קרום המוח Fractation: An אקס ויוו גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד חלבונים השייכים לתאים סינפטיים שונים ממוחם של עכברים. תיאור התפלגות רכיבי ההולכה הקינטית חיוני להבנת התפקוד הסינפטי הן בתנאים נורמליים והן בתנאים פתולוגיים. עדויות מצטברות מראות כי סינפסות in vivo הן דינמיות ביותר ויכולות לעבור שינויים מבניים דרמטיים המקיימים העברה סינפטית.

סינפסות נחקרו באופן קלאסי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. שיטת פיצול ממברנה זו מבוססת על שילוב של מחיקת לייזר באמצעות חומרי ניקוי עדינים בתנאי pH שונים ואחריהם צנטריפוגה של שבריר שנייה. בקצרה, מוח העכבר מוסר וההיפוקמפוס שלו מנותח בזהירות בכלי קר ונחמד שיושב על קרח כתוש.

ההיפוקמפוס נאסף לתוך צינור זכוכית Potter-Elvehjem המכיל מאגר בידוד קר כקרח. לאחר מכן, הרקמה שנאספה הומוגנית באמצעות מערבל הומוגניזציה. לאחר מכן, הרקמה ההומוגנית מעורבבת עם תמיסת סידן סוכרוז.

לאחר מכן תמצית הרקמה מכוסה בתמיסת סידן סוכרוז מרוכזת. לאחר מכן הדגימות עוברות צנטריפוגה. חלק הממברנה המכיל סינפטוזומים מזוהה בקלות כטבעת צפופה הצפה בתוך הממשק של תמיסת הסוכרוז.

לאחר מכן הבידוד של התאים התת-סינפטיים השונים, כלומר שברים נוספים, טרום ופוסט סינפטיים מושג על ידי שילוב של מסיסות אור באמצעות חומרי ניקוי עדינים בתנאי pH התמיינות. לבסוף, העשרת החלבון בתאים השונים מאומתת על ידי ניתוח אימונובלוט. ביום הניסוי מכינים תמיסות טריות ומצננים אותן על קרח.

הניחו את המוח בצלחת פטרי שיושבת על קרח כתוש ומכילה 10 מיליליטר של מאגר בידוד קר כקרח. נתחו בזהירות את ההיפוקמפוס בעזרת זוג מלקחיים. העבירו את ההיפוקמפוס לתוך צינור זכוכית של חמישה מיליליטר Potter-Elvehjem המכיל מיליליטר אחד של מאגר בידוד קר כקרח.

ואז הומוגניזציה באמצעות מערבל הומוגניזציה. העבירו את הרקמה ההומוגנית לתוך שפופרת פלקון של 15 מיליליטר המכילה את תמיסת הסוכרוז והסידן וערבבו אותה לאט על ידי היפוך הצינור. מניחים את התמיסה בצינור צנטריפוגה שקוף במיוחד ומוסיפים על גבי כל שפופרת 2.5 מיליליטר סוכרוז המכיל סידן כלורי.

וכיול את הצינורות עם תמיסת חיץ בידוד וצנטריפוגה למשך שלוש שעות ב-100,000 G בארבע מעלות בצנטריפוגה אולטרה-צנטריפוגה. הסר בזהירות את הצינור מתמיכת פלדת הצנטריפוגה וזהה את הטבעת הצפופה בתוך ממשק הסוכרוז המכילה את הסינפטוזומים. השליכו את שכבת הדיוור העליונה בעזרת קצה כחול.

בעזרת פיפטה של פסטר, אוספים את הטבעת הצפופה המכילה את שברי הסינפטוזומים ומעבירים לצינור צנטריפוגה שקוף במיוחד ושומרים על קרח כתוש. לדלל את הסינפטוזומים עם תשעה נפחים של מאגר בידוד קר קרח וצנטריפוגה למשך 30 דקות ב-15,000 גרם בארבע מעלות. לאחר צנטריפוגה, הסר את הצינור.

השליכו את הסופרנטנט. יש לראות כדור המכיל את הסינפטוזומים. השעו מחדש את הגלולה עם 1.1 מיליליטר של מאגר בידוד והמשיכו על קרח כתוש לשלב הבא.

הכינו תמיסות טריות עם ה-pH המתאים המותאם לארבע מעלות. הוסף לאט מיליליטר אחד של הכדור הסינפטוזומלי המרחף לחמישה מיליליטר של סידן כלורי בכוס על קרח תחת תסיסה מתמשכת. לאחר מכן בחמישה מיליליטר של מאגר מסיס מרוכז pH 6.

לאחר 50 דקות על קרח, העבירו את התמיסה לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה שקופה במיוחד בטמפרטורה של 40,000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות. לאחר צנטריפוגה, הסר את הצינור. יש להקפיד על כדור המכיל את השבר הקדם-סינפטי והפוסט-סינפטי.

הסופרנטנט המכיל את השבר הסינפטי הנוסף נאסף בצינור ריכוז של 15 מיליליטר. שטפו בזהירות את הגלולה עם מאגר המסיסות של שני מיליליטר pH שש. הימנע מהפרעה לגלולה והשליך את המאגר.

ב-10 מיליליטר של חוצץ מסיס pH שמונה לגלולה, וטיטראט בעזרת פיפטה פסטר. דגרו על קרח תחת תסיסה מתמשכת במשך 50 דקות. העבירו את התמיסה לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה שקופים במיוחד בטמפרטורה של 40, 000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות.

לאחר צנטריפוגה, הסר את הצינור. יש להבחין בכדור המכיל את השבר הפוסט-סינפטי. הסופרנטנט המכיל את השבר הקדם-סינפטי נאסף בצינור ריכוז של 15 מיליליטר.

הגלולה המכילה את השבר הפוסט-סינפטי מושעה מחדש עם 200 מיקרוליטר של תמיסת STS. סוניקציה של הכדור המרחף. הערך את כמות החלבון בכל שבר באמצעות בדיקת קביעת חלבון.

קח 20 מיקרוגרם חלבון מכל שבר וטפל במאגר דגימת אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד STS. הפרד חלבונים על ידי STS Polyacrylamide Gel Electrophoresis וניתוח על ידי אימונובלוט. GPR37 הוא קולטן גלובלי חלבוני מפואר נוסף בעיקר במוח מכרסמים.

מעורב בפתולוגיות שונות כמו מחלת פרקינסון או דיכאון מג'ורי, תפקודו נותר לא תקין. חקר נוכחותו של קולטן זה בסינפסות יכול לעזור לפענח את תפקידו במערכת העצבים המרכזית. סינפטוזומים מעכברי נוקאאוט מסוג בר ו-GPR37 בודדו ולאחר מכן חולקו.

הטוהר של כל תא תת-סינפטי הובטח על ידי ההפרדה של הסמנים הסינפטיים המתאימים. הסמן השלפוחית הסינפטי הנוסף סינפטופיזין הועשר בשבר סינפטי נוסף זה. חלבון BSD 95, סמן צפיפות פוסט-סינפטי קלאסי הועשר בשבר הפוסט-סינפטי המתאים.

לבסוף, טוהר השבר הקדם-סינפטי אומת על ידי נוכחותו של SNAP 25, סמן אזור פעיל קדם-סינפטי. מעניין שבעוד שתגובתיות חיסונית GPR 37 הייתה נפוצה יותר במקטע הסינפטי הנוסף, היא גם הראתה העדפה משמעותית לפוסט-סינפטי על פני השבר הקדם-סינפטי. הערכת הרכב החלבון התת-סינפטי היא אתגר חשוב במדעי המוח.

עם זאת, זו משימה לא קלה מכיוון שהיא מווסתת מאוד על ידי סרטי אינטראקציה של חלבון חלבון. כאן אנו מציגים פרוטוקול פיצול קרום מוח המייצג הליך חזק לבחירת חלבונים השייכים לתאים סינפטיים שונים. במילים אחרות, היא מתוארת של הטכנולוגיה הכימית שלך לביצוע העשרת חלבון מתאים קדם-סינפטיים, פוסט-סינפטיים ואקסטרה-סינפטיים.

להתראות ובהצלחה בניסויי הפיצול שלך.