איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

המטרה הכוללת של ניסוי בדיקת קשירת קרבה זה היא לדמיין ולכמת את היווצרות תגובת נזק ל-DNA ולתקן קומפלקסים של חלבונים לאחר השראת נזק ל-DNA בתרביות תאי מתלה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתיקון נזק ל-DNA כגון ארגון וויסות זמן מרחבי וכיצד מסלולי תיקון מגוונים מגיבים לסוגים שונים של נזק ל-DNA. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא פשוטה יחסית, דורשת מספר תאים נמוך ואינה דורשת עיבוד נרחב, שעלול לשבש או לשנות אינטראקציות חלבון-חלבון.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תיקון DNA, היווצרות קומפלקס חלבונים בתאי תרבית-תרחיף, ניתן ליישם אותה גם בתאים דבקים מתורבתים, רקמות משובצות קפואות או פרפין, ואפילו בעלי חיים שלמים. במחקר זה נעשה שימוש בקו התאים הלימפובלסטיים החריפים של תאי B אנושיים, BV-173, ותורבת ב-IMDM עם תוספים ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2. צלחת התאים פעמיים 10 עד שישית למיליליטר בצלחת של שש בארות בחמישה מיליליטר לבאר.

כדי לעצור את התאים בשלב G1 של מחזור התא, הוסף חמישה מיקרומולר של אמוניום מתאן סולפונאט לכל באר ודגר את הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2. למחרת, הוסף חמישה מיקרומולר של מעכב כספומט לכל אחת משתי הבארות והחזיר את הצלחת לחממה למשך 30 דקות. לאחר מכן, לגרום נזק ל-DNA על ידי הוספת 50 ננוגרם למיליליטר של NCS לאחת הבארות שטופלו מראש במעכב ATM ולבאר אחרת שלא טופלה מראש.

דגירה במשך שעתיים. הכן 1XPBS בתוספת 10% BSA על ידי שכבת חמישה גרם של שבריר-5 BSA על גבי 50 מיליליטר של 1XPBS בכוס ותן לו לשבת בטמפרטורת החדר מבלי לנער או לערבב עד שה-BSA נמס. לאט לאט מסננים את תמיסת PBS פלוס 10% BSA דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ושומרים על קרח.

קצרו את התאים והעבירו את תכולת כל באר לצינור של 15 מיליליטר. שטפו את התאים פעמיים בקור קרח 1XBPS. לאחר ספירת התאים, השהה מחדש פעמיים 10 עד שישית תאים למיליליטר ב-1XBPS בתוספת 10% BSA.

שמור את התאים על קרח. הכן את שקופיות המיקרוסקופיה להליך זה על ידי ליטוש זהיר שלהן ברקמה נטולת מוך והסרת שומנים על ידי הנחת אתנול 96% בצנצנת קופלין למשך חמש דקות. תן למגלשות להתייבש באוויר במשך 10 דקות.

הרכיבו את שקופיות המיקרוסקופיה לתוך משפכי הציטולוגיה של הציטוספין בשטח של שישה מיליליטר. ציפוי מראש של המגלשות על ידי פיפטינג של 50 מיקרוליטר של 1XPBS בתוספת 10% BSA לכל משפך וצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-500 סל"ד. לכל משפך, הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף התא והצנטריפוגה ב-500 סל"ד למשך חמש דקות.

פרק בזהירות את המשפכים והקפד לא לגעת בכתמים על המגלשות. השתמש בחוסם נוזלים של עט פאפ עם קצה של חמישה מילימטר כדי לצייר עיגול סביב כל נקודה. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע PFA של 4% לכל נקודה.

ודוגרים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות יש לשטוף את התאים עם 1XPBS בצנצנת קופלין בטמפרטורת החדר בתסיסה עדינה. שטפו שלוש פעמים בצורה זו במשך חמש דקות בכל פעם.

יבש את המגלשות סביב הכתמים עם טישו נטול מוך והסר כמה שיותר נוזלים מהכתמים על ידי הטיית המגלשה וייבוש עם טישו נטול מוך. הוסף 50 מיקרוליטר של 0.25% טריטון X ב-1XPBS לכל נקודה ודגר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ללא תסיסה. שוטפים את השקופיות ב 50 עד 60 מיליליטר TBS-T בצנצנת קופלין בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.

שלוש פעמים במשך חמש דקות בכל פעם. לפני החסימה, הקש על TBS-T וייבש את המגלשות סביב הכתמים עם טישו נטול מוך. הסר כמה שיותר נוזלים מהמקום.

מערבב בקצרה את תמיסת החסימה ולאחר מכן הוסף טיפה אחת של כ-40 מיקרוליטר לכל נקודה. מניחים את המגלשות בתא לח שחומם מראש ומדגרים למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס. הכינו את קוקטיילי הנוגדנים.

מערבולת ולאחר מכן פיפטה מדללת נוגדנים מסחריים לכל צינור מיקרופוגה. הוסף את נוגדן העז נגד כספומט בשעה 1:1000. ונוגדני הארנב נגד פוספוסרין-15 p53 בשעה 1:100.

לניסויי בקרת נוגדנים בודדים הכינו דילול נוגדנים המכילים רק את הנוגדן נגד ATM של העז ורק את הנוגדן נגד פוספוסרין-15 p53 של הארנב. בסיום הדגירה של שעה הקש על תמיסת החסימה אך הקפד לא לתת לתאים להתייבש. הוסיפו 30 מיקרוליטר מכל דילול קוקטייל נוגדנים ודגרו בתא לח בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, שטפו את השקופיות עם מאגר כביסה 1X NC2 A בצנצנת קופלין בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה פעמיים במשך חמש דקות בכל פעם. לאחר שהמגלשות נשטפו פעמיים עם מאגר כביסה ברז את מאגר הכביסה מהמגלשות והוסף 30 מיקרוליטר מתערובת בדיקת בדיקת קשירת הקרבה לכל נקודה. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לח שחומם מראש למשך שעה.

שוטפים את השקופיות עם 50 עד 60 מיליליטר מאגר כביסה A בצנצנת קופלין בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הליגאז על קרח על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של ליגאז ל-39 מיקרוליטר של תמיסת קשירה לכל נקודה. הוסף 40 מיקרוליטר מתמיסת הקשירה ליגאז לכל נקודה.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לח שחומם מראש למשך 30 דקות. שוטפים את השקופיות עם מאגר כביסה A בצנצנת קופלין בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. מכינים את תערובת פולימראז ההגברה על קרח.

ראשית יש לדלל את תמיסת מלאי ההגברה אחד עד חמש במים. והוסף 0.5 מיקרוליטר פולימראז ל-39.5 מיקרוליטר של תמיסת הגברה 1X לכל נקודה. הקש על מאגר הכביסה והוסף 40 מיקרוליטר של תערובת פולימראז הגברה לכל נקודה.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לח שחומם מראש למשך 100 דקות. בסיום הדגירה של 100 דקות יש להוציא את תערובת הפולימראז ההגברה ולשטוף את השקופיות עם מאגר כביסה 1X NC2 B בצנצנת קופלין. בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה פעמיים למשך 10 דקות כל אחת.

לאחר מכן, שטפו את השקופיות במאגר כביסה של 0.01x B למשך דקה אחת. הקש על מאגר הכביסה העודף B וייבש את המגלשות סביב הכתמים עם טישו נטול מוך. הסר כמה שיותר נוזלים מהמקום.

הכן DAPI המכיל מדיום הרכבה שלא יכתים יתר על המידה את הגרעינים על ידי דילול DAPI המכיל מדיום הרכבה 1:5 במדיום הרכבה ללא DAPI. הוסף 25 עד 30 מיקרוליטר של ה-DAPI המדולל המכיל מדיום הרכבה להחלקת כיסוי של 24 מילימטר על 24 מילימטר. הרם את פתק הכיסוי עם המגלשה והפעל לחץ קל כדי להבטיח שאין בועות אוויר כלואות.

אטום את החלקת הכיסוי עם לק והמתן לפחות 15 דקות לפני ההדמיה. לבסוף, צלם ונתח את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי. בדיקת קשירת הקרבה שימשה לחקירת האינטראקציה בין ATM לפוספוסרין 15 p53 בתאים חיוביים אנושיים בעלי יכולת BCR BV 173 שנעצרו בשלב G1.

בניגוד לתאים שלא טופלו ב-NCS כדי לגרום נזק ל-DNA, לרוב התאים שטופלו ב-NCS היו אותות מנוקבים אך ורק בגרעין עם ממוצע של שבעה אותות לתא. זה מצביע על כך שאינדוקציה של נזק ל-DNA גורמת לאינטראקציה בין ATM לפוספוסרין 15 p53. טיפול מקדים בתאים עם מעכב קינאז ATM ספציפי לפני השראת נזק ל-DNA מפחית את מספר האותות לממוצע של שני אותות לתא, מה שמאשר כי זרחון של p53 בשאריות סרין 15 היה תלוי בפעילות קינאז ATM.

ניסויי בקרת נוגדנים בודדים שבהם נפלט הנוגדן נגד כספומט או אנטי פוספוסרין 15 p53 לא הניבו אותות כמצופה. איור זה מציג את הכימות והניתוח הסטטיסטי של התוצאות המדגימות ומאשרות את הספציפיות של טכניקת בדיקת קשירת הקרבה על תכשירי ציטוספין של תרביות תאי תרחיף. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כחמש שעות לאחר דגירה לילית עם נוגדן ראשוני אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטטר בזהירות את הנוגדן על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית של התאים המעניינים אותך לפני ביצוע בדיקת קשירת קרבה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בביולוגיה של התא לחקור אינטראקציות חלבון חולפות שקשה להעריך באמצעות שיטות סטנדרטיות כגון משקעים חיסוניים והדמיה מבוססת FRET שלעתים קרובות מביאה לחפצים טכניים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בדיקת קשירת קרבה בתרביות תאי תרחיף כדי לדמיין ולכמת אינטראקציה של חלבון במקום.