PH כימות של תאיים אופטי בדרוזופילה melanogaster צנורית Malpighian Epithelia עם pH מקודד פלורסנט גנטית מחוון

המטרה הכוללת של פרוטוקול הדמיה זה היא לתאר את הכימות של pH תוך-תאי, באמצעות אינדיקטור pH מקודד גנטית ולהדגים כיצד ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך את הובלת הפרוטונים הבסיסיים במודל מבנה כליות של חרקים, הצינורית המלפיגית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההובלה התאית כגון, כיצד חלבוני טרנספורטר ספציפיים תורמים לתנועת פרוטונים אפיתל בוויסות pH תוך תאי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להעריך במהירות ובקלות את ההובלה התאית על פני מספר אזורים שונים מבחינה תפקודית של אפיתל שלם.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ויסות ה-pH ואפיתל החרקים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון נפרון היונקים ותאי האפיתל בתרבית. כדי להתחיל בהליך זה, מקם שני סטים של מהדקי ידיים עוזרות להלחמה על שלב מיקרוסקופ ההדמיה, עם מהדק אחד בכל צד. לאחר מכן, הכנס את נימי הזכוכית הכפופים המתאימים ואת קו הזרימה, ואת קו היציאה המחובר לוואקום.

לאחר מכן, הרכיבו אותו בידיים המסייעות ויישרו אותן עם שלב ההדמיה של המיקרוסקופ. מורחים שומן ואקום על סרט התקרה ולוחצים את מחלק באר שפע הדבק על הסרט כדי לצפות את התחתית בשומן. מקלפים את מחלק באר הזלוף הדביק ומניחים אותו עם הצד השומני כלפי מטה, על גבי שקופית מצופה פולי ליזין.

לאחר מכן, הסר את מחלק באר הזלוף כדי להשאיר בארות ספציפיות בודדות בשומן הידרופובי. לאחר מכן, הניחו 200 מיקרוליטר של IPBS בטמפרטורת החדר או מלח חיץ פוספט חרקים במשומן והקיפו היטב על השקופית המצופה פולי ליזין. לאחר מכן, הניחו את המגלשה מתחת לסטרוסקוף, שפכו את המדיום של שניידר קר כקרח לתוך צלחת החיתוך והעבירו אליה זבוב נקבה בודד מורדם.

החזק את הזבוב בבית החזה עם סט מלקחיים והשתמש בשני כדי לאחוז בעדינות בבטן האחורית. משוך את הקצה האחורי של הזבוב בתנועות קצרות ומכוונות. ברגע שהמגן האחורי נראה, אחזו בקצה הדיסטלי ושחררו את המעיים והקדמות מקנה הנשימה הבסיסי, על ידי משיכת המגן האחורי הרחק מהגוף באמצעות משיכות קצרות שחוזרות על עצמן.

לאחר מכן, צבט את האנטים הקדמיים של השופכן בעזרת מלקחיים עדינים, ברגע שסט האנטות השני חופשי מהבטן. הרם את הקדמים הקדמיים החופשיים בעזרת מוט הזכוכית של המוט, על ידי החלקת המוט מתחת לשופכן, כך שהצינורות נופלים לשני הצדדים. לאחר מכן, הרם את האנטים ישר כלפי מעלה, מחוץ לתמיסה, לאחר מכן, סובב את מוט הזכוכית כך שהאנטים והשופכן נדבקים לחלק התחתון של המוט.

הורד את השופכן ישר כלפי מטה על המגלשה, ולאחר מכן, הצמד את השופכן ואטום את הקצוות הדיסטליים של הקדמות על ידי לחיצה נוספת על השופכן על מגלשת הזכוכית. השתמש בקצה העדין של מוט הזכוכית כדי לטאטא בעדינות כל צינורית על פני משטח ההחלקה. רעו את המוט כנגד המגלשה כדי למנוע ריסוק הצינורית והחליקו את המוט מעל החלק העליון של הצינורית, במעבר מדיסטלי לפרוקסימלי, כדי לחבר את כל אורכו של כל צינורית לפני השטח של המגלשה המצופה פולי ליזין.

הצלחת טכניקה זו תלויה לחלוטין בזיהוי מדויק וטיפול זהיר בצינורות המלפיגיים הקדמיים. צינורות פגומים יניבו תוצאות לא עקביות. לאחר מכן, הנח את מחלק באר השפע הדביק בחזרה על השקופית כדי ליצור נוזל קטן מלא היטב מעל הצינורית המותקנת.

לאחר מכן, הנח את הדגימה על במת המיקרוסקופ. מקם את נימי הזרימה והיציאה מעל פתח הכניסה והיציאה של באר השפע, בהתאמה. בהליך זה, הפעל את המיקרוסקופ, מקור האור ומערכת ההדמיה, ולאחר מכן פתח את תוכנת ההדמיה.

הסתכל דרך העיניות והתאם ידנית את המיקוד עד שלומן האנטס נראה בבירור מתחת לאור המועבר. לאחר מכן, לחץ על לשונית הרכישה ובחר, 2x2 בתפריט הנפתח של העמעום, בקטע טעינת הרכישה. הכנס מסנן צפיפות ניטרלית של 5% לנתיב האור, כדי להפחית את אור התאורה ולמזער את הלבנת האור.

לחץ על ערוץ GFP בתפריט הערוצים, ולאחר מכן לחץ בשידור חי כדי לצפות באות הפלואורסצנטי דרך המצלמה. לאחר מכן, כוונן את מחוון הזמן כדי להגדיר את זמן החשיפה, כך שערכי הפיקסלים הבהירים ביותר בהיסטוגרמה של העוצמה יהיו כ-40% מהערך המקסימלי. לאחר מכן לחץ על עצור, כדי לעצור את התאורה.

חזור על ההליכים בערוץ RFP ואשר את נוכחותו של המקטע הראשוני המורחב של האנטה הקדמית והיעדר אגרגטים של דובדבן m ציטו-מוצק, מה שמעיד על נזק לרקמות או ביטוי יתר. לאחר מכן, הפעל פרוטוקול הדמיה דולג זמן על-ידי לחיצה על תיבת הסימון סדרת זמן. התאם את משך הזמן בתפריט הנפתח, בקטע סדרת הזמן ל-10 דקות, ואת מחוון המרווח לאפס, כדי להגדיר את זמן הצילום הכולל עם רכישת התמונה המקסימלית.

לאחר מכן, סמן את תיבות ה-GFP וה-RFP בקטע הערוץ. פתח את קו ה-IPBS של מערכת השפע על ידי הפעלת בקר השסתום המתאים והתחל את פרוטוקול ההדמיה על ידי לחיצה, התחל ניסוי. לאחר דקה אחת, עבור לתמיסת פוסט אמוניום כלוריד למשך 20 שניות, על ידי פתיחת השסתום המתאים וסגירת קו ה-IPBS.

לאחר מכן, חזור ל-IPBS על ידי סגירת קו האמוניום כלוריד ופתיחה מחדש של שסתום ה-IPBS. כדי לבצע כיול של שתי נקודות, הסר את מחלק הבאר על ידי קילופו הרחק מהשקף הבסיסי והסר את נימי השפע במלחציים מבאר ההדמיה. לאחר מכן, החל 200 מיקרוליטר של מאגר IPBS כיול על pH 7.4.

לאחר מכן, הסר את התמיסה מבאר ההדמיה והחלף אותה בעוד 200 מיקרוליטר של תמיסת כיול. חזור על תהליך זה ארבע פעמים כדי להבטיח החלפת פתרונות מלאה. לאחר מכן, דגרו את תמיסת ההכנה והכיול למשך 30 דקות לפני ההדמיה.

חזור על פרוטוקול ההדמיה באמצעות אותם פרמטרים שנקבעו קודם לכן, עם שינוי של דקה אחת בלבד של לכידת תמונה. לאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר IPBS כיול ל-pH תשע. הסר את התמיסה מבאר ההדמיה והחלף אותה בעוד 200 מיקרוליטר של תמיסת כיול.

לאחר מכן, דגרו את התכשיר בתמיסת הכיול השנייה למשך 10 דקות לפני ההדמיה וחזרו על פרוטוקול ההדמיה. לאחר מכן, סקור את התמונה שצולמה בתוכנת ניתוח התמונות כדי לוודא שאין פיקסלים באף אחד מהערוצים רוויים, על ידי לחיצה על MeanROI ושאף ערך שדווח בהיסטוגרמה של העוצמה, לא הגיע לערך המקסימלי הניתן לזיהוי, תוך גלילה בערימת התמונות עם מחוון המסגרת. לאחר מכן, נתח את ערימת התמונות על ידי התוויית עוצמת פלורסנט ויחס הקרינה הוא פונקציה של זמן, כאן, אנו רואים את התגובה הפלואורסצנטית הצפויה לדופק אמוניום כלוריד בתעלות הרגישות ל-pH וחוסר רגישות ל-pH של המחוון.

היחס בין האותות הללו חושף את חולף ה-pH התוך תאי. כדי לבצע ניתוח זה, לחץ תחילה על meanROI ובחר בכלי הטופס החופשי. החזק את הלחיצה השמאלית על העכבר, כדי לעקוב אחר MT של 50 מיקרומטר ולחץ לחיצה ימנית כדי לסיים את ציור ההחזר על ההשקעה.

לאחר מכן, חזור על זה באזור הסמוך ל-MT, כדי להגדיר החזר ROI ברקע. לאחר מכן, לחץ על עוצמה ממוצעת תחת מדידות, צור טבלה של ערכי עוצמה על ידי לחיצה על ייצוא, טבלת נתונים, צור. לחץ על סמל גלגל שעון התצורה ובטל את הבחירה בכל הפרמטרים, למעט זמן ועוצמה ממוצעת.

לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הכרטיסיה של טבלת הנתונים החדשה שנוצרה, בחר שמירה בשם וייצא את הנתונים כקובץ csv. מוצגת כאן תמונת שדה רחב, פלואורסצנטי פלואורין סופר-אליפטי בתאים עקרוניים של תאי האנטה הקדמית והכוכבית של האנטרי הקדמי. שימו לב שתאי כוכב הם בצורת מוט בקטע הראשוני, משתנים בקטע המעבר ומציגים הקרנות סלולריות מובהקות בקטע הראשי.

גרף זה מציג את שינויי ה-pH הבין-תאיים המכוילים בתגובה ל-20 שניות, דופק אמוניום כלוריד של 40 מילי-מולרי באזורים מעניינים. עקומות מקווקו מציינות התאמות מעריכיות בודדות המיושמות על שלב התאוששות החומצה, לאחר נסיגת אמוניום כלוריד. מכאן נגזרים הערכים הקבועים הרקובים.

גרף זה מציג את קצב שחול החומצה המשורטט כפונקציה של pH תוך-תאי וגרף זה מציג את שטף החומצה המשורטט כפונקציה של pH תוך-תאי, הנגזר מההתאמות האקספוננציאליות מהאיור הקודם. לאחר השליטה, ניתן לבצע את מיצוי הצינורית המלפיגית תוך 10 דקות, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שההצלחה תלויה לחלוטין באיכות החיתוך ובכיול המדויק של מחוון ה-pH.

ניתן לשלב תכשיר זה עם חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית אחרים כגון סידן פלואורסצנטי ואינדיקטורים של הליד כדי לחקור תנועת מומסים ואיתות תוך תאי בתאי אפיתל. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין צינורות דרוזופילה מלפיגיים בריאים, לדמיין מחוון pH מקודד גנטית ולכמת את תנועת הפרוטונים בתאי האפיתל. אל תשכח שעבודה עם ניטרויזן עלולה להיות מסוכנת ולפגוע בתכשירים ולכן, יש לנקוט באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה, כדי להבטיח שהוא לא יזהם שום ציוד שיש לעשות בו שימוש חוזר.