Name: קרום המוח Fractation: An אקס ויוו גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: למד שיטת פירוק קרומי מוח לבידוד חלבונים מתאי עצב שונים בעכברים. שיטה זו מאפשרת חקר תפקוד סינפטי במצבים נורמליים ופתולוגיים באמצעות הפרדת תאי עצב וניתוח חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי Ministerio de EconomÃ ¢ â, ¬ â &quot;¢ â, ¬ â&quot; ¢ DE / Salud קרלוס השלישי (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 ו- PIE14 / 00034), המכון לאקדמיה של אוניברסיטת אקרה ), ובדוקטורט ו - FC שייכים לקבוצת המחקר &quot;נוירופרמקולוגיה וכאב&quot; (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251). . היצירה נתמכה גם על ידי &quot;תוכנית הפיסכיאדאריות ביקור בקרנות מיוחדות&quot; מ - CAPES (ברזיל) ל FC

כל ההליכים הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת ברצלונה לשימוש בבעלי חיים וטיפול בבעלי חיים (CEEA), בהתאם לקווים המנחים המתוארים במדריך לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה 11 ובעקבות הקהילה האירופית, חוק 86/609 / CCE, FELASA ו- ARRIVE. לפיכך, עכברים שוכנים בכלובים סטנדרטיים, עם גישה למודעה libitum למזון ומים, והם נשמרים בתנאים סטנדרטיים מבוקרים (12 שעות כהה / אור מחזור החל בשעה 7:30 בבוקר, 22 ° C טמפרטורה, ו 66% לחות). 1. קבלת עכבר Synaptosomes המוח באמצעות מעבר Surorose רציפה הערה: שיטה זו דווחה בעבר 10 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ בידוד טרי (IB), pH 7.4; 2 סוכרוז M; 1 סוכרוז M / 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 ; ו 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 (ראה טבלה 1 ). צינת הפתרונות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Saלהקריב חמישה עכברים על ידי נקע צוואר הרחם. לערוף במהירות להסיר את המוח של כל חיה. לנתח את האזור המוח של עניין (כלומר, את ההיפוקמפוס, 0.25-0.35 גרם של רקמות טריות) ומניחים אותו 5 מ&quot;ל פוטר- Elvehjem צינור זכוכית על קרח עם 1 מ&quot;ל של IB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize הרקמה באמצעות stogener homogenizing (10 משיכות ב 700-900 סיבובים לדקה), מועדף באמבט קרח כדי למנוע התחממות המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרקמה homogenized (1 מ&quot;ל) לתוך צינור 15 מ&quot;ל המכיל 6 מ&quot;ל של סוכרוז M 2 ו 2.5 מ&quot;ל של 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 ב 4 מעלות צלזיוס. מערבבים לאט על ידי הפניית הצינור. הערה: תוספת סידן חיונית לשמירה על יחסי הגומלין בין האברונים ובכך לשמר את המבנה של &quot;הצפיפויות&quot; השונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפתרון בצינור 12 צנטריפוגות מ&quot;ל ולאט לאט להוסיף 2.5 מ&quot;ל של 1 סוכרוז M / 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 על גבי כל צינור כדי ליצור את שיפוע סוכרוז. הערה: תווית את המיקום oF ממשק שיפוע על צינור צנטריפוגה באמצעות סמן קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ולאזן את צינורות צנטריפוגה עם פתרון IB בתוך תומכת הפלדה המקביל שלהם עם העפעפיים הסגירה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך 3 שעות ב 100,000 x גרם ו 4 ° C באמצעות צנטריפוגה דלי נדנדה נדנדה. מלא לחלוטין את הרוטור עם כל תומך פלדה (אפילו ריק, אם נדרש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את השכבה העליונה המכילה myelin. עם פיפטה פסטר, לאסוף את הטבעת הלבנה בין 1.25-M ו 1-M סוכרוז interfase המקביל לחלק synaptosome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את synaptosomes עם 9X נפח שלהם באמצעות IB בצינור צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ולאזן את צינורות צנטריפוגה עם פתרון IB בתוך תומכת הפלדה המקביל שלהם עם העפעפיים הסגירה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך 30 דקות ב 15,000 x גרם ו 4 ° C באמצעות צנטריפוגה דלי נדנדה נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את supernatant ו resuspend thE גלולה עם 1.1 מ&quot;ל של פתרון IB. איסוף 100 μL של פתרון זה צנטריפוגלי צנטריפוגה 5 דקות ב 11,000 x ו 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה synaptosomal 5% נתרן dodecyl סולפט (SDS) ולאחסן את המדגם ב -20 מעלות צלזיוס. הערה: מדגם זה יתאים את החלק השלם synaptosome לניתוח נוסף כתם המערבי. את החלק הנותר synaptosomal (~ 1 מ&quot;ל) יכול להיות מוקפא ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש או מעובד עבור שבירה subsynaptic הבאים. סינפוזומים או סינפסות מטוהרים מייצגים בין 1 ל 2% מכלל נפח ההיפוקמפוס 12 . </li></ol> 2. בידוד, post- ו extrasynaptic- בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2x חיץ טרי solubilization, pH 6.0; 1x חיץ solubilization, pH 6.0; חיץ solubilization, pH 8.0; ו 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 (ראה טבלה 1 ). צינת הפתרונות על הקרח. הערה: ה- pH של פתרונות אלה צריך להיות מדויקY מותאם כדי להשיג פיצול subsynaptic טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לדלל את החלק 1 מ&quot;ל resuspended חלק סינפטוזומלי (ראה שלב 1.12) עם 5 מ&quot;ל של 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את אותו נפח (5 מ&quot;ל) של חיץ קר 2x קר solubilization, pH 6.0, ו דגירה של 50 דקות על הקרח תחת תסיסה גבוהה בכוס על הקרח. הערה: בעוד 1% של Triton X-100 ב pH 6.0 solubilizes כל חלבונים ממברנה פלזמה, הוא משמר חלבונים בתוך אנשי קשר או צמתים סינפטיים ( כלומר, מבנים preysynaptic מראש) 4 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפתרון בצינור צנטריפוגות. לשקול ולאזן את צינורות עם כרכים שווה של 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 ו 2x פתרון חיץ solubilization, pH 6.0, בתוך תומך פלדה המתאימים שלהם עם העפעפיים הסגירה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך 30 דקות ב 40,000 x גרם ו 4 ° C באמצעות צנטריפוגה דלי נדנדה נדנדה. התוצאה supernatant מייצג את החלק extrasynaptic,ואת גלולה תואמת את צמתים סינפטיים ( כלומר, שברים מראש ו postsynaptic). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכז את supernatant המכיל את החלק extrasynaptic ל 200 נפח μL הסופי באמצעות צינור 15 מ&quot;ל 10K מסנן צנטריפוגה ב XG 4,000 ו 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז את החלק הנוסף extrasynaptic מרוכזת (200 μL) עם 5 כרכים (1 מ&quot;ל) של אצטון מראש (-20 מעלות צלזיוס) לילה ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, צנטריפוגות שבר extrasynaptic במשך 30 דקות ב 18,000 x ו -15 ° C. לאחר צנטריפוגה, להשמיד את אצטון supernatant ויבש את גלולה כדי להסיר כל עקבות של אצטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, resuspend גלולה המכילה את החלבונים extrasynaptic עם μL 200 של 5% SDS. Sonicate גלולה, אם נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי לשבש את זה, בזהירות לשטוף את גלולה המכילה את שברים מראש ו postsynaptic עם 2 מ&quot;ל של חיץ solubilization 1x, pH 6.0. מחק את המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspendגלולה עם 10 מ&quot;ל של חיץ solubilization 1x, pH 8.0, באמצעות פיפטה זכוכית פסטר. הערה: בעוד 1% של Triton X-100 ב pH 8.0 solubilizes ההתמחות presynaptic, זה משמר את הצפיפות postsynaptic מסיס 4 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ההשעיה במשך 50 דקות על הקרח תחת תסיסה גבוהה בכוס על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפתרון בצינור צנטריפוגות. לשקול ולאזן את צינורות עם תמיסה 1x solubilization חיץ, pH 8.0, בתוך תומך פלדה המתאימים שלהם עם העפעפיים הסגירה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך 30 דקות ב 40,000 x גרם ו 4 ° C באמצעות צנטריפוגה דלי נדנדה נדנדה; וכתוצאה מכך supernatant מתאים את שבר presynaptic ואת גלולה לחלק postsynaptic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך supernatant המכיל את שבר presynaptic, כמתואר צעדים 2.6-2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את גלולה המכילה חלק postsynaptic עם μL 200 של 5% SDS. Sonicate גלולה, אניF נדרש. </li></ol> 3. לנתח את הדגימות על ידי immunoblot כדי לאמת את החלוקה הממברנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את כמות החלבון בכל חלק ( כלומר, השברים הכולל, תוספת, לפני ואחרי סינפטית) באמצעות assay חומצה bicinchoninic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 20 מיקרוגרם של חלבון מכל חלק לדלל אותו לנפח הסופי של μL 50 ב SDS-polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) חיץ מדגם. מרתיחים במשך 5 דקות ב 100 מעלות צלסיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד את החלבונים על ידי SDS-PAGE אלקטרופורזה 10%, עם ג&#39;ל ריכוז 4% תחת צמצום התנאים. Electrophorese במתח קבוע של 80 V עד הצבע נכנס ג&#39;ל התחתון ולאחר מכן להגביר את המתח 120 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את החלבונים לקרום PVDF לחסום עם פתרון חסימת IB למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר תחת רעידות מתמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של קרום לילה ב 4 מעלות צלזיוס עם הנוגדן העיקרי המצוין ( כלומר, נגד SNAP-25,אנטי PSD-95, anti-synaptophysin, או אנטי GPR37) מדולל פתרון חסימת IB תחת רעידות מתמשכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם פתרון כביסה IB לחסל נוגדן ראשוני מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם הנוגדן המשני המצוין במשך 90 דקות בתנאים כהים בטמפרטורת החדר תחת רעד מתמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם פתרון כביסה IB לחסל נוגדנים משני לא מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הממברנה עם המצע chemiluminescent (להכין את התערובת בתנאים חשוכים בעקבות 1: 1 פרופורציה של פתרון A ו- B המסופק על ידי היצרן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הממברנה במכשיר זיהוי chemiluminescent. </li></ol>

<ol><li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="https://archive.org/details/textbookofphysio1897fost">Part III: The Central Nervous System.</a> A Text Book of Physiology. , Macmillan: London. (1897).</li>
<li>Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22The+fine+structure+of+the+nervous+system%22">The fine structure of the nervous system</a>. , Oxford University Press. New York. (1991).</li>
<li>Harris, K. M., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22357909">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).</li>
<li>Phillips, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presynaptic+particle+web%3A+ultrastructure%2C+composition%2C+dissolution%2C+and+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution.</a> Neuron. 32, 63-77 (2001).</li>
<li>Pinheiro, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+immunological+identification+of+presynaptic+alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+acid+receptors+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus.</a> Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).</li>
<li>Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+adenosine+A%281%29+receptors+in+nerve+terminals+and+synapses+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus.</a> Brain Res. 987, 49-58 (2003).</li>
<li>Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+synaptic+and+subsynaptic+localization+of+adenosine+A2A+receptors+in+the+hippocampus+and+striatum+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat.</a> Neuroscience. 132, 893-903 (2005).</li>
<li>Rodrigues, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Presynaptic+Control+by+ATP+of+Glutamate+Release+via+Facilitatory+P2X1%2C+P2X2%2F3%2C+and+P2X3+and+Inhibitory+P2Y1%2C+P2Y2%2C+and%2For+P2Y4+Receptors+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat.</a> J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).</li>
<li>Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsynaptic+localization+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunits%3A+a+comparative+study+in+the+mouse+and+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum.</a> Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).</li>
<li>Lopes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+parkinson%27s+disease-associated+receptor+GPR37+in+the+hippocampus%3A+functional+interplay+with+the+adenosinergic+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system.</a> J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).</li>
<li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Special+Report%3A+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR J. 38, 41-48 (1997).</li>
<li>Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapses+in+hippocampus+occupy+only+1-2%25+of+cell+membranes+and+are+spaced+less+than+half-micron+apart%3A+a+quantitative+ultrastructural+analysis+with+discussion+of+physiological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications.</a> Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).</li>
<li>Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+endothelin+receptor+type-B-like+gene+enriched+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).</li>
<li>Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropeptide+head+activator+loses+its+biological+acitivity+by+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization.</a> EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).</li>
<li>Rezgaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropeptide+head+activator+is+a+high-affinity+ligand+for+the+orphan+G-protein-coupled+receptor+GPR37%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37.</a> J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).</li>
<li>Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease-associated+GPR37+receptor-mediated+cytotoxicity+is+controlled+by+its+intracellular+cysteine-rich+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain.</a> J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).</li>
<li>Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR37+and+GPR37L1+are+receptors+for+the+neuroprotective+and+glioprotective+factors+prosaptide+and+prosaposin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).</li>
<li>Takahashi, R., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pael+receptor%2C+endoplasmic+reticulum+stress%2C+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease.</a> J. Neurol. 250, 9(2003).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המוצג כאן מהווה כלי ביוכימי רב עוצמה לחקר ההתפלגות התת-סינפטית של חלבונים ספציפיים בכל אזור במוח. עם זאת, ישנם כמה חסרונות אינהרנטיים לטכניקה שראוי להדגיש כאן. לדוגמה, אחת המגבלות העיקריות היא הכמות הגדולה יחסית של רקמה הדרושה לטיהור כמות סבירה של חלבון על מנת לבצע את ניתוח הכתמים החיסוניים של כל השברים התת-סינפטיים. בעיה זו עשויה להיות קשורה לעובדה שסינפסות (כלומר, סינפטוזומים) מייצגות רק 1-2% מכלל נפח ההיפוקמפוס12. ואכן, בין 1 ל-1.5 גרם של רקמה טרייה (כלומר, ההיפוקמפו...

שידור סינפטית מסתמך על השלמות הפיזית של הסינפסה, מושג שנחזה כבר בתחילת 1897 על ידי פוסטר ו Sherrington 1 . לכן, הבנת התפלגות של מרכיבים ניירוטרנסמיים מרכזיים ( למשל, תעלות יונים, קולטנים וכו &#39; ) חיונית להבהרת הפונקציה הסינפטית, הן בתנאים הנורמליים והן בפתולוגים. מיקרוסקופית אלקטרונים (EM) תרמה רבות לרעיון ultrastructural הנוכחי של סינפסות מערכת העצבים המרכזית (CNS). בדרך זו, EM הקימה היטב את ההבדלים בין צפיפות טרום-פוסטינפטית, אשר מופרדים על ידי סדק של מרחק אחיד למדי (~ 25 ננומטר) 2 . מעניין, את מנגנון postsynaptic מציגה רציפה יחסית, עיבוי צפוף אלקטרונים מתחת קרום הפלזמה שלה, שנקרא צפיפות postsynaptic, או PSD 2 . לעומת זאת, במנגנון presynaptic, הודעה<html> E רשת רציפה cytomatrix מסודרת בדיוק מתחת קרום פלזמה, אשר חיוני היישור ואת עגינה של שלפוחית ​​סינפטי לאזור קרום פלזמה פעיל 3 . לפיכך, EM מהווה את הגישה הניסויית הזהב לסקור את החלוקה של חלבונים בתוך סינפסה CNS נשמר מבנית. עם זאת, המידע שסופק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הוא סטטי. ואכן, הצטברות הראיות עולה כי סינפסות vivo הם דינמיים מאוד, ובכך חווים שינויים מבניים דרמטי על שידור סינפטי מתמשכת. בנוסף, המורפולוגיה ואת הרכב הסינפסות יכול להשתנות בכל אזורי CNS שונים על התפתחות, התבגרות, הזדקנות, ופיתוח של תנאים נוירופתולוגי. בסך הכל, פרוטוקול התמקד בידוד חלבונים השייכים תאים סינפטי שונים בתנאים פיזיולוגיים מייצג כלי רב ערך עבור מחקר מקיף יותר של תפקוד סינפטי. Lace = &quot;jove_content&quot;&gt; כאן, אנו מתארים סוג זה של גישה ניסויית משלימה, המאפשרת העשרה ביוכימית הכנה של תאים שונים קרום סינפטי, כלומר, תוספת, מראש ו-דפוסי postsynaptic הממברנה. שיטה זו שברירית הממברנה, שתוארה לראשונה על ידי Philips et al . (2001) 4 , מבוסס על שינוי pH כי מחלישה את אינטראקציות דבק המתרחשים בתוך מראש ו postsynaptic המנגנון. ראשית, באמצעות דטרגנטים מתונה ב pH 6.0, ניתן להבחין צומת adherers המחזיקה מראש ו postsynaptic המנגנון וכי נשמר מן תחום קרום extrasynaptic, אשר solubilized ולכן ניתן לחלץ מן אנשי הקשר הסינפטי. לאחר מכן, העלאת ה- pH מ 6.0 ל 8.0 בנוכחות דטרגנטים מתון מחליש את כוח צומת adherens שמחזיק את אזור פעיל presynaptic בחוזקה הצפיפות postsynaptic. לפיכך, התא presynaptic הוא כל כךLubilized ויכול להיות מופרדים צפיפות postsynaptic, אשר נשמר בעיקר בגלל ריכוז של חומר ניקוי בשימוש לא לקדם solubilization שלה 4 . מעניין, יעילות הפיצול, בסופו של דבר גבוה מ -90%, ניתן לאשר על ידי סמנים subsynaptic שונים: i ) synaptosomal הקשורים חלבון 25 (SNAP-25), מן אזור פעיל presynaptic; Ii ) synaptophysin, מן חלק extrasynaptic ( כלומר, מחוץ לאזור פעיל כולל microsomes); ו iii ) postsynaptic צפיפות חלבון 95 (PSD-95), מן צפיפות postsynaptic. יש לציין, שיטה זו שבירת המוח קרום שימש בהצלחה. לפיכך, ניתן היה לקבוע במדויק את לוקליזציה subynaptic של קולטנים שונים, כגון קולטנים שונים של אלפא-אמינו-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) 5 , אדנוזין קולטן A 1 (A 1 R) 6 ,אדנוזין קולטן 2A (A 2A R) 7 , אדנוזין טריפוספט (ATP) קולטנים P2 8 , קולטן אצטילכולין ניקוטין 9 , ו קולטן מחלת פרקינסון הקשורים GPR37 10 . עם זאת, מספר מגבלות עלול לעכב את הערכה נכונה של התפלגות הסינפטי של חלבון עצבי מסוים. לכן, בהליך זה, אנו לא רק לתאר באופן מלא את הפרוטוקול כולו, אבל אנחנו גם להדגיש כמה נקודות קריטיות להיחשב, כגון כמות גדולה למדי של רקמות הצורך, התשואה חלבון נמוך, ואת הדרישה המנדטורית כדי לאמת את היעילות של כל הפרדה לפני ביצוע הניסוי מוגדר.

<table><tbody><tr><td>סוכרוז</td><td>לבלב Qu&iacute; mica SL, ברצלונה, ספרד</td><td>1,316,211,211</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, ברצלונה, ספרד</td><td>2,112,211,210</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>לבלב Qu&iacute; נציץ SL, ברצלונה, ספרד</td><td>1,313,961,210</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז סט III</td><td>Millipore, דרמשטדט, גרמניה</td><td>535140</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>לבלב Qu&iacute; נציץ SL, ברצלונה, ספרד</td><td>1,236,541,209</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול לבלב כחול</td><td>Qu&iacute; mica SL, ברצלונה, ספרד</td><td>1,311,651,604</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>חלב</td><td></td><td></td><td></td>יבש ללא שומן</tr><tr><td>NaCl</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, ברצלונה, ספרד</td><td>1,216,591,211</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, ברצלונה, ספרד</td><td>1,314,941,210</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>4873</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, ברצלונה, ספרד</td><td>1,316,781,211</td><td></td></tr><tr><td>בסיסי 20 pH</td><td>Crison, Alella, ספרד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer</td><td>VWR, Radnor, PA, ארה"ב.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות אולטרה-שקופים (14x89 מ"מ)</td><td>בקמן קולטר, הוספיטלט דה לוברגאט, ברצלונה</td><td>344059</td><td>יש למלא את הצינורות כמעט לחלוטין כאשר משתמשים בהם כדי למנוע קריסה עקב אולטרה-צנטריפוגה.</td></tr><tr><td>מסננים צנטריפוגליים Amicon Ultra-15 Ultracel -10K</td><td>Merck Millipore, דרמשטאדט, גרמניה</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5430R</td><td>Eppendorf, המבורגו, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אופטימה L-90K אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר, הוספיטלט דה לוברגאט, ברצלונה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סוניפייר 250</td><td>ברנסון, דנבורי, קונטיקט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמרשם אימג'ר 600</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, ברצלונה, ספרד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטס זכוכית חד פעמית פסטר 230 מ"מ</td><td>VWR, רדנור, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>איזון קומפקטי EK-610</td><td>A& D, טוקיו, יפן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פירס אנד טרייד; ערכת בדיקת חלבון BCA</td><td>פירס ביוטכנולוגיה, רוקפורד, אילינוי, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal west pico chemiluminescent מצע Thermo</td><td>Fisher Scientific Inc., וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GR 200 Precision Balance</td><td>A& D, טוקיו, יפן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GPR37</td><td>נוגדן תוצרת בית נגד GPR37 מיוצר ואושר במעבדת פרנסיסקו סירואלה.</td><td></td><td>נוגדנים ראשוניים המשמשים בריכוז סופי של 0.250 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin</td><td>Abcam, קיימברידג', בריטניה</td><td></td><td>נוגדנים ראשוניים מדוללים 1:10,000</td></tr><tr><td>HRP מצומד עז נגד עכבר IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב.</td><td></td><td>נוגדן משני מדולל 1:10,000</td></tr><tr><td>HRP מצומד עז נגד ארנב IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"ב.</td><td></td><td>נוגדן משני מדולל 1:30,000</td></tr></tbody></table>

קרום המוח fractation: an<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

הערכת הרכב החלבון הסינפטי ותפקודו מהווה אתגר חשוב בתחום מדעי המוח. עם זאת, לא קל להעריך נוירוטרנסמינציה המתרחשת בתוך סינפסות כי זה מוסדר מאוד על ידי אינטראקציות חלבונים דינמי דינמי ואירועים זרחן. לפיכך, כאשר כל שיטה משמשת כדי ללמוד שידור סינפטית, המטרה העיקרית היא לשמור על שינויים אלה פיזיולוגיים חולף. כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים. במילים אחרות, פרוטוקול מתאר מתודולוגיה ביוכימי לבצע העשרת חלבון מ presynaptic, postsynaptic, ו extrasynaptic תאים. ראשית, synaptosomes, או מסופים סינפטי, מתקבלים נוירונים המכילים את כל תאים סינפטיים באמצעות שיפוע סוכרוז רציפה. ראוי לציין, את האיכות של ההכנה הראשונית הממברנה הסינפטי הזה הוא גקריטי. לאחר מכן, בידוד של תאים subsynaptic שונים מושגת עם solubilization קל באמצעות דטרגנטים מתונים בתנאים pH דיפרנציאלי. זה מאפשר הפרדה לפי צנטריפוגה ו צנטריפוגות isopycnic. לבסוף, העשרת החלבון בתאים הסובסינפטיים השונים ( כלומר, שברי קרום לפני ואחרי) נבדקה באמצעות ניתוח אימונובלוט תוך שימוש בסמנים חלבונים סינפטיים המאופיינים היטב ( כלומר, SNAP-25, PSD-95 ו- synaptophysin, בהתאמה), ובכך מאפשר הערכה ישירה של התפלגות הסינפטי של כל חלבון נוירונים מסוים.

המתודולוגיה המתוארת שימשה בעיקר לניתוח subsynaptic של חלבונים עצביים בכלל לבידוד אפיון ביוכימי של קולטנים סינפטיים 5 , 6 , 7 , 8 , 9 בפרט. מעניין, התוצאה נציג מוצג כאן להראות את התועלת של הליך זה ניסיוני לניתוח ההפצה בהיפוקמפוס subsynaptic של קולטן G יתום-מצמידים חלבון- כלומר, קולטן פרקי...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים.

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד חלבונים השייכים למדורים סינפטיים שונים ממוח של עכברים. תיאור ההתפלגות של רכיבי תמסורה קינטיים חיוני להבנת התפקוד הסינפטי הן בתנאים נורמליים והן בתנאים פתולוגיים. ראיות מצטברות מראות כי סינפסות in vivo הן דינמיות ביותר ויכולות לעבור שינויים מבניים דרמטיים תוך שמירה על תמסורה סינפטית.סינפסות נחקרו באופן קלאסי באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית. שיטה זו של הפרדת מקטעי ממברנה מבוססת על שילוב של השמדה בלייזר באמצעות דטרגנטים עדינים בתנאי pH שונים, ולאחריה סנטריפוגציה של שבריר שנייה. בקצרה, מוצאים את מוח העכבר ואת ההיפוקמפוס שלו מנתחים בזהירות בצלחת קרה המונחת על קרח גרוס.את ההיפוקמפוסים אוספים לתוך מבחנת זכוכית מסוג Potter-Elvehjem המכילה תמיסת בידוד קרה במיוחד. לאחר מכן, את הרקמה שנאספה הומוגניזים באמצעות מערבל הומוגניזציה. בשלב הבא, מערבבים את הרקמה ההומוגנית עם תמיסת סוכרוז וסידן.לאחר מכן, מעל לתמצית הרקמה מוסיפים שכבה של תמיסת סימפסקה (סוכרוז) ריכוזית עם סידן. לאחר מכן, את הדגימות סובבים בצנטריפוגה. ניתן לזהות בקלות את פראקציית הממברנה המכילה סינפטוזומים כטבעה דחוסה הצפה בממשק של תמיסת הסוכרוז.בשלב הבא, בידוד התחומים התת-סינפטיים השונים, כלומר הפרקציות חוץ-סינפטיות, פרה-סינפטיות ופוסט-סינפטיות, מושג על ידי שילוב של המסה קלה באמצעות דטרגנטים עדינים תח

brain-membrane-fractionation-an-ex-vivo-approach-to-assess

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

ב חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים על coverslips מיקרוסקופ מאפשר הדמיה של לוקליזציה חלבון.

ב ההיפוך חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים חסיד שאינן חסיד

הליך זה מדגים כיצד לבודד מהמוח המבוגר עכבר קרומי המיטוכונדריה או MAMs הקשורים ER וmicrodomain המועשרים glycosphingolipid השברים מMAMs ותכשירי המיטוכונדריה.

ממברנות המיטוכונדריה הקשורים ER (MAMs) וMicrodomains Glycosphingolipid המועשר (אובניים חן): בידוד ממוח עכבר

סחר קרום עצבי דינמי שולט זמינה פלזמה קרום חלבון ומשמעותי עצבית משפיע. נכון להיום, זה כבר מאתגר למדוד סחר endocytic עצבי בנוירונים בוגרים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה מאוד, כמוני למדידת שינויים מהירים בביטוי חלבון פני השטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות.

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

מאמר זה מפרט את ההעשרה של חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז רציף. ההכנה הבאה של חלבוני צפיפות פוסט סינפטי מתואר גם. הכנות חלבון מתאימות למערבי סופג או ניתוח 2D DIGE.

הכנת Synaptic פלזמה ממברנה וחלבוני צפיפות Postsynaptic באמצעות שיפוע סוכרוז רציף

זיהוי מולקולות ומסלולים השולטים בגמישות הסינפטית ובזיכרון הוא עדיין אתגר מרכזי במדעי המוח. כאן, מתואר תהליך עבודה המתייחס לכימות היחסי של חלבונים סינפטיים המעורבים כביכול בארגון מחדש מולקולרי של סינפסות במהלך למידה וגיבוש זיכרון בפרדיגמת למידה שמיעתית.

גבוהה פרופיל Proteome Synaptic החלטה כמותי של אזורים במוח העכבר לאחר למידה אפליה שמיעתית

שלפוחית סינפטית אנדוציטוזה מזוהה על ידי מיקרוסקופ אור של pHluorin התמזגו עם שלפוחית סינפטית חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של ספיגת שלפוחית.

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

חשמל התקף (ECS) הוא מודל חיה ניסיוני של נזעי חשמל עבור דיכאון חמור. ECS מעוררת באופן גלובלי פעילות ההיפוקמפוס, המוביל synaptogenesis פלסטיות סינפטית. כאן, אנו מתארים שיטות עבור ה-ECS אינדוקציה בחולדות, fractionation subcellular של hippocampi שלהם כדי לבחון שינויים התקף-induced חלבונים סינפטיים.

חשמל התקפים חולדות ו Fractionation של Hippocampi שלהם כדי לבחון תפיסה-induced שינויים בחלבונים Postsynaptic צפיפות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע ניתוח כמותי של הרמה של התאחדות קרום פלזמה מתויג fluorescently חלבונים הקשורים באופן עקיף. השיטה מבוססת על פירוק חישובית של קרום ומרכיב cytoplasmic של האות נצפו תאים עם תוויות עם סמן פלורסנט קרום פלזמה.

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

כאן, אנו מתארים גישה כמותית לקביעת ההתפלגות של חלבון סינפטית יחסית חלבון סמן באמצעות צביעת immunofluorescence ', ' מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח מבוססת מחשב.

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-קריואיפקס, בה חלבון ממברנה APEX2 מתויג יכול להיות מקומי על ידי שידור אלקטרון מיקרוסקופ בתוך מבנה מיטבי משומר התא.

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

פרוטוקול זה מציג שיטה חזקה ומפורטת להשגת סינפטוזומים טהורים ביותר, שלפוחיות סינפטיות ושברים סינפטיים אחרים ממוח העכבר. שיטה זו מאפשרת הערכה של תהליכים סינפטיים, כולל ניתוח ביוכימי של לוקליזציה ותפקוד חלבונים ברזולוציה מדורית.

פיצול תת-תאי לבידוד רכיבים סינפטיים ממוח מורין

למד שיטת פירוק קרומי מוח לבידוד חלבונים מתאי עצב שונים בעכברים. שיטה זו מאפשרת חקר תפקוד סינפטי במצבים נורמליים ופתולוגיים באמצעות הפרדת תאי עצב וניתוח חלבונים.

קרום המוח Fractation: An

גלה סרטונים נוספים