Glycoproteomics של מטריקס: שיטה Intact ניתוח Glycopeptide באמצעות ספקטרומטריית מסה

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לנתח את הרכב חלבוני המטריצה החוץ-תאית, כולל זיהוי אתרי גליקוזילציה ואפיון הרכב של צורות גליקן ברקמות קרדיווסקולריות. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתהליך של פיברוזיס של רקמה, כגון כיצד גליקוזילציה של מטריצה מבנית משפיעה על פיברוזיס של רקמה במהלך מחלה קרדיווסקולרית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שבניגוד לפרוטוקולים קודמים המנתחים שינויי גליקוזילציה כלליים, היא מאפשרת אפיון של גליקוזילציה באתרים ספציפיים של חלבונים במטריצה מבנית, ובכך מספקת כלי למחקרי מעקב מכניסטיים ממוקדים יותר.

את הפרוצדורות תדגים ד"ר Marika Fava וגב' Ferheen Baig מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הכין את כל תשבירי המיצוי (extraction buffers) כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, השתמש בסכין מנתחים (scalpel) כדי לחתוך 20 עד 50 מיליגרם של רקמה לשלושה או ארבעה חתיכות קטנות יותר בגודל של כ-2 מילימטרים.

הניחו את הרקמה החתוכה לקוביות לתוך מבחנה של 1.5 מיליליטר והוסיפו 500 מיקרוליטר של PBS קר מאוד. שטפו את הרקמה חמש פעמים באמצעות 500 מיקרוליטר של PBS לכל שטיפה כדי לצמצם את זיהום הדם. העבירו את הדגימות השטופות למבחנה של 1.5 מיליליטר עם מכסה הברגה והוסיפו נפח של בופר נתרן כלורי (sodium chloride buffer) פי 10 ממשקל הרקמה.

ערבבו במערבל וורטקס (Vortex) במהירות מינימלית למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו את התמצית למבחנות צנטריפוגה חדשות וסבבו בצנטריפוגה ב-16,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שטפו קצרות את משקעי הרקמה שהתקבלו בבופר סודיום כלוריד טרי.

לאחר מכן, הוסיפו נפח של SDS buffer פי 10 ממשקל הרקמה וערבבו במכשיר וורטקס במהירות מינימלית למשך 16 שעות בטמפרטורת החדר. העבירו את התמצית לשפורי צנטריפוגה חדשים וסבבו בצנטריפוגה ב-16,000 times G למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שטפו את המשקעים שהתקבלו במים מזוקקים פעמיים.

הוסיפו נפח של תמיסת בופר גוואנידין הידרוכלוריד השווה לחמישה פעמים משקל הרקמה, וערבבו במכשיר vortex במהירות מקסימלית למשך 72 שעות בטמפרטורת החדר. העבירו את התמצית שהתקבלה למבחנות חדשות וסבבו בצנטריפוגה ב-16,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C. לאחר כימות החלבון, העבירו אליקוט של 10 µg למבחנה חדשה עבור כל דגימה לצורך הערכת תפוסת אתרי הגליקוזילציה, ו-50 µg למבחנה נפרדת לצורך ניתוח ישיר של גליקופפטידים.

הוסיפו לכל דגימה את פי 10 מנפח האתנול והדגירו למשך לילה ב-20 °C. למחרת, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-16,000 ×g למשך 30 דקות ב-4 °C. שאבו את הנוזל העליון, תוך הקפדה שלא להפריע למשקע השקע.

לאחר מכן, השתמשו במרכז ריכוז בוואקום כדי לייבש את המשקעים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוסיפו 10 µL של תמיסת דגליקוזילציה מוכנה לכל דגימה. הכניסו את מבחנות הדגימה לתוך מבחנה קונוית של 50 mL והדגירו בזווית של 45 מעלות למשך שעתיים בטמפרטורה של 25 °C.

לאחר מכן, העלו את הטמפרטורה ל-37 °C והדגירו למשך 36 שעות תחת ערבוב עדין. לאחר צנטריפוגציה ב-16,000 ×g למשך דקה אחת, השתמשו במרכז ריכוז בוואקום בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות כדי לאדות את המים. השביחו מחדש את הדגימות המיובשות עם 10 µL של מים המסומנים ב-O-18 המכילים 50 units/mL של PNGase F. הדגירו למשך 36 שעות ב-37 °C תחת ערבוב קבוע, ולאחר מכן בצעו עיכול טריפסין בתמיסה (in-solution trypsin digestion) עבור כל הדגימות והמשיכו בניקוי C-18.

ראשית, הוסף 200 µL של methanol לכל באר בלוח הספין C-18 כדי להפעיל את הסורבנט. סבב במערך צנטריפוגה ב-1,000 ×g למשך דקה אחת. לאחר מכן, הוסף 200 µL של 80% ACN ו-0.1% TFA במים לכל באר וסבב במערך צנטריפוגה ב-1,000 ×g למשך דקה אחת.

בשלב הבא, הוסיפו לכל באר 200 µL של תמיסה המכילה 1% ACN ו-0.1% TFA במים, וסבבו בצנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 1,000 ×g. חזרו על הוספת התמיסה ועל הסבב בצנטריפוגה פעמיים נוספות. לאחר מכן, העמיסו את הדגימות לבארי של פלטת הספין (spin plate) וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 1500 ×g למשך דקה אחת. העמיסו מחדש את הנוזל שעבר (flow through) וחזרו על הסבב בצנטריפוגה.

לאחר מכן, הוסיפו לכל באר 200 microliters של תמיסה המכילה 1%ACN ו-0.1%TFA במים, וסובבו במערך צנטריפוגי במהירות של 1500 times G למשך דקה אחת. חזרו על הוספת תמיסה זו ועל הצנטריפוגציה פעמיים. לאחר מכן, הוסיפו לכל באר 170 microliters של תמיסה המכילה 50%ACN ו-0.1%TFA במים וסובבו במערך צנטריפוגי במהירות של 1500 times G למשך דקה אחת.

חזור על הוספה וסבב צנטריפוגה אלה פעם נוספת. השתמש במרכז vacuum כדי לייבש את התמריר המשולב בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. אחסן את הדגימות המיובשות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש.

לאחר מכן, בצע ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב ספקטרומטריית מסות טנדם (LC-MS/MS) על הדגימות המיועדות להערכת תפוסת אתרי הגליקוזילציה. עבור דגימות המיועדות לניתוח ישיר של גליקופפטידים, התחל תחילה בסימון TMT zero סטנדרטי כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לתחילת התהליך, הוסף לכל 10 µL של דגימה המסומנת ב-TMT zero כמות של 50 µL מבuffer הקישור המסופק.

לאחר מכן, העבירו מנה של 50 µL של סספנסיות שרף ללכידת גליקנים (glyco capture resin) הומוגנית למבחנות חדשות בנפח 1.5 mL, וסבבו בצנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 2500 ×g. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) והוסיפו למבחנות המכילות את משקעי השרף 60 µL של תמיסת הדגימה ותמיסן הקישור, והערבבו באמצעות פיפטה. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות תוך כדי ערבול במהירות של 1200 RPM. לאחר סבב בצנטריפוגה למשך שתי דקות במהירות של 2,000 ×g, העבירו את הנוזל העליון למבחנות חדשות.

לאחר מכן, הוסף 150 µL של תמיסת שטיפה לכל מבחנה עם שרף באמצעות פיפטה לערבוב, כדי להתחיל בתהליך השטיפה. דגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות תוך כדי ערבול במהירות של 1200 RPM. לאחר צנטריפוגה ב-2500 ×g למשך שתי דקות, העבר כל עליל לתוך מבחנת אחסון העלילים המתאימה להשלמת השטיפה.

חזור על תהליך שטיפה זה פעמיים נוספות. לאחר מכן, הוסף 75 µL של elution buffer וערבב באמצעות פיפטה. דגור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות תוךما ערבוב במהירות של 1200 RPM.

סובב בצנטריפוגה ב-2500 ×g למשך שתי דקות והעבר כל supernatant לפרונטה חדשה של 1.5 milliliter. הוסף 75 µL של elution buffer באמצעות פיפט לערבוב, ולאחר מכן חזור על פעולות האינקובציה והסבב בצנטריפוגה של הדגימות. העבר כל elute לפרונטה המתאימה.

לאחר סבב צנטריפוגה של התמריר המשולב למשך שתי דקות ב-2500 ×g, העבירו כל עלּיון למבחנה חדשה כדי להבטיח הסרה מלאה של שרף המטריצה. לאחר מכן, השתמשו במרכז ריכוז בוואקום כדי לייבש את התמריר למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. השעיקו מחדש את הגליקופפטידים המיובשים ב-15 µL של 2% ACN ו-0.5% TFA במים מזוקקים פעמיים.

לאחר מכן, בצעו אנליזת ספקטרומטריית מסות כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב. במחקר זה, חלבוני ECM מרקמות קרדיו-וסקולריות מוכנים לאנליזת LC-MS/MS (כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסות טנדם) של הרכב ה-ECM, וכן לאנליזה עקיפה וישירה של גליקופפטידים. האסטרטגיה המרכזית מבוססת על דגריות רצופות עם sodium chloride, SDS ו-guanadine hydrochloride, ולאחריהן אנליזה עקיפה או ישירה של גליקופפטידים.

יעילות המיצוי מנוטרת על ג'לי bis-tris acrylamide עם צביעת כסף לצורך ויזואליזציה. מבין שלושת המיצויים שהורצו, רוב הגליקופרוטאינים של ה-ECM נראים במנות ה-guanadine hydrochloride. גליקופרוטאיני ECM מעוטרים בשרשראות גליקן גליקוזימין גדולות וחוזרות, יחד עם אוליגוסכרידים קצרים ומגוונים מקשרי N ו-O.

יעילות הדגליקוזילציה נבחנת באמצעות הוספת אנזימים המעכלים גליקנים גליקוזאמיניים ואנזימים המכוונים לאוליגוסכרידים קטנים יותר מקשרי N ו-O. לאחר מכן מזוהים גליקופרוטאינים על ידי נוכחות של אספרגינים שעברו דה-אמידיציה המסומנים בחמצן 18 בתוך סקוונים מסוג NXT או NXS. כאן מוצג ספקטרום מס טנדם HCD מייצג עבור פפטיד של decorin עם אספרגין שעבר דה-אמידיציה בעמדה שניים 11.

לאחר מכן, נעשה שימוש בפרגמנטציה מסוג HCD ETD כדי לנתח את תמצית ה-ECM המועשרת בגליקופרוטאין. ספקטרום מסות טנדם מסוג ETD מאפשר את אפיון הרכב הגליקן. לאחר רכישת המיומנות, טכניקה זו אמורה להסלימה כשבועיים עד שלושה שבועות.

גליקופרוטאומיקה זו מאפשרת לנו לחקור את הפיזיולוגיה והפתולוגיה של תפקוד הפיברוזיס, לא רק על סמך שינויים בפרוטאומיקה אלא גם על סמך הרכב הסוכרים.