בידוד של נגזרות רקמה שומנית Murine כלי דם שבר כיחידות כלי דם של הנדסת רקמות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד שברי כלי דם מיקרו-וסקולריים מרקמת השומן של העכברים ליצירת יחידות כלי דם להנדסת רקמות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנדסת הרקמות לגבי כלי דם in vivo של תחליפי רקמות. היתרון של טכניקה זו הוא בכך שהיא מניבה מקטעים מיקרו-וסקולריים מתפקדים לחלוטין ללא עיבוד מורכב במבחנה שניתן לזרוע על פיגומים ולהשתיל בפגמים ברקמות.

ניתן ליישם שיטה זו גם על מערכות אחרות כגון מבחני אנגיוגנזה במבחנה כדי לחשוף מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס היווצרות ועיצוב מחדש של רשת מיקרו-וסקולרית. התחל בהנחת עכבר בר שחור מסוג C57 מורדם במצב שכיבה תחת סטריאומיקרוסקופ כירורגי ואשר חוסר תגובה לצביטה בבוהן. משתקים את הכפות בעזרת סרט ומחטאים את הבטן.

לאחר מכן, השתמש במספריים מנתחים כדי להפריד את שכבת הבטן מרקמת השריר הבסיסית ולבצע לפרוטומיה בקו האמצע. פרש לרוחב את דשי דופן הבטן וזהה דו-צדדית את האשכים, האפידידימוס וכריות השומן האפידידימליות. לאחר מכן השתמש במספריים קטנים ובמלקחיים עדינים כדי לקצור את כריות השומן, הקפד לא לאסוף רקמת אפידידימלית ולהניח את כריות השומן בצלחת פטרי המכילה 15 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס DMEM.

בקולט אדים למינארי, שטפו את רפידות השומן בשלוש צלחות פטרי נפרדות המכילות 15 מ"ל PBS והניחו את השומן השטוף בצינור פוליפרופילן ריק של 14 מ"ל. השתמש בסולם צינור כדי לקבוע את נפח השומן שנקטף. לאחר מכן השתמש במספריים עדינים כדי לטחון מכנית את רקמת השומן.

כאשר מתקבל תרחיף רקמות הומוגני, השתמש בצינור מדידה של 10 מ"ל כדי להעביר את הרקמה הטחונה עם שני נפחים של קולגינאז NB 4G לבקבוק ארלנמאייר של 50 מ"ל המכיל מוט ערבוב של 25 מילימטר. מניחים את הבקבוק בחממת תרבית תאים למשך 10 דקות תוך ערבוב נמרץ. לאחר מכן, התבונן ב-10 מק"ל של הרקמה המעוכלת תחת מיקרוסקופ.

השלב הקשה ביותר בהליך בידוד זה הוא זיהוי הזמן המתאים להפסקת העיכול. עיכול רפידות השומן במשך זמן רב מדי יביא לתרחיף תא בודד ללא שברי כלי דם מיקרו-וסקולריים. אם העיכול מכיל שברים מיקרו-וסקולריים שמקורם ברקמת שומן חופשית ליד תאים בודדים, נטרל את האנזים בשני נפחים של PBS בתוספת 20% FCS והעביר את תרחיף כלי התא לצינורות פוליפרופילן חדשים.

דגרו את התמיסה למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להפריד את השברים המיקרו-וסקולריים מהשומן שנותר על ידי כוח הכבידה. לאחר מכן, השתמש בפיפט דיוק של מ"ל אחד כדי להסיר בזהירות מ"ל אחד של סופרנטנט השומן העיקרי ואחריו שימוש בפיפט דיוק של 100 מ"ל כדי להסיר את שאר הסופרנטנט עד שנראה שהתרחיף נטול שומן. לאחר הסרת כל השומן, השתמש בצינור מדידה של 10 מ"ל כדי לסנן את מתלה כלי התא דרך מסננת של 50 מיקרון על צינור חרוטי של 50 מ"ל ולהעביר את התרחיף המסונן לצינור פוליפרופילן חדש של 14 מ"ל עבור כל מבודד שבר מיקרו-וסקולרי בודד.

אסוף את כדורי השבר המיקרו-וסקולרי על ידי צנטריפוגה והסר את כל המ"ל מלבד האחרון של סופרנטנט מכל צינור. השעו מחדש את הכדורים בסופרנטנטים הנותרים. לאחר מכן, העבירו כל תרחיף לצינורות מיקרו-צנטריפוגה חרוטיים בודדים של 1.5 מ"ל וגלו שוב את השברים המיקרו-וסקולריים להשעיה מחדש בנפח הסופי המתאים של PBS ו-20% FCS לניתוח המתוכנן במורד הזרם.

כאן, מוצגת התפלגות האורך של שברי מיקרו-וסקולרים מבודדים טריים משישה, שבעה עד שנים-עשר חודשים, שישה עכברים שחורים מסוג C57, עם אורך ממוצע של כ-42 מיקרומטר שנצפה. כפי שמדגים מריחת השעיית כלי תא מייצגת זו, שברים מיקרו-וסקולריים גדולים, בינוניים וקטנים כמו גם תאים בודדים נצפים כאשר רקמת השומן התעכלה מספיק. הגדלה גבוהה יותר מגלה כי השברים המיקרו-וסקולריים מציגים מורפולוגיה בוגרת של מיקרו-כלי דם עם מקטעי מיקרו-כלי דם היררכיים.

אפיון השברים המיקרו-וסקולריים על ידי זרימה ציטומטרית מצביע על כך שהם מכילים תאי אנדותל חיוביים CD31, תאים פרה-וסקולריים חיוביים של שריר חלק אלפא ותאי גזע מזנכימליים חיוביים CD117, תאים המבטאים סמן. לאחר זריעה על תחליף עור עורי, שברים מיקרו-וסקולריים גדולים יותר ממוקמים בעיקר על פני השתל עם כמה מקטעי כלי דם נימיים שזוהו בתוך ליבות השתל. צביעה אימונוהיסטוכימית של השברים המיקרו-וסקולריים שנזרעו חושפת עוד יותר תצורות מיקרו-כלי דם פיזיולוגיות עם שברים דמויי עורקים, ורידים ונימים.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעתיים אם מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד שברי כלי דם מרקמת שומן עכברים כיחידות כלי דם להנדסת רקמות.