Name: Live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: למדו הדמיה בזמן אמת של תפקוד טסיות תחת זרימה באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר degranulation והפרשה ברמת תא בודד לחקר מנגנוני קרישת דם והמוסטזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CM מודה על תמיכה כספית של הארגון הבינלאומי לחולים לליקויים של C1-Inhibitor (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht וקרן לנדסטיינר לחקר עירוי דם (LSBR).

<ol><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+Willebrand+factor%2C+Jedi+knight+of+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li>
<li>Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+granule+exocytosis%3A+a+comparison+with+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11(2013).</li>
<li>May, B., Menkens, I., Westermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+release+of+serotonin+and+histamine+from+blood+platelets+of+the+rabbit+by+aliphatic+and+aromatic+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines.</a> Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).</li>
<li>Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+C1-+inhibitor.+A+secreted+alpha-granule+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein.</a> J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).</li>
<li>Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+angiogenesis+regulatory+proteins+from+platelet+alpha+granules%3A+modulation+of+physiologic+and+pathologic+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis.</a> Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).</li>
<li>Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+immunofluorescence+mapping+reveals+little+functional+coclustering+of+proteins+within+platelet+%CE%B1-granules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules.</a> Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).</li>
<li>Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+chamber+developed+to+investigate+platelet+interaction+in+flowing+blood+with+human+vessel+wall+cells%2C+their+extracellular+matrix%2C+and+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components.</a> J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).</li>
<li>Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Flow+Chambers+Using+Reconstituted+Blood+to+Model+Hemostasis+and+Platelet+Transfusion+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).</li>
<li>Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphate+colocalizes+with+factor+XII+on+platelet-bound+fibrin+and+augments+its+plasminogen+activator+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity.</a> Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).</li>
<li>Park, Y., Schoene, N., Harris, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mean+platelet+volume+as+an+indicator+of+platelet+activation%3A+methodological+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues.</a> Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).</li>
<li>Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+perfusion+chamber+to+detect+platelet+adhesion+using+a+small+volume+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood.</a> Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).</li>
<li>Slack, S. M., Turitto, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chambers+and+their+standardization+for+use+in+studies+of+thrombosis.+On+behalf+of+the+Subcommittee+on+Rheology+of+the+Scientific+and+Standardization+Committee+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH.</a> Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).</li>
<li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy%3A+present+technology+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends.</a> Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).</li>
<li>Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+CD63+is+in+platelet+dense+granules%2C+is+deficient+in+a+patient+with+Hermansky-Pudlak+syndrome%2C+and+appears+identical+to+granulophysin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin.</a> J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).</li>
<li>Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+dense+granules+contain+polyphosphate+and+are+similar+to+acidocalcisomes+of+bacteria+and+unicellular+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes.</a> J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).</li>
<li>Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+von+Willebrand+Factor+under+Control%3A+Alternatives+for+ADAMTS13%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13.</a> Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Tersteeg, C., de Maat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+cleavage+of+von+Willebrand+factor+as+an+emergency+bypass+for+ADAMTS13+deficiency+in+thrombotic+microangiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy.</a> Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).</li>
<li>Basir, A., de Groot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Hemocompatibility+Testing+of+Dyneema+Purity+Fibers+in+Blood+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Innovations+%28Phila%29%22%5BJournal%5D)">In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact.</a> Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

ברחבי העולם, פקקת היא גורם מוביל למוות ולתחלואה, וטסיות משחקות תפקיד מרכזי בהתפתחותה. עבודה זו מתארת ​​שיטה עבור הדמיה תא חי של degranulation טסיות מתחת לזרימה. בדרך כלל מניחים כי כאשר טסיות הדם הופעלות, כל התכנים הגרעיניים משוחררים ישירות לפתרון. התוצאות הנלוות מלמדות כי אין זה בהכרח כך. במהלך הדבקה ו degranulation, טסיות לשמור על כמות משמעותית של polyphosphate ( איור 4 ). בנוסף, VWF חלבון multimeric קשורה משטח טסיות לאחר degranulation ( איור 5 )...

טסיות הדם הן תאים אנוקליאטיות המסתובבות בזרם הדם. הפונקציה העיקרית שלהם היא לחתום הפרות כלי הדם באתרים של פגיעה כדי למנוע אובדן דם. באתרים אלה של פגיעה, סיבי קולגן subendothelial נחשפים והם מכוסים לאחר מכן על ידי חלבון multimeric, פון Willebrand גורם (VWF). VWF אינטראקציה עם טסיות במחזור במנגנון זה תלוי glycoprotein IBA-IX-V מורכבים על פני התא 1 , להאט את מהירות הטסיות. זה חשוב במיוחד בשיעורי גזירה גבוהה. טסיות לאחר מכן לעבור שינויים מורפולוגיים בעת קבלת הפעלת דחפים קולגן. זה מוביל להתפשטות בלתי הפיך ובסופו של דבר צבירה טסיות. שני התהליכים תלויים בהפרשת תכולת גרגירים כדי להקל על קרוסטלקט טסיות טסיות. בין היתר, טסיות α- גרגרים מכילים פיברינוגן ו VWF לסייע הידבקות טסיות לגשרטסיות יחד בצורה תלויי אינטגרין. גרגירי הצפיפות הטסיות מכילים תרכובות אנאורגניות 2 , כולל סידן ואדנוזין diphosphate (ADP), אשר מסייעות לחזק את פעולת הטסיות. יתר על כן, טסיות להכיל מתווכים של דלקת (אלרגית) 3 , משלימים שליטה חלבונים 4 , ו אנגיוגנזה גורמים 5 , 6 , מעלה את השאלה האם וכיצד תוכן אלה משתחררים באופן דיפרנציאלי בתנאים משתנים. מאז 1980, המחקר של תפקוד טסיות במודלים הזרימה היה בעל ערך לחקירת מנגנוני טרומבוטיים. מאז, התקדמות טכנית רבה נעשתה, מודלים הזרימה הכוללים היווצרות fibrin מפותחים כיום כדי assay הפוטנציאל המוסטטי של ריכוז טסיות טיפולית לשעבר vivo 8 אולחקור את השפעת ההפרעות בשיעורי גזירה על מורפולוגיה 9 . ההבדלים במנגנונים המולקולריים והתאים הביולוגיים שמניעים הידבקות יציבה ויצירת פקקת פיזיולוגית (הימוסטאזיס) לעומת היווצרות פקק פתולוגי (פקקת) עשויים להיות מתוחכמים מאוד ומניעים את התפתחות מודלים הזרימה המאפשרים הדמיה בזמן אמת של תת-תאים אלה תהליכים. דוגמה לתהליך שעבורו התקנה כזו תהיה בעלת ערך היא ההפצה (re) של polyphosphate תוך תאיים וגיוס גורמים קרישניים כדי לחשוף את ההשפעה תלוי הזמן על זה על תשתית פיברין 10 . מחקרים מוגבלים לעיתים קרובות לניתוח נקודות קצה. המטרה העיקרית של השיטה המתוארת היא לאפשר את החקירה החזותית בזמן אמת של תהליכים תת-דינמיים דינמיים המתרחשים במהלך הפעלת טסיות מתחת לזרימה.

<table><tbody><tr><td>4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינאתן-חומצה סולפונית (HEPES)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck KGaA</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Merck KGaA</td><td>1.04074</td><td></td></tr><tr><td>פרוסטציקלין&nbsp;</td><td>קיימן כימיקל</td><td>18220</td><td></td></tr><tr><td>טרי-סודיום ציטראט</td><td>Merck KGaA</td><td>1.06448</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>1.00244</td><td></td></tr><tr><td>משקפי כיסוי</td><td>Menzel-Gl&auml; סר</td><td>BBAD02400500 # A</td><td>24 x 50 מ"מ, מס '1 = 0.13 - 0.16 מ"מ עובי.</td></tr><tr><td>חומצה כרומוגופרתית (2% CrO3)Riedel</td> <td>de Haen</td><td>07404</td><td>CAS [65272-70-0].</td></tr><tr><td>Von Willebrand factor (VWF)</td> <td>מעבדות מחקר אנזימי פיברינוגן מטוהרות</td><td></td><td></td>בבית</tr><tr><td></td><td></td><td>FIB3L</td><td></td></tr><tr><td>4 צלחת באר, לא מטופלת</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td></td></tr><tr><td>סרום אנושי אלבומין Fraction V</td><td>Haem Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>823022 צינורות איסוף דם, 9 מ"ל, 9NC קרישה נתרן ציטראט 3.2%</td> <td>גריינר ביו-וואן</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>מנתח תאים&nbsp;</td><td>Abbott Diagnostics</td> מנתח <td></td><td>המטולוגיה CELL-DYN</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>30525-89-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>מכשיר הרווארד, הוליסטון, MA</td><td>מכשיר הרווארד 22</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 10 מ"ל בקוטר 14.5 מ"מ</td><td>BD biosciences</td><td>305959</td><td>מזרק Luer-Lok</td></tr><tr><td>Anti-CD63-biotin&nbsp;</td><td>אבקאם&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AB134331 אנטי-CD62P-ביוטין&nbsp;</td><td>מו"פ D Systems</td><td>Dy137</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Polysciences Inc.&nbsp;</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין, Alexa Fluor 488 מצומד</td><td>Thermo Scientific</td><td>S11223&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>שמן טבילה</td><td>Zeiss</td><td>444963-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת דטרגנט</td><td>יוניליוור, ביוטקס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא</td><td>56-40-6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול פוליוויניל</td><td>סיגמא</td><td>9002-89-5</td><td>Mowiol 40-88.</td></tr><tr><td>טריס הידרוכלוריד</td><td>סיגמא</td><td>1185-53-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]אוקטן (DABCO)</td><td>Sigma</td><td>280-57-9</td><td></td></tr><tr><td>כבשים Anti-hVWF pAb</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB9378</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>סרט Parafinn</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>4 אינץ' x 125 רגל גליל.</td></tr><tr><td>יריעת סיליקון לא מחוזקת</td><td>Nagor</td><td>NA 500-1</td><td>200 מ"מ x 150 מ"מ x 0.125 מ"מ.</td></tr><tr><td>יריעת סיליקון חתוכה בהתאמה אישית עם תעלות זלוף ואקום</td><td>תוצרת</td><td></td> הבית <td>עשויה יריעת סיליקון לא מחוזקת (Nagor, NA 500-1)</td></tr> <tr><td>צינורות 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf AG</td><td>T9661-1000AE</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Zeiss Observer Z1&nbsp;</td><td></td><td>מצויד בנורות עירור LED.</td></tr><tr><td>תוכנת מיקרוסקופ</td><td>Zeiss ZEN 2</td><td>מהדורה</td><td></td>כחולה</tr><tr><td>18 G מחט (18 G x 1 1/2 אינץ')</td><td>BD biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Riedel de Haen</td><td>31248375</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>10708976</td><td></td></tr><tr><td>פלסטיק פסטר</td><td>פיפט VWR</td><td>612-1681</td><td>&nbsp; 7 מ"ל לא סטרילי, מדורג עד 3 מ"ל.</td></tr><tr><td>צינורות סיליקון</td><td>VWR</td><td>228-0656</td><td>קוטר פנימי. x קוטר חיצוני x עובי דופן = 1.02 x 2.16 x 0.57 מ"מ.</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>Thermo Scientific</td><td>ABAA000001##12E</td><td>76 x 26 x 1 מ"מ, קצוות קרקע 45 & deg;, קצה חלבי.</td></tr></tbody></table>

live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

טסיות דם הם שחקנים חיוניים בהמוסטזיס, היווצרות של טרומבי לחותם הפרעות בכלי הדם. הם מעורבים גם פקקת, היווצרות של תרומבי כי לכסות את כלי הדם ואת הפגיעה באיברים, עם תוצאות מסכנות חיים. זה מניע מחקר מדעי על תפקוד טסיות ופיתוח שיטות כדי לעקוב אחר תהליכים ביולוגיים התא כפי שהם מתרחשים בתנאי זרימה. מגוון של מודלים לזרימה זמינים לחקר הדבקה וטסיות טסיות, שתי תופעות מרכזיות בביולוגיה טסיות. עבודה זו מתארת ​​שיטה ללימוד degranulation טסיות בזמן אמת תחת זרימה במהלך ההפעלה. השיטה עושה שימוש בתא הזרימה מצמידים ההתקנה משאבה מזרק ממוקם תחת שדה רחב, הפוך, מבוסס מיקרוסקופ פלואורסצנטי LED. ההתקנה המתוארת כאן מאפשר גירוי סימולטני של fluorophores מרובים אשר מועברים על ידי נוגדנים שכותרתו fluorescently או fluorescצבעים. לאחר ניסויים הדמיה חיה תא, כוסות לכסות ניתן לעבד עוד יותר ונותחו באמצעות מיקרוסקופ סטטי ( כלומר מיקרוסקופיה confocal או מיקרוסקופית אלקטרונים סריקה).

איור 1 מציג תמונות של החדר לזרום ההתקנה ניסיוני; את המיקום ואת הממדים של הסיליקון גיליון; ואת חיבורי צינורות. איור 2 מספק פרטים על הממדים של החדר הזרימה. איור 3 ו סרט 1 להראות סדרה של זמן של תמונות של הידבקות טסיות והתפשטות על VWF משותק. CD63 הוא חלבון transmembrane כי הוא מוכנס לתוך קרום של גרגרי צפופה תאיים של טסיות מנוחה 1...

עבודה זו מתארת ​​שיטה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטי לחקר הדבקה טסיות, התפשטות, והפרשה תחת זרימה. פלטפורמה רב-תכליתית זו מאפשרת חקירת תפקוד טסיות למחקר מכניסטי על פקקת והמוסטאזיס.

Live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לעקוב אחר דגרנולציה (degranulation) והפרשה של טסיות דם תחת זרימה באמצעות דימוי תאים חיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של טסיות הדם. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת חקירה רב-גונית של תכני הטסיות ברמה התת-תאית בתאים חיים.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תפקוד טסיות דם, ניתן ליישמה גם על סוגי תאים אחרים, כגון תאי mast. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה בשל בעיות בבידוד טסיות דם שמובילות להפעלה מוקדמת (preactivation). הרעיון לשיטה זו עלה אצלנו לראשונה כאשר הבנו שניתן להעריך הפרשה של טסיות דם רק בשלבי סוף-נקודה (end point).תמונות בזמן אמת מספקות מידע על קינטיקת השחרור של הגרנולות מהטבקיות. הליך בידוד הטבקיות יודגם על ידי Silvia Pignatelli, סטודנטית במכון שלנו. לאחר מכן, Arjan Barendrecht ידגים את ניסויי ההדמיה בזמן אמת.כדי להתחיל, יש לבצע ניקוי שומנים לזכוכיות כיסוי על ידי הדגרה שלהן למשך לילה בחומצה כרומוסולפורית לא מדוללת. למחרת, יש לשטוף אותן במים מזוקקים. לאחר מכן, יש להניח אותן למשך לילה בתנור בטמפרטורה של 60 °C לצורך ייבוש.בשלב הבא, הניחו טיפת מים על שולחן מעבדה והדביקו רצועת סרט פאראפין בגודל 10 סנטימטר על 15 סנטימטר מעל הטיפה, תוך הוצאת האוויר שבין השולחן לסרט. לאחר מכן, טפטפו באמצעות פיפטה טיפות של 80 µL של von Willebrand factor בריכוז 10 µg/mL או fibrinogen בריכוז 100 µg/mL על סרט הפאראפין. הניחו זכוכית כיסוי יבשה על הטיפות והדגירו אותן למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר.בשלב הבא, הוסיפו שלושה מיליליטרים של תמיסת חסימה (blocking buffer) לכל באער של פלטה בעלת ארבעה באערים. העבירו את זכוכיות הכיסוי, כאשר הצד המצופה פונה כלפי מעלה, לבאערים נפרדים בפלטה. דגרו אותן למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.סבבו בצנטריפוגה תשעה מיליליטר של דם שלם עם ציטראט למשך 15 דקות ב-160 ×g ללא הפסקה. לאחר מכן, השתמשו בפיפטת פסטור מפלסטיק כדי לאסוף את הנוזל העליון המכיל את הפלזמה העשירה בטבחים. הוסיפו חלק אחד של acid citrate dextrose לתשעה חלקים של טבחים לפי נפח כדי למנוע הפעלה מוקדמת של הטבחים.לאחר מכן, סבב את הטסיות בצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-400 ×g ללא הפסקה. לאחר מכן, הסר את הנוזל העליון (supernatant), כך שיישאר משקע של טסיות. לאחר מכן, השהה את המשקע בזהירות בבופר HEPES Tyrode ב-pH של 6.5 חזרה לנפח המקורי של דגימת הטסיות.לאחר מכן, הוסף Prostacyclin לטסיות שהושעו מחדש. סבב את הדגימה בצנטריפוגה באופן מיידי ולאחר מכן הסר את הנוזל העליון (supernatant). השעה מחדש את המשקע בזהירות בבופר HEPES Tyrode ב-pH של 7.4.בשלב הבא, העבירו את הטבחים השטופים לאנלייזר תאים וספרו את מספר הטבחים. התאימו את מספר הטבחים בדגימה לריכוז של 150,000 טבחים למיקרוליטר באמצעות HEPES Tyrode buffer ב-pH של 7.4. לאחר התליה מחדש, השאירו את הטבחים להתאושש למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני הניסוי.כסו את החלק העליון של תא הזרימה במים מזוקקים והניחו גליון סיליקון מותאם אישית כאשר הצד החלק פונה כלפי מטה אל המים. הניחו לגליון לצוף למיקומו על ידי הסרת עודפי מים תוך שמירה על מיקום הגליון. דגרו את תא הזרימה למשך שעה אחת ב-60 °C כדי לאדות את המים שנותרו ולהדביק את גליון הסיליקון בחוזקה לתא הזרימה.בעזרת פיפט פסטור מפלסטיק, יש להוסיף טיפה של HEPES Tyrode buffer ב-pH של 7.4 אל תעלת הזרימה. לאחר מכן, יש להניח את זכוכית הכיסוי שהוכנה, כאשר הצד המצופה פונה כלפי מטה, על תעלת הזרימה. הפעל את משאבת הוואקום ללחץ של כ-10 kilopascals וחבר את משאבת הוואקום לחיבור הוואקום של תא הזרימה.הוסיפו צבע DAPI בריכוז של 10 micrograms per milliliter לטסיות השטופות, ועטפו בנייר אלומיניום את המבחנה המכילה את הטסיות. לאחר מכן, דגרו אותן למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. כדי למנוע את הפעלת הטסיות, הוסיפו prostacyclin בריכוז סופי של 10 nanograms per milliliter וסבבו מיד את הטסיות בצנטריפוגה למשך 15 דקות במהירות של 400 times G ללא שימוש בבלם, כדי להסיר DAPI שאינו קשור.בצעו הרחלה מחדש של משקע הטסיות ובאפר HEPES Tyrode ב-pH של 7.4 לנפח המקורי עם ריכוז של 150,000 טסיות למיקרוליטר. לאחר מכן, הדליקו את מיקרוסקופ הפלואורסצנציה והפעילו את תוכנת המיקרוסקופ. הגדירו את פרמטרי הדימוי כפי שמתואר בטבלה אחת של פרוטוקול הטקסט המצורף.חסמו את צינור הכניסה על ידי חיבור מזרק של 10 milliliter ושאיבת תמיסת חסימה (blocking buffer) לתוך צינור הכניסה. השאירו לחסימה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטפו את צינור הכניסה על ידי שאיבת HEPES Tyrode buffer 7.4 לתוכו. חברו את צינור הכניסה החסום ואת צינור היציאה שלא טופל לכניסה וליציאה של התא.לאחר מכן, חברו את המזרק בנפח 10 milliliter לצינור היציאה. הניחו טיפה של שמן טבילה על עדשה אובייקטיבית של 100 times והניחו את התא על המיקרוסקופ כאשר משטח הזכוכית פונה כלפי מטה. לאחר מכן, הכניסו את צינור הכניסה לתוך מבחנה המכילה HEPES Tyrode buffer ב-pH של 7.4.משוך ידנית את בוכנת המזרק המחובר לצינור היציאה כדי למשוך את התמיסה דרך התא ולהוציא את האוויר מהמערכת. לאחר מכן, הנח את המזרק בתוך משאבת המזרקים והפעל את המשאבה לזמן קצר כדי להדק את הבוכנה ולהבטיח זרימה יציבה. לאחר שמערכת הזרימה מוכנה, הוסף את הנוגדנים ו/או הצבעים לת сусפנזיית הטסיות וערבב בזהירות.לאחר מכן, לחצו על צינור הכניסה והעבירו אותו מהבופר אל המבחנה המכילה את הטסיות המסומנות. בחרו באפשרות של הדמיה חיה (live visualization) בתוכנה. התמקדו במשטח זכוכית הכיסוי של המיקרוסקופ והפעילו את המשאבה בקצב של 484 microliters per minute.הפעל את המשאבה עד שהטסיות יגיעו לתא הזרימה. לאחר מכן, הפחת את קצב הזרימה ל-7.5 microliters per minute. עקוב אחר פני השטח של זכוכית הכיסוי.ברגע שהטסיה הראשונה מתחילה להיצמד, ממרכזים את המיקרוסקופ על טסיה זו ומתחילים בהקלטה על ידי הפעלת הניסוי בתוכנה. מקליטים למשך 30 דקות ולאחר מכן עוצרים את משאבת המזרק. שומרים את קבצי נתוני הגלם של המיקרוסקופ הכוללים את כל המטא-נתונים.במידת הצורך, ייצאו את הסרטים בפורמט MOV H 264 דחוס או AVI לא דחוס. שמרו פריימים נפרדים כקבצי JPEG או TIF. עם סיום הצילום, הסירו את התא מהמיקרוסקופ, נקו את שמן האימרסיה מהזכוכית, נתקו את הוואקום והסירו בזהירות את זכוכית הכיסוי מהתא באמצעות מחט בדרגה (gauge) 18.הנח את זכוכית הכיסוי, כאשר התאים פונים כלפי מעלה, בתוך פלטת ארבעה בארות חדשה על גבי רקמה שהורטבה מראש במים מזוקקים. לאחר מכן, טפטף באמצעות פיפט 750 µL של תמיסת קיבוע על גבי זכוכית הכיסוי והדגרה אותה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחשיכה. במקרה שלא ניתן לנתח את הדגימות באופן מיידי, אחסן אותן ב-0.5% paraformaldehyde בטמפרטורה של 4 °C כדי להבטיח קיבוע יציב.תמונה זו מציגה סדרה של נקודות זמן של היצמדות והתפשטות של טסיות דם על סלייד זכוכית מצופה ב-von Willebrand factor מקובע. הצבע הירוק מייצג את CD63, חלבון טרנס-ממברנלי המגויס אל פני השטח של הטסיות באופן תלוי זמן. באופן דומה, הצבע הכתום מייצג את P-selectin, שהוא גם חלבון טרנס-ממברנלי המוחדר לממברנה של גרנולות אלפא תוך-תאיות בעת עצירת הטסיות.בעקבות ניסוי זרימה, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית כדי להפיק סדרת הטיה (tilt series) של היצמדות טסיות הדם. כפי שנראה כאן, CD63 ממוקם בעיקר בגרנולומר המרכזי, בעוד ש-P-selectin מפוזר על פני גוף התא כולו ונראה מרוכז בשוליים. בניסויי אלה, טסיות דם, שאינן מכילות DNA גרעיני, הועברו דגירה מקדימה עם DAPI, המופיע בצבע כחול.במקרה זה, DAPI צובע את הפוליפוספטים ואת הגרנולות הצפופות (dense granules). צביעה ירוקה המופיעה בשלב מאוחר יותר מעידה על גיוס תלוי-זמן של CD63 אל פני השטח של הטסיות. למרות סימנים ברורים לשחרור גרנולות צפופות, ניתוח של תאים בודדים מראה כי הפוליפוספט נשמר בתוך טסיות אלו או על פני השטח שלהן.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך שש שעות עבור ארבעה ניסויי זרימה נפרדים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב למנוע הפעלה מוקדמת של טסיות הדם. ניתן להשיג זאת באמצעות מניפולציה זהירה של תרחיף התאים.בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, כדי להשיג תובנות נוספות לגבי ההתפלגות התלת-ממדית של מולקולות המטרה. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לחקור את תפקוד הטבחוניות תחת זרימה ברמת התא הבודד.

live-cell-imaging-of-platelet-degranulation-and-secretion-under-flow

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מפל הידבקות טסיות מתקיים בנוכחות זרימה גזירה, גורם לא היוו ב קונבנציונאלי (סטטי) היטב הצלחת מבחני. מאמר זה מדווח על assay טסיות צבירה תוך שימוש בתבנית microfluidic צלחת היטב לחקות פיסיולוגי תנאי הזרימה גזירה.

הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים Microfluidic

כאן אנו מדווחים טכניקה ניסויית של מיקרוסקופיה intravital פלואורסצנטי לדמיין אינטראקציות heterotypic טסיות דם נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים. טכנולוגיה מיקרוסקופית זה תהיה יקרה כדי לחקור את המנגנון המולקולרי של מחלת כלי דם ולבדוק סוכנים תרופתיים בתנאי pathophysiological.

הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

כדוריות דם לבנות לחצות את monolayer אנדותל באמצעות paracellular או מסלול transcellular. פיתחנו assay פשוט כדי לעקוב אחר חלוקת junctional אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial יקוציט תחת זרימה פיזיולוגית להפלות בין שני מסלולי הגלגול.

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

עירוי טסיות דם והמוסטזיס עוצבו באמצעות בנייה מחדש של דם ותאי זרימה מיקרופלואידיים כדי לחקור את תפקוד טסיות הדם. הנתונים מדגימים את ההשלכות של נגע אגירת טסיות דם על המוסטזיס, במבחנה.

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

מאמר זה מתאר מודל ניסיוני של המוסטאסיס המודד פונקציה וקרישה טסיות זמנית. טסיות קרינת הפיברין נמדדות בזמן אמת, וקצב הידבקות טסיות דם, קרישת שיעור, והתחלה של קרישה נחושה. המודל משמש כדי לקבוע מאפיינים טסיות procoagulant תחת זרם מתרכז עבור עירוי.

מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

לויקוציטים בלהיטות אינטראקציה עם טסיות הדם והתאים כלי הדם לאחר פציעה קיר הספינה או בעת דלקת. כאן, אנו מתארים assay מבוסס זרימה שכבתית פשוטה כדי לאפיין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות בין לויקוציטים ושותפים הסלולר שלהם.

מבחני מבוסס זרימה שכבתית לחקור ליקוציט גיוס על תאים בתרבית וסקולרית, טסיות חסיד

אנו מתארים שיטה בפתרון כדי להחיל להטות אחיד כדי קולטני משטח טסיות באמצעות קונוס-צלחת ויסבנסה. ניתן להשתמש בשיטה זו גם באופן כללי יותר כדי להחיל הטיה על סוגי תאים אחרים ושברי תאים, ואין צורך לייעד זוג מסוים של ליגולי-קולטן.

מדים להטות שיטת של טסיות האדם וקולטני פני שטח התא דרך קונוס-וזיקוק הלוח

אנו מתארים כאן את השיטה להדמיית מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם הגולגולתית של עכברים חיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית.

ב-Vivo הדמיה דו-פוטונית של מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם של גולגולת העכבר

היווצרות טסיות דם מעודדות נקשרה עם סיכון מוגבר לפקקת. מוצג כאן פרוטוקול מדויק לבידוד טסיות דם שטופות מדם אדם, שנועד לכמת את החשיפה של פוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחית, שהם מאפיינים ייחודיים של טסיות מעודדות.

אפיון טסיות מעודדות קרישה על ידי מדידת חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות מטסיות אדם מטוהרות

ניתן להעריך את תפקוד טסיות הדם תחת זרימה ולדמות החייאה המוסטטית באמצעות מכשיר מיקרופלואידי, שיש לו יישומים ברפואת טראומה ועירוי.

מיקרופלואידיקה בהערכת תפקוד טסיות הדם

ציטומטריית זרימה רב-צבעונית עבור טסיות יכולה לזהות תת-סוגים חדשים של טסיות דם בתוך תת-אוכלוסיות טסיות קלאסיות, כגון טסיות מנוחה, אגרגטוריות, פרוקו-קרישה ואפופטוטיות. זה מאפשר השוואה של דפוסי תת-אוכלוסייה שונים המושרים על ידי אגוניסטים שונים של טסיות דם. כאן מתואר בפירוט הליך להקמת פאנל ציטומטריית זרימה רב צבעוני.

ניתוח תת-אוכלוסיות טסיות על ידי ציטומטריית זרימה רב-צבעונית

למדו הדמיה בזמן אמת של תפקוד טסיות תחת זרימה באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר degranulation והפרשה ברמת תא בודד לחקר מנגנוני קרישת דם והמוסטזה.

Live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה

גלה סרטונים נוספים