Glycoproteomics של מטריקס: שיטה Intact ניתוח Glycopeptide באמצעות ספקטרומטריית מסה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לנתח את הרכב חלבון המטריצה החוץ-תאית, כולל זיהוי אתרי גליקוזילציה ואפיון הרכב של צורות גליקן ברקמות לב וכלי דם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתהליך של פיברוזיס ברקמות, כגון כיצד גליקוסטלציה של מטריצה מבנית משפיעה על פיברוזיס ברקמות במהלך מחלות לב וכלי דם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבניגוד לפרוטוקולים קודמים המנתחים שינויים כוללים בגליקוזילציה, היא מאפשרת אפיון של גליקוזילציה באתרים מסוימים של חלבוני מטריצה מבנית, ומספקת כלי למחקרים מכניסטיים ממוקדים יותר.

את ההליכים ד"ר מריקה פאבה, וגב' פרהין בייג מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את כל מאגרי החילוץ כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, השתמש באזמל כדי לחתוך 20 עד 50 מיליגרם של רקמה לקוביות לשלוש או ארבע חתיכות קטנות יותר בגודל של כשני מילימטרים.

מניחים את קוביות הרקמה בצינור של 1.5 מיליליטר ומוסיפים 500 מיקרוליטר PBS קר כקרח. שטפו את הטישו חמש פעמים באמצעות 500 מיקרוליטר PBS לכל שטיפה כדי למזער את זיהום הדם. העבירו את הדגימות השטופות לצינור של 1.5 מיליליטר עם מכסה בורג והוסיפו נפח של מאגר נתרן כלורי פי 10 ממשקל הרקמה.

מערבולת במהירות מינימלית למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו את התמצית לצינורות צנטריפוגה וצנטריפוגה חדשים בטמפרטורה של 16,000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שטפו בקצרה את כדורי הרקמה המתקבלים עם מאגר נתרן כלורי טרי.

לאחר מכן, הוסף נפח של מאגר SDS פי 10 ממשקל הרקמה ומערבולת במהירות מינימלית למשך 16 שעות בטמפרטורת החדר. העבירו את התמצית לצינורות צנטריפוגה וצנטריפוגה חדשים ב -16, 000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שוטפים את הכדורים המתקבלים במים מזוקקים כפולים.

הוסף נפח של מאגר גואנידין הידרוכלוריד פי חמישה ממשקל הרקמה ומערבולת במהירות מקסימלית למשך 72 שעות בטמפרטורת החדר. העבירו את התמצית המתקבלת לצינורות וצנטריפוגה חדשים ב -16, 000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר כימות החלבון, יש להקצות 10 מיקרוגרם לצינור חדש עבור כל דגימה, להערכת תפוסת אתר הגליקוזילציה ו-50 מיקרוגרם לצינור נפרד לניתוח גליקופפטיד ישיר.

מוסיפים פי 10 מנפח האתנול לכל אחד ודוגרים למשך הלילה בחום של 20 מעלות צלזיוס. למחרת, צנטריפוגה את הדגימות ב-16,000 פעמים G למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט, הקפד לא להפריע לכדור המשקע.

לאחר מכן השתמש ברכז ואקום כדי לייבש את הכדורים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר דה-גליקוזילציה מוכן לכל דגימה. אורזים את צינורות הדגימה בתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר ודוגרים בזווית של 45 מעלות למשך שעתיים ב-25 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, העלו את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס ודגרו למשך 36 שעות בתסיסה עדינה. לאחר צנטריפוגה ב -16, 000 פעמים G למשך דקה אחת השתמש ברכז ואקום בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות כדי לאדות את המים. השעו מחדש את הדגימות המיובשות עם 10 מיקרוליטר של מים מסומנים O-18 המכילים 50 יחידות למיליליטר PNGase F.Incubate למשך 36 שעות ב-37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה מתמדת, ולאחר מכן בצעו עיכול טריפסין בתמיסה עבור כל הדגימות והמשיכו בניקוי C-18.

כדי להתחיל, הוסף 200 מיקרוליטר מתנול לכל באר של לוחית הסיבוב C-18 כדי להפעיל את השרף. צנטריפוגה ב -1, 000 פעמים G למשך דקה אחת. לאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של 80% ACN ו-0.1% TFA במים לכל באר וצנטריפוגה ב-1,000 פעמים G למשך דקה אחת.

לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 1% ACN ו- 0.1% TFA במים לכל באר, וצנטריפוגה למשך דקה אחת ב -1, 000 פעמים G.חזור על הוספת תמיסה זו וצנטריפוגה פעמיים. לאחר מכן, טען את הדגימות לבארות צלחת הסיבוב והצנטריפוגה ב -1500 פעמים G למשך דקה אחת. טען מחדש את הזרימה וחזור על הצנטריפוגה.

לאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 1% ACN ו-0.1% TFA במים לכל באר, וצנטריפוגה ב-1500 פעמים G למשך דקה אחת. חזור על התוספת של תמיסה זו וצנטריפוגה פעמיים. לאחר מכן, הוסף 170 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 50% ACN ו-0.1% TFA במים לכל באר וצנטריפוגה ב-1500 פעמים G למשך דקה אחת.

חזור על התוספת והצנטריפוגה הזו פעם נוספת. השתמש ברכז ואקום כדי לייבש את האלוט המשולב בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. אחסן את הדגימות המיובשות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לשימוש.

לאחר מכן, בצע ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית על הדגימות המיועדות להערכת תפוסת גליקוזיט. עבור דגימות המיועדות לניתוח גליקופפטיד ישיר, המשך תחילה עם תיוג האפס הסטנדרטי של TMT כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל, הוסף לכל 10 מיקרוליטר של TMT עם תווית אפס, דגימה של 50 מיקרוליטר של מאגר קשירה שסופק.

לאחר מכן, יש להוציא 50 מיקרוליטר של תרחיף שרף לכידת גליקו הומוגני לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-2500 פעמים G.הסר את הסופרנטנט והוסף 60 מיקרוליטר מהדגימה ותמיסת חיץ מחייבת לצינורות המכילים את כדורי השרף באמצעות פיפטה לערבוב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות תוך כדי תסיסה ב-1200 סל"ד. לאחר צנטריפוגה של שתי דקות ב-2,000 פעמים G העבירו את הסופרנטנט לצינורות חדשים.

לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר כביסה לכל צינור שרף באמצעות הפיפטה כדי לערבב כדי להתחיל בתהליך הכביסה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות תוך כדי תסיסה ב-1200 סל"ד. לאחר צנטריפוגה ב-2500 פעמים G למשך שתי דקות, העבירו כל סופרנטנט לצינור האחסון המתאים ל-supernatant כדי להשלים את הכביסה.

חזור על תהליך כביסה זה פעמיים נוספות. לאחר מכן, הוסיפו 75 מיקרוליטר של מאגר פליטה וערבבו עם פיפטה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות תוך כדי תסיסה ב-1200 סל"ד.

צנטריפוגה בעוצמה של 2500 פעמים G למשך שתי דקות ולהעביר כל סופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. הוסף 75 מיקרוליטר של מאגר פליטה באמצעות פיפטה לערבוב ולאחר מכן חזור על הדגירה והצנטריפוגה של הדגימות. העבירו כל אלוט לצינור המתאים.

לאחר צנטריפוגה של הנוזל המשולב למשך שתי דקות ב-2500 פעמים G, העבירו כל סופרנטנט לצינור חדש כדי להבטיח הסרה מלאה של השרף. לאחר מכן, השתמש ברכז ואקום כדי לייבש את האלוט למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. השעו מחדש את הגליקופפטידים המיובשים ב-15 מיקרוליטר של 2% ACN ו-05% TFA במים מזוקקים כפולים.

לאחר מכן, בצע ניתוח ספקטרומטריית מסה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, חלבוני ECM מרקמת לב וכלי דם מוכנים לניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית של הרכב ECM וכן ניתוח גליקופפטיד עקיף וישיר. אסטרטגיית הליבה מבוססת על דגירה רציפה עם נתרן כלורי, SDS וגואנדין הידרוכלוריד ואחריה ניתוח גליקופפטיד עקיף או ישיר.

יעילות המיצוי מנוטרת על ג'ל ביס-טריס אקרילאמיד עם צביעת כסף להדמיה. מבין שלוש התמציות הפועלות, רוב הגליקופרוטאינים של ECM נראים באליקוטים של גונאדין הידרוכלוריד. גליקופרוטאינים ECM מעוטרים בשרשראות גליקוזאמין גליקאן גדולות וחוזרות על עצמן יחד עם אוליגוסכרידים קצרים ומגוונים המקושרים ל-N ו-O.

היעילות של דה-גליקוזילציה נראית עם תוספת של אנזימים המעכלים גליקנים גליקוזאמיים ואנזימים המכוונים לאוליגוסכרידים קטנים יותר המקושרים ל-N ו-O. גליקופרוטאינים מזוהים לאחר מכן על ידי נוכחות של אספרגינים מפוקפקים המסומנים בחמצן 18 בתוך סקוונים NXT או NXS. ספקטרום מסה טנדם מייצג של HCD עבור פפטיד של דקורין עם אספרגין מפורק בעמדה שתיים 11 מוצג כאן.

לאחר מכן נעשה שימוש בפיצול HCD ETD כדי לנתח את תמצית ה-ECM המועשרת בגליקופרוטאין. ספקטרום המסה הטנדם ETD מאפשר אפיון של הרכב הגליקן. לאחר שליטה, טכניקה זו אמורה להימשך כשבועיים-שלושה.

גליקופרוטומיקה זו מאפשרת לנו לחקור את הפיזיולוגיה והפתולוגיה של תפקוד פיברוזיס לא רק על שינויים בפרוטאומיקה אלא גם על הרכב סוכרי המחשבה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין דגימות למחקר בגליקוזילציה של חלבון על ידי ספקטרומטריית מסה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מחלות לב וכלי דם, ניתן ליישם אותה גם על פתולוגיות אחרות בפיברוזיס נפחי, כגון מחלות נשימה או סרטן.