p62-AF488, אנטי LC3-AF647, צבע DAPI גרעיני עבור מדגם מורעב + Chloroquine, שמוצג באיור 6. &lt;<html> / P&gt; כאשר תכונה ספירת ספוט התכונה BDC3 משולבים, נוכחות של subpopulations שונים המשפרים את היכולת להבחין בין הדוגמאות / התנאים השונים ניכרים. איור 7 מציג את חלקה דו-ספרתית של ספירת ספוט של LC3 לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 עבור ארבעת הדגימות: בקרה, בקרה + כלורוקין, מורעבים, מורעבים + כלורוקין. מדגם הבקרה שימש כדי לקבוע את אסטרטגיית gating עבור שלוש אוכלוסיות: נקודות נמוכה, נקודות גבוהות / נמוך BDC3, ו גבוה כתמים / גבוהה BDC3. הדגימות בקרה הראו כי יותר מ 98% של תאים היו 1 או פחות כתמים. הגבול בין הנקודות הגבוהות / נמוך BDC3 ו גבוה כתמים / גבוה BDC3 נקבעה ציון BDC3 של 1 כי יותר מ 91% של מדגם בקרה היה ציון BDC3 פחות מ 1. סיכום של התוצאות עבור bivariate מגרשים מוצג בטבלה 1 . <html> גיל = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> איור 1: MIFC הגדרת מכשיר. צילום מסך של הגדרות מכשיר MIFC המשמש לניסוי זה, המתואר בשלב 8 של הפרוטוקול. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> איור 2: ניתוח תוכנה Gating אסטרטגיה. צילום מסך של תוכנת ניתוח gating התוכנית, המתואר בשלב 9 של הפרוטוקול. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 10&quot;ג them/ /&gt; איור 3: LC3 מסכת ספוט. Jurkat תא תמונות ומסיכות השתמשו כדי ליצור את ספירת ספירת תכונה. מודגשים (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), שיא (M11, Ch11-LC3-AF647) , מוארת, 5), ספוט (M11, Ch11-LC3-AF647, מוארת, 5,3,1), ספוט (M11, Ch11-LC3-AF647, מוארת, 6,2,1). המסכה שעבדה הכי טוב עבור כל התאים המוצגים היה שיא (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> איור 4: LC3 ספירת ספירת היסטוגרמות. באמצעות ספירת ספוט תכונה ספוט Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 ו LC3-AF647 ספוט ספירת היסטוגרמות עבור בקרה ( A , כחול בהיר), שליטה + ChloroquinE ( B , כחול), מורעב ( C , ורוד), מורעב + Chloroquine ( D , אדום). ספירת הנקודות הממוצעת עבור בקרה, בקרה + כלורוקין, מורעב, מורעב + כלורוקואין הם 0.07, 1.13, 0.10, 2.77, בהתאמה. BF, LC3-AF647 (אדום), צבע DAPI גרעיני (כחול), וכן מורכב של LC3-AF647 ו תמונות DAPI של תאים נציג עבור ספוט נקודה ממוצע מוצגים עבור בקרה ( E , 0 כתמים), שליטה + Chloroquine ( F , 1 נקודה), מורעב ( G , 0 כתמים), מורעב + Chloroquine ( H , 3 כתמים). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> איור 5: היסטוגרמות BDC3 של p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 היסטוגרמות עבורR שליטה ( A , כחול בהיר), שליטה + Chloroquine ( B , כחול), מורעב ( C , ורוד), מורעב + Chloroquine ( D , אדום). ציון BDC3 הממוצע עבור בקרה, בקרה + כלורוקין, מורעב, מורעב + כלורוקווין הם 0.57, 0.82, 0.74, ו 0.98, בהתאמה. BF; P62-AF488 (ירוק); LAMP1-PE (צהוב); LC3-AF647 (אדום); ו - Composite של P62-AF488, LAMP1-PE, ו LC3-AF647 תמונות של תאים נציג של BDC3 הממוצע מוצגים שליטה ( E ), שליטה + כלורוקווין ( F ), מורעב ( G ), מורעב + כלורוקווין H). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> איור 6: היסטוגרמות BDC3 של p62 / LC3 / DAPI עבור מדגם מורעב + Chloroquine. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / DAPI היסטוגרמה עבור מדגם מורעב + Chloroquine מוצג. הציון הממוצע של BDC3 הוא 0.07. ( B ) BF; P62-AF488 (ירוק); LC3-AF647 (אדום); DAPI (כחול); ואת מורכב של P62-AF488, LC3-AF647, ותמונות DAPI של תאים נציג עבור BDC3 הממוצע מוצג עבור מדגם מורעב + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> איור 7: מגרשים דו-ספריים של LC3 ספוט לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( א ) חלקות Bivariate של ספירה LC3 ספוט לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 לבקרה, שליטה + כלורוקווין, מורעבים, מורעבים + כלורוקווין תאים Jurkat. ( B ) BF; P62-AF488 (ירוק); LAMP1-PE (צהוב); LC3-AF647 (אדום); ואת מרוכבים של p62-AF488, LAMP1-PE, ו LC3-AF647 תמונות משלושה אזורים ( כלומר, נמוך כתמים, כתמים גבוהים / נמוכה BDC3, גבוה כתמים / גבוה BDC3) מוצגים עבור מדגם מורעב + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> ספירת תאים </td><td> מוארת פירוט קולוקליזציה 3 ממוצע </td><td> ספירת ספוט LC3 ממוצע </td><td> נמוך נקודה </td><td> נקודה גבוהה / נמוכה BDC3 </td><td> נקודה גבוהה / גבוהה BDC3 </td></tr><tr><td> לִשְׁלוֹט </td><td> 439 </td><td> 0.57 </td><td> 0.07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td> שליטה + כלורוקין </td><td> 1432 </td><td> 0.82 </td><td> 1.13 </td><td> 68.9 </Td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> מוּרעָב </td><td> 1204 </td><td> 0.74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0.6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> מורעבים + כלורוקין </td><td> 1811 </td><td> 0.98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36.9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: סיכום Jorkat LC3 ספוט ספוט לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 חלקת Bivariate

הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לכמת את הקולוקליזציה (colocalization) של שלושה סממני אוטופגיה בשילוב עם כימות של נקודות (puncta) של LC3, לצורך מדידת אוטופגיה באופן אובייקטיבי, כמותי ובעל תוקף סטטיסטי. שיטה זו מאפשרת למדוד את הקולוקליזציה של שלושה סממני אוטופגיה במערך בדיקה יחיד, דבר שעשוי להוביל לתובנות חדשות לגבי ההשראה והוויסות של האוטופגיה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן למדוד שלושה סממני אוטופגיה בו-זמנית באופן אובייקטיבי, כמותי ובעל תוקף סטטיסטי.התחילו בהוספת 2×10⁶ תאי Jurkat לשפופרות צנטריפוגה נפרדות של 15 מיליליטר המסומנות בשמות הדגימות המתאימים. לאחר מכן, הוסיפו לשפופרה כל אחת מספיק בופר שטיפה כדי להביא את הנפח הסופי של כל דגימה ל-15 מיליליטר, והשקיעו את הדגימות באמצעות צנטריפוגה. השביו את המשקעים ב-100 µL של 4% formalin, ולאחר מכן העבירו את הדגימות לשפופרות מיקרו-צנטריפוגה מסיליקוניזד פוליפרופילן המסומנות.לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, שטפו את הדגימות במילליטר אחד של בופר שטיפה טרי. השעיקו מחדש את המשקעים ב-100 מיקרוליטר של הנוגדן הראשון הרצוי בבופר חדירה (permeabilization buffer) לדגירה של 30 דקות בחשיכה בטמפרטורת החדר, תוך הגנה מהאור. שטפו את התאים המסומנים והחדירים במילליטר אחד של בופר חדירה טרי וסמנו אותם עם הנוגדן הבא הרצוי, כפי שהודגם הרגע.לאחר שכל הדגימות סומנו עם הנוגדן הסופי, השביה מחדש את המשקעים בתמיסת formalin 1%, ולאחר מכן הוסף 10 µL של צבע גרעיני DAPI 10x. ערבב את התאים באמצעות vortex קל, ולאחר מכן הדגר את הדגימות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, תוך הגנה מאור. בסיום ההדגרה, טען את תבנית ברירת המחדל בציטומטר זרימה עם דימוי רב-ספקטרלי ובחר את הלייזרים המתאימים.הזינו את הספק הלייזר הרצוי בחלון הסמוך לכל כפתור לייזר, ולאחר מכן לחצו על כפתור הטעינה (load) כדי להטעין את המבחנה בנפח 1.5 milliliter למכשיר. צרו תרשים פיזור (dot plot) של area M01 מול aspect ratio M01 עבור כלל האוכלוסייה, וסמנו אזור סביב התאים. קראו לאזור זה Cell.הגדירו את פרמטרי הרכישה. ציינו את תיקיית היעד ואת שם הקובץ ושנו את מספר האירועים ל-5,000, לאחר מכן בחרו את אוכלוסיית התאים ולחצו על acquire כדי לרכוש את הקובץ והריצו את שאר הדגימות כפי שהודגם כעת תחת אותן הגדרות לייזר. לאחר איסוף הקובץ, לחצו על return כדי להוציא את מבחנת הדגימה.כדי לנתח את נתוני הציטומטריית זרימה עם דימות רב-ספקטרלי, לחצו על start analysis כדי להפעיל את אשף פתיחת הקבצים בתוכנת ניתוח הדימות, ולאחר מכן לחצו על סמל אשף האפופטוזיס ועל כפתור select wizard כדי לפתוח את אשף האפופטוזיס. לאחר שכל התאים האפופטוטיים הוסרו מהניתוח, הגדירו אזור סביב התאים שאינם אפופטוטיים וסמנו אוכלוסייה זו כ-cells. לאחר מכן, לחצו על סמל ה-building blocks.בחרו בסינון פלוס פלואורסצנטי בצבע אחד (fluorescence positives one color), ובחרו באוכלוסיית תאים ובאינטנסיביות של ערוץ MC 3. סמנו את ציר ה-X כ-intensity lamp one וסמנו אזור הכולל את התאים עם אינטנסיביות הגבוהה מ-10,000. תייגו אזור זה כ-lamp one positive.לאחר ביצוע gating לתאים החיוביים ל-P62 ו-LC3 באותה דרך, לחצו על לשונית הניתוח (analysis) ובחרו ב-mask. לחצו על new ולאחר מכן על function. תחת function, בחרו ב-peak.תחת mask, בחר M11. תחת channel, בחר channel 11. הגדר את היחס בין ה-spot לרקע התא (cell background) לארבע.לאחר מכן לחצו על okay כדי לסגור את חלון פונקציית הגדרת המסכה, ולאחר מכן על okay כדי להוסיף את המסכה לרשימת המסכות. לחצו על close כדי לצאת ממנהל המסכות, לאחר מכן לחצו שוב על לשונית ה-analysis ובחרו ב-features. לחצו על new.תחת סוג המאפיין (feature type), בחרו ב-spot count ובחרו את מסכת השיאים (peak mask) שנוצרה כעת. להזנת השם רשמו spot count LC3 ולחצו על אישור. לחצו שוב על new.תחת סוג המאפיין (feature type), בחר ב-bright detail colocalization three או BDC3. תחת מסכה (mask), בחר ב-MC. תחת תמונה אחת (image one), בחר בערוץ שתיים עבור P62. תחת תמונה שתיים (image two), בחר בערוץ שלוש עבור lamp one.מתחת לתמונה שלוש, בחרו בערוץ 11 עבור LC3. הזינו BDC3p62/LAMP1/LC3 כשם ולחצו על אישור (okay) וסגירה (close) כדי לצאת ממנהל המאפיינים (feature manager). לחצו על סמל תרשים הפיזור (scatter plot) החדש ובחרו באוכלוסייה החיובית ל-LAMP1, חיובית ל-p62 וחיובית ל-LC3.בחר ב-BDC3/p62/LAMP1/LC3 עבור ציר ה-X ובמאפיין spot count LC3 עבור ציר ה-Y ולחץ על אישור. תחת תפריט הקובץ, בחר ב-save data analysis file ולחץ על save ולאחר מכן על yes כדי לשמור את נתוני ה-starved plus chloroquine כקובץ ניתוח נתונים ולהחליף את הגרסה הקודמת של הקובץ. כעת פתח את קובץ הביקורת ובחר במטריצת הפיצוי המתאימה ובקובץ ניתוח הנתונים של ה-starved plus chloroquine כתבנית.לחצו על אישור. כדי ליצור אזורים להצטברות אוטופגוזומים (autophagosome) ולהצטברות אוטוליזוזומים (autolysosome), פתחו את דגימת הביקורת וסמנו אזור מלבני בין קואורדינטות 0.1 ל-3 בציר X ובין קואורדינטות 1.5 ל-0.3 בציר Y. תנו לאזור זה את השם low spots.בשלב הבא, הגדירו אזור מקואורדינטות 0.1 עד 1 בציר ה-X ו-17.5 עד 1.5 בציר ה-Y וקראו לאזור זה high spot low BDC3; לאחר מכן הגדירו אזור מקואורדינטות 1 עד 3 בציר ה-X ו-17.5 עד 1.5 בציר ה-Y וקראו לאזור זה high spots/high BDC3. שמרו את קובץ הביקורת כדי שיוכל לשמש כתבנית, ולאחר מכן פתחו את שאר הקבצים, כולל קובץ ה-starved plus chloroquine, תוך שימוש בקובץ הביקורת כתבנית כפי שהודגם קודם לכן. הגודל, הצורה והבהירות של נקודות ה-LC3 עשויים להשתנות באופן ניכר בין תאים, כפי שנצפה במיסוכי הנקודות הללו של נקודות LC3 בתאי Jurkat תוך שימוש במיסוכי נקודות שונים.המסכה שעבדה בצורה הטובה ביותר עבור ניסוי זה הייתה peak עם יחס של נקודה לרקע תאי של ארבע. בספירות נקודות מייצגות אלו של תאי Jurkat המסומנים ב-anti-LC3, ספירות הנקודות הממוצעות של הביקורת ושל התאים המורעבים אינן שונות באופן מובהק. כאשר מוסיפים כלורוקווין (chloroquine), נצפה הבדל גדול בממוצע של קבוצת הביקורת בתוספת כלורוקווין בהשוואה לממוצע של קבוצת התאים המורעבים בתוספת כלורוקווין.בניסוי זה, נצפתה הסטה בין הממוצע של ה-BDC3 colocalization שנמדד בקבוצת הביקורת לבין הממוצע של קבוצת ההרעבה, וכן בין הממוצע של קבוצת הביקורת בתוספת chloroquine לממוצע של קבוצת ההרעבה בתוספת chloroquine. מדד ה-BDC3 אינו לוקח בחשבון את מספר האורגנלות של האוטופגיה שנמצאות ב-colocalization, דבר המוביל למידה רבה של שונות במספר האוטופגוזומים עבור אותו ציון BDC3. למעשה, ברוב המקרים קיימת חפיפה בין שלושת הגששים, שכן גם ברמות של Beyza, חלבונים כמו p62, LAMP1 ו-LC3 אמורים, במידה מסוימת, להראות colocalization באזורים דומים של התאים.בניגוד לכך, להלן דוגמה למאפיין BDC3 בשלושה גששים שלא אמורים להראות קולוקליזציה: P62, LC3 ו-DAPI. כאשר משלבים את ספירת הנקודות עם מאפייני ה-BDC3, ניכרת נוכחותן של תתי-אוכלוסיות שונות אשר שיפרו את היכולת להבחין בין הדגימות והתנאים השונים.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלימה בערך בשמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי. עם זאת, אם נדרש מאפיין ספירה שונה של נקודות, יידרש זמן ניתוח נוסף. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בביקורות המתאימות.לדוגמה, השתמשו בדגימת הביקורת כדי לקבוע את ספי ספי Beyza ובדגימה של ביקורת בתוספת כלורוקווין כביקורת עבור דגימת הרעב בתוספת כלורוקווין. ניתן להשתמש בנוהל זה גם ליישומים תוך-תאיים אחרים הדורשים קולוקליזציה של שלושה סמנים שונים, פשוט על ידי מעבר לנוגדנים המתאימים למטרת המחקר. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן סימון תאים עם סמני אוטופגיה, רכישת נתונים בציטומטר זרימה עם דימוי רב-ספקטרלי, וניתוח הנתונים להערכת שטף אוטופגי.אל תשכחו שעבודה עם פורמלין עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

assessing-autophagic-flux-measuring-lc3-p62-lamp1-co-localization

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Autophagy היא תהליך בכל מקום שמאפשר לתאים לבזות ולמחזר חלבונים ואת האברונים. אנו מיישמים מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתקדם כדי להמחיש ולכמת קטנים, אבל שינויים מהותיים, פיסיים הקשורים לאינדוקציה של autophagy, כולל הקמת וההפצה של autophagosomes וlysosomes, ומיזוגם בautolysosomes.

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

מיקרוסקופיה זמן לשגות של סמני autophagy כותרתו fluorescently מאפשרת ניטור של תגובת autophagy הדינמית עם רזולוציה גבוהה זמנית. שימוש autophagy ספציפית וסמני אברון בשילוב של 3 צבעים שונים, אנו יכולים לעקוב אחר תרומתו של חלבון להיווצרות autophagosome בהקשר מרחב ובזמן חזק.

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

Autophagy פעיל קשורה התחדשות שריר פרודוקטיבי, אשר חיוני עבור תא גזע שריר (MuSC) ההפעלה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לזיהוי באתרה של LC3, סמן autophagy ב MyocS חיובי Myocs של קטעים רקמות שריר מן שליטה ועכברים שנפגעו.

ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

כאן מתואר פרוטוקול המאומת היטב ופשוט למדידת נפח פעילות פחמיות autophagic בתרבית של תאים. השיטה מבוססת על לכימות שחלקן של לקטט דהידרוגנאז (LDH) בחלקים תא sedimentable, לעומת סה כ רמות LDH הסלולר.

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו למדידת מקצבים ביולוגיים בקטוליזם חלבונים באמצעות הוראות משוב ושוב בכבד העכבר.

מדידת מקצבים הדיורnal בתצוגה מקדימה של הזרם ופרוטאספאל השטף

מיטופגיה היא המנגנון העיקרי של בקרת איכות מיטוכונדריאלית. עם זאת, ההערכה של mitophagy in vivo הוא הפריע על ידי היעדר בדיקות כמותיות אמין. מוצג כאן פרוטוקול לתצפית על מיטופגיה בתאים חיים באמצעות צבע מיטוכונדריה ירוק-פלואורסצנטי המיועד לתאים וצבע ליזוזום אדום-פלואורסצנטי.

הדמיה של מיטופגיה עם צבעים פלואורסצנטיים למיטוכונדריה וליזוזום

מטרת פרוטוקול זה היא לקבוע רמות אוטופגיות בסרטן הלבלב ובתאי אסינר בלבלב באמצעות אימונופלואורסנציה LC3 וכימות נקודות LC3.

הערכת רמות אוטופגיה בשני מודלים שונים של תאי לבלב באמצעות LC3 immunofluorescence

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיקרוסקופ אור-אלקטרונים מתאמי אופטימלי על חתך המבוסס על תיוג אנדוגני פלואורסצנטי ככלי לחקר לוקליזציה של חלבונים נדירים ביחס לאולטרה-מבנה תאי. כוחה של גישה זו מודגם על ידי לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 אנדוגני בתאים מורעבים ללא טיפול Bafilomycin.

לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 אנדוגני על ידי מיקרוסקופ אור-אלקטרונים קורלטיבי בחתך

כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה להערכה תמציתית של רמות סמן אוטופגוזום LC3-II בשלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) על ידי immunoblotting. ניתוח רמות LC3-II ברכבים חשמליים, היווצרות אוטוליזוזום והיווצרות אומגה מצביע על התפקיד החדש של STX6 בשחרור רכבים חשמליים חיוביים ל-LC3-II כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב.

הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות

שיטת ה-IP FCM מוצג, המאפשר רגיש, הערכה החזקה, ביוכימיות של חלבונים אינטראקציות הילידים, ללא צורך בהנדסה גנטית או גודל מדגם גדול.

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

למד שיטה כמותית להערכת השטף האוטופגי באמצעות מדידת שיתוף מקום של LC3, p62 ו-LAMP1 בזרימת ציטומטריה עם הדמיה מולטי-ספקטרלית. הטכניקה מאפשרת זיהוי אובייקטיבי וסטטיסטי של תת-אוכלוסיות תאים ושינויים עדינים בתהליך האוטופגיה.

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

גלה סרטונים נוספים