Name: מורין קצר ציר הלב ואת פרוסות הלב עבור מחקרים אלקטרו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: למד הכנת פרוסות לב חיים מעכברים בוגרים לאלקטרופיזיולוגיה. השיטה שומרת על מבנה רקמה דומה לתנאי in vivo ומאפשרת מדידות ישירות בכל אזורי הלב לחקר תרופות וטיפולים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים בתמיכת הסדנאות ובמתקן החיות של המכון לנוירופיזיולוגיה. עבודה זו נתמכה על ידי וולטר או מרגה בול Stiftung, Köln Fortune ו דויטשה Stiftung für Herzforschung.

טיפול בבעלי חיים צריך להיות תואם את הנחיות הוועדה המקומית לרווחת בעלי חיים ואת הדירקטיבה 2010/63 / EU של הפרלמנט האירופי. 1. הכן פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון של Tyrode ללא Ca 2 + (הרכב ב mM): NaCl 136, KCl 5.4, NaH 2 PO 4 0.33, MgCl 2 1, גלוקוז 10, HEPES 5, 2,3-butanedione monoxime (BDM) 30. התאם pH 7.4 עם NaOH ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של Tyrode עם Ca 2 + (הרכב ב mM): NaCl 136, KCl 5.4, NaH 2 PO 4 0.33, MgCl 2 1, גלוקוז 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0.9. התאמת pH 7.4 עם NaOH ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% נמוך להמיס agarose: לשים 0.6 גרם נמוך להמיס agarose ב 15 מ&quot;ל הפתרון של Tyrode ללא Ca 2 + . מחממים את התערובת בתנור מיקרוגל פעמיים ב 750 W עבור 10-15 s עד agarose הוא מומס. שמור את הפתרון בטמפרטורה קבועה של 37 &amp;# 176; C ומערבבים ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) ללא סרום ב 37 מעלות צלזיוס מבעבע עם carbogen (5% CO 2 , 95% O 2 ). </li></ol> הכן את המיקרוטום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המיקרוטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את החדר microtome החיצוני עם קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את החדר microtome פנימי עם פתרון קרח קר של Tyrode ללא Ca 2 + ו oxygenate ברציפות הפתרון עם O 2 % 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים להב פלדה לתוך בעל הלהב של microtome. </li></ol> 3. עכבר לב בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 2,500 U הפרין תת עורי. חכה 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את החיה על ידי נקע צוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את החזה על ידי sternotomy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לנתח את קרום הלב באמצעות מספריים קטנים מלקחיים # 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס צינורית לתוך אבי העורקים עולה ו perfuse העורקים הכליליים באתרו עם קר הקרח Tyrode שלפתרון ללא Ca 2 + עד שנותר דם מוסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לכרות את הלב עם מלקחיים ומספריים ולהעביר את הלב בקורפת פתרון Tyrode קר רכוב ללא Ca 2 + . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד את אטריה מן החדרים עם אזמל או מספריים. </li></ol> 4. הטבעה של החדרים ב 4% נמוכה להמיס Agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדרים עם השיא פונה כלפי מעלה עובש agarose ( איור 1 ). מניחים את הסיכה באמצע התבנית בחדר החדר השמאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את התבנית עם 4% נמוך להמיס agarose ב 37 מעלות צלזיוס, עד הלב מכוסה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התבנית על הקרח עבור התקשות מהירה יותר של agarose מניעת צף של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בלוק agarose המכיל את החדרים מן התבנית עם אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הבלוק הפוך ולמלא חדרי החדר ואת הפער על הישבן של בלוק agarose, אשר אניS נותרו על ידי סיכה של מולט, עם 4% נמוך להמיס agarose באמצעות מזרק עם מחט 20 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את הבלוק agarose עם אזמל כדי להשיג תחתית שטוחה של הבלוק ואת המיקום זקוף של איפקס לב. </li></ol> 5. פרוסת רקמת חדרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הבלוק על בעל הדגימה של microtome עם טיפה של דבק cyanoacrylate. הפנים את הקודקוד העליון כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את בעל הדגימה לתוך החדר הדגימה הפנימית של microtome, אשר מלא Tyrode קר כקרח ללא Ca 2 + . לגמרי לכסות את הבלוק agarose עם הפתרון של Tyrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פרוסות ציר קצר בעובי של 150-400 מיקרומטר, בהתאם ליישום נוסף (עבור הקלטות אלקטרודה חדה 150-200 מיקרומטר), לשמור על תדירות הרטט של הלהב ב 60-70 הרץ ולהזיז את הלהב קדימה לאט ככל האפשר . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במברשת עדינה כדי להסיר בזהירות את agarose הנותרים מן הפרוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות transfeR פרוסות עם פיפטה פסטר לתוך הפתרון של Tyrode עם 0.9 מ&quot;מ Ca 2 + סודה עם 100% O 2 ולאחסן אותם לפחות 30 דקות על הקרח להתאושש מההליך חיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לשמור על פרוסות דקות 30 ב DMEM ב 37 מעלות צלזיוס, מוגז עם carbogen, כדי לשטוף את BDM לפני שימוש נוסף. </li></ol> 6. הכנת הגדרת אלקטרודה חדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחימום מראש, הדלק את כל המכשירים החשמליים 30 דקות לפני שההקלטה מתחילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים צלחת 3 ס&quot;מ תרבות התא על צלחת חימום ממוקם על מיקרוסקופ הפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את אלקטרודה טבעת אישית ( איור 2 ) בצלחת לחבר חוטי הארקה של מגבר מראש אלקטרודה גירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את צינורות גמישים של מערכת זלוף לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את המאגר של מערכת זלוף עם DMEM, סודה עם carbogen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת זלוף ולהגדיר את זלוף raTe עד 2-3 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הטמפרטורה של DMEM בצלחת ל 37 מעלות צלזיוס על ידי הסדרת תנור החימום ואת צלחת החימום. </li></ol> 7. פעולה הקלטות פוטנציאליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פרוסה חדרית לתוך צלחת DMEM מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את שלמות המבנית ואת הכדאיות (מבוסס על פונקציה התכווצות) של הרקמה עם מיקרוסקופ הפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא אלקטרודה ההקלטה זכוכית עם 3 M KCL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים אלקטרודה גירוי עם DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה הקלטה אלקטרודה גירוי על מחזיקי האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה גירוי בזהירות על פרוסה ולהפעיל את המאיץ החשמלי. התחל עם תדר גירוי של 1-2 הרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את האלקטרודה הקלטה עם micromanipulator מעל עמדת ההקלטה המיועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוריד את האלקטרודה הקלטה עד קצה נוגע רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל דופק חשמלי מלבני קצר דרךהקלטה אלקטרודה לחדור את קרום התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות למקם את האלקטרודה הקלטה עד אות יציב מובטחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל להקליט פוטנציאל פעולה. </li></ol>

<ol><li>Yamamoto, C., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activities+in+thin+sections+from+the+mammalian+brain+maintained+in+chemically-defined+media+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro.</a> J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).</li>
<li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).</li>
<li>Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+tissue+slices+as+a+tool+to+predict+metabolism+of+novel+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).</li>
<li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiopulmonary+toxicity+of+peat+wildfire+particulate+matter+and+the+predictive+utility+of+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices.</a> Part Fibre Toxicol. 11, 29(2014).</li>
<li>Nembo, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+chronotropic+effects+of+Erythrina+senegalensis+DC+%28Fabaceae%29+aqueous+extract+on+mouse+heart+slice+and+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices%3A+preparation%2C+handling%2C+and+successful+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).</li>
<li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+slices+from+adult+mammalian+hearts+as+a+model+for+pharmacological+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing.</a> Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).</li>
<li>Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recordings+on+rat+cardiac+muscle+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices.</a> Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).</li>
<li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+mouse+embryonic+heart+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation.</a> Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).</li>
<li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+murine+heart+slices.+A+robust+model+to+study+ventricular+isometric+contractions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions.</a> Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts--a+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+maturation+and+integration+of+murine+fetal+cardiomyocytes+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation.</a> Circ. Res. 101, 484-492 (2007).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+the+electrophysiological+maturation+and+integration+of+transplanted+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+persistence+and+electrical+integration+of+transplanted+fetal+cardiomyocytes+from+different+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages.</a> Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+integration+and+action+potential+properties+of+transplanted+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).</li>
<li>Verrecchia, F., Herve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+blockade+of+gap+junctional+communication+by+2%2C3-butanedione+monoxime+in+rat+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes.</a> Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).</li>
<li>Fleischmann, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+subunit+composition+of+the+G+protein-activated+inward-rectifier+potassium+channel+during+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development.</a> J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).</li>
<li>Peinkofer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Early+Embryonic+to+Adult+Stage%3A+Comparative+Study+of+Action+Potentials+of+Native+and+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה להכריז.

פרוסות חדרית מאפשרים מחקרים אלקטרו-מכאניים, פרמקולוגיים ומכניים עם שימור במבנה רקמות ויוו וגישה ישירה של טכנולוגיית המדידה לכל אזורי הלב. תכונות פוטנציאליות פעילות פיזיולוגית הוכחו בפרוסות עובריים, ילודים ומבוגרים 9 , 10 , 11 . החיוניות של פרוסות, למעט שכבות פני השטח שנפגעו ישירות על ידי הליך חיתוך, אושרה על ידי מכתים חיוניות 9 . פעולות פוטנציאל הקלטות בתו...

פרוסות רקמות דקות נעשה שימוש תכוף במדע בסיסי מאז ימאמוט ומקלווין הראה בשנת 1966 כי הפעילות החשמלית של פרוסות המוח נשמרת במבחנה 1 . מאז, מחקרים אלקטרוכימיים ופרמקולוגיים נערכו על פרוסות מהמוח 2 , כבד 3 , ריאה 4 ורקמת שריר הלב 5 , 6 , 7 . הראשון תיקון מהדק הקלטות בפרוסות חדרית לבבות חולדה בילודים תוארו בשנת 1990 8 , אבל טכניקה זו נפל לתוך שכחה במשך זמן מה. יותר מעשור לאחר מכן, הקבוצה שלנו הקימה שיטה חדשה להכין Murine עובריים 9 , neonatal 10 ומבוגר 11 פרוסות לב. אלה פרוסות רקמות קיימא ניתן להשתמש עבור ניסויים חריפים (פרוסה למבוגריםS יכול להיות מעובד במשך כמה שעות) או ניסויים תרבות לטווח קצר (פרוסות עובריים ו neonatal יכול להיות מעובד במשך כמה ימים). פרוסות להראות in vivo כמו מאפיינים electrophysiological ו עירור הומוגני להתפשט כפי שהוערך על ידי פעולה אלקטרודה חדה פוטנציאל הקלטות מיקרו אלקטרודה מערך 11 . בשל המורפולוגיה &quot;דו מימדי&quot; שלהם, הם מאפשרים גישה ישירה של אלקטרודות הקלטה לכל האזורים של החדר, מה שהופך אותם כלי מעניין עבור חקירות אלקטרופיולוגיות מעלה אפשרויות ניסיוניות חדשות בהשוואה Langendorff-perfused לב שלם. תגובה של סמים של פרוסות לחסיני תעלות יונים כמו verapamil (L-Ca Ca 2 + -channel blocker), lidocain (Na + -חוסך חוסך), 4-aminopyridine (מתח לא תלוי ב- K + -channel blocker) ו- linopirdine (KCNQ K + -חוסך חשמל) 9 , 11 </suP&gt; התואם השפעות ידועות על cardiomyocytes ניתק. מדידות כוח איזומטרי חשף קשר חיובי תדר כוח והציע בתוקף תפקוד שלם שלם. ממצאים אלה הראו כי פרוסות החדר Murine מתאימים כמודל רקמות במבחנה עבור מחקרים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים. יתר על כן, פרוסות חדר הלב של לב המקבל בשילוב עם הקלטות אלקטרודה חדה הוכיחו להיות כלי מועיל מאוד לאפיין אינטגרציה חשמלית ומכנית כמו גם התבגרות של העובר השתלה 12 , 13 , 14 ותאי גזע נגזר 15 cardiomyocytes. לסיכום, פרוסות חדרית הם בעלי ערך רב להקים מודל רקמות רב תאיים ויש לראות משלימים cardiomyocytes ניתק Langendorff- perfused לבבותב מחקר קרדיווסקולרי, עם היתרון העיקרי של מתן in vivo כמו מבנה רקמות (בניגוד לתאי ניתק) כמו גם גישה ישירה של טכנולוגיות מדידה כמו הקלטות אלקטרודה חדה לכל אזורי הלב (בניגוד כל ההכנות הלב).

<table><tbody><tr><td>Leica VT 1000s</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה</td><td></td><td>Microtome עם להב רוטט.</td></tr><tr><td>להבי נירוסטה</td><td>Campden Instruments, Loughborough, אנגליה</td><td>7550-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיז, ארה"ב</td><td>Z627992</td><td></td></tr><tr><td>מברשת עדינה, למשל גודל 6 (4/32 אינץ')</td> <td>VWR, International, Radnor, USA</td><td>149-2125</td><td></td></tr><tr><td>שולחן</td><td></td><td></td> הכנה <td>מתוצרת עצמית</td></tr><tr><td>Molt להטמעת חדרים ב מזרק אגרוז</td><td></td><td></td><td>מתוצרת עצמית</td></tr><tr><td>של 1 מ"ל</td><td>בקטון, דיקינסון; פרנקלין לייקס, ארה"ב</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>27 גרם x 3/4 אינץ' מחטים</td><td>בראון, מלסונגן, גרמניה</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>20 גרם 11/2 אינץ' מחטים</td><td>4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים קטנים</td><td>WPI, סרסוטה, ארה"ב</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה #5, 0.1 x 0.06 מ"מ קצה</td><td>WPI, סרסוטה, ארה"ב</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>גז חמצן (דרגה רפואית O2)</td><td>Lindeמינכן, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גז קרבוגן (95% O2, 5% CO<>sub2)</td><td>Linde, מינכן, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיז, ארה"ב</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיז, ארה"ב</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיז, ארה"</td>ב <td>746495</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיז, ארה"ב</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיז, ארה"ב</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>דבק ציאנואקרילט</td><td>הנקל, D&uuml; סלדורף, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Roth נמס נמוך</td><td>, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-sodium-25000 כלומר/5 מ"ל</td><td>רציופארם, אולם, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), גלוקוז גבוה, GlutaMAX</td><td>ThermoScientific, וולת'אם, ארה"ב</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>מגבר SEC-10LX</td><td>npi אלקטרוני GmbH, Tamm, גרמניה</td><td>SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>EPC 9</td><td>HEKA Elektronik GmbH, למברכט, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss, Oberkochen, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור בהגדלה נמוכה</td><td>Narashige, טוקיו, יפן</td><td>Nm-3</td><td></td></tr><tr><td>הגדלה גבוהה, מיקרומניפולטור תלת צירי</td><td>Narashige, טוקיו, יפן</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>משאבת</td> <td>זלוף פריסטלטיתמערכות רב ערוציות, רויטלינגן, גרמניה</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה דו-ערוצי</td><td>מערכות רב ערוציות, רויטלינגן, גרמניה</td><td>TCO02</td><td></td></tr><tr><td>ממריץ דופק מרובע</td><td>Natus Europe GmbH, Planegg, גרמניה</td><td>דשא SD9</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית</td><td>WPI, סרסוטה, ארה"ב</td><td>1B150F-1</td><td></td></tr></tbody></table>

מורין קצר ציר הלב ואת פרוסות הלב עבור מחקרים אלקטרו

Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Muriomyocytes Murine כבר בשימוש נרחב עבור במבחנה מחקרים של פיזיולוגיה של הלב ואסטרטגיות טיפוליות חדשות. עם זאת, הכנות רב תאיים של cardiomyocytes ניתק אינם נציג של מורכבות במבנה vivo של cardiomyocytes, שאינם myocytes ו מטריקס תאיים, אשר משפיע הן תכונות מכניות אלקטרו electiysiological של הלב. כאן אנו מתארים טכניקה להכין פרוסות חדרתי קיימא של לבבות העכבר הבוגרים עם השתמר in vivo כמו מבנה רקמות, ולהפגין את התאמתם הקלטות אלקטרו. לאחר כריתה של הלב, החדרים מופרדים מן אטריה, perfused עם Ca 2 + ללא פתרון המכיל 2,3-butanedione monoxime ו מוטבע ב 4% נמוך להמיס agarose לחסום. הבלוק ממוקם על microtome עם להב רוטט, פרוסות רקמות עם עובי של 150-400 מיקרומטר מוכנים לשמור על רטט חופשיתשל הלהב ב 60-70 הרץ והעברת הלהב קדימה לאט ככל האפשר. עובי הפרוסות תלוי ביישום נוסף. פרוסות מאוחסנים פתרון קרח קר של Tyrode עם 0.9 מ&quot;מ Ca 2 + ו 2,3-butanedione monoxime (BDM) במשך 30 דקות. לאחר מכן, פרוסות מועברים 37 מעלות צלזיוס DMEM למשך 30 דקות לשטוף את BDM. פרוסות ניתן להשתמש עבור מחקרים אלקטרופיזי עם אלקטרודות חדות או מערכים אלקטרודה מיקרו, עבור מדידות כוח לנתח את הפונקציה התכווצות או לחקור את האינטראקציה של cardiomyocytes נגזר בתאי גזע המושתל ואת רקמת המארח. לקבלת הקלטות אלקטרודה חדה, פרוסה ממוקמת לתוך צלחת 3 ס&quot;מ תרבות התא על צלחת חימום של מיקרוסקופ הפוך. פרוסת הוא מגורה עם אלקטרודה חד קוטבית, ואת הפוטנציאל פעולה תאיים של cardiomyocytes בתוך הפרוסה נרשמות עם אלקטרודת זכוכית חדה.

אוטם שריר הלב מוביל לאובדן כמעט בלתי הפיך של cardiomyocytes. טיפול חלופי נייד באמצעות cardiomyocytes נגזר בתאי גזע עבור התחדשות לב אקסוגני הוא גישה טיפולית מבטיחה. אינטגרציה חשמלית והתבגרות של התאים המושתלים הם חיוניים לבטיחות ויעילות של טיפול החלפת תאים. כדי להעריך את האינטגרציה ואת ההבשלה, אנו השתילו cardiomyocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה...

כאן, אנו מתארים את הכנת פרוסות חדר קיימא מעכברים בוגרים ושימוש שלהם עבור הקלטות אלקטרודה פעולה פוטנציאליים חדים. אלה תכשירים תאיים לספק השתמר in vivo כמו מבנה רקמות, מה שהופך אותם מודל יקר עבור מחקרים אלקטרו-פרמקולוגיים במבחנה .

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

המטרה הכללית של טכניקה זו היא להוציא פרוסות חיות של חדר הלב, המתאימות להקלטות אלקטרופיזיולוגיות. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום האלקטרופיזיולוגיה של הלב ברמת הרקמה, כגון אינטגרציה חשמלית של קרדיומיוציטים מושתלים או השפעות של תרופות פועלות על הלב. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שלפרוסות רקמה חיות מהחדר יש מבנה רקמה שנשמר, הדומה למצב in vivo, והיא מאפשרת מדידות ישירות בכל אזורי הלב.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי אלקטרופיזיולוגיה של לב עכברים, ניתן להחילה אותה גם על בעלי חיים אחרים, כגון ארנבון או חזיר גינאה. כדי להתחיל בהליך זה, נגבו תחילה את עור בעל החיים ב-70%ethanol. לאחר פתיחת בית החזה, בצעו דיסקציה זהירה של פריקרדיום הלב, באמצעות מספריים קטנים ופינצטה.החדירו קנולה לחדר השמאלי ובצעו פרפוזיה ללב in situ באמצעות תמיססת טיי로드 (Tyrode) קרה מאוד ללא סידן, עד להסרה מלאה של הדם שנותר. לאחר מכן, השקיפו בעדינות את הלב והעבירו אותו לתמיססת טיי로드 קרה מאוד ללא סידן. הפרידו את העליות מהחדרים באמצעות סקלפל או מספריים.בשלב הבא, הניחו את הפרוזדורים בתבנית האגרוז כך שהספיץ (apex) פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, מקמו את הסיכה במרכז התבנית ובתוך חלל החדר השמאלי. מלאו את התבנית באגרוז במיסוך נמוך (low-melt agarose) בריכוז 4% בטמפרטורה של 37 °C עד שהלב מכוסה לחלוטין.לאחר מכן, הניחו את התבנית על קרח כדי להאיץ את התקשות האגרוז ולמנוע מהרקמה לצוף. לאחר דקה אחת, הוציאו את בלוק האגרוז, המכיל את הפרוזורים, מהתבנית באמצעות סכין מנתחים. לאחר מכן, הפכו את הבלוק והמלאו את חללי הפרוזורים ואת הרווח בחלק האחורי של בלוק האגרוז באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה בריכוז 4% באמצעות מזרק.לאחר מכן, גזמו את בלוק האגרוז באמצעות סכין נישतर כדי להשיג בסיס שטוח ומיקום זקוף של חוד הלב (cardiac apex). בהליך זה, קבעו את הבלוק על תומך הדגימה של המיקרוטום בעזרת טיפת דבק ציאנו-אקרילט, כאשר חוד הלב פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הניחו את תומך הדגימה בתוך תא הדגימה הפנימי של המיקרוטום, המולא בתמיסת Tyrode קרה מאוד ללא סידן.יש לוודא שבלוק האגרוז מכוסה לחלוטין בתמיסת Tyrode. הכינו את הפרוסות בעובי של 150 עד 400 micrometers, בהתאם ליישום הבא. שמרו על תדר רטט של הלהב בטווח של 60 עד 70 Hertz, והניעו את הלהב קדימה, באיטיות המרבית.לאחר מכן, השתמשו במברשת עדינה כדי להסיר בזהירות את שאריות האגרוז מהפרוסות. לאחר מכן, העבירו בעדינות את הפרוסות באמצעות פיפטת פסטור לתמיסת Tyrode, עם 0.9 millimolar סידן, המאווררת ב-100% oxygen. אחסנו אותן למשך 30 דקות לפחות על קרח כדי להתאושש מהליך הפריסה.הנחת הפרוסות על רשת מסייעת לשמור עליהן שטוחות. לאחר מכן, השתמשו בנייר סינון וברשת שנייה כדי להעביר את הפרוסות ל-DMEM בטמפרטורה של 37 °C, המבעבע בקרבוגן, כדי לשטוף את ה-BDM לפני השימוש בהמשך. לצורך חימום מוקדם, הפעילו את כל המכשירים החשמליים 30 דקות לפני ההקלטות.הניחו צלחת לתרבית תאים של שלושה סנטימטרים עם פלטת החימום על המיקרוסקופ ההפוך. לאחר מכן, הניחו את אלקטרודת הטבעת המותאמת אישית בצלחת, וחברו את חוטים ההארקה של הקדם-מגבר ואת אלקטרודת העירור. לאחר מכן, חברו את הצינורות הגמישים של מערכת הפרפוזיה לצלחת.מלאו את המאגר של מערכת הפרפוזיה ב-DMEM ומאווררו אותו באמצעות קרבוגן. לאחר מכן, הפעילו את משאבת הפרפוזיה והגדירו את קצב הפרפוזיה לשני עד שלושה מיליליטר לדקה. כווננו את טמפרטורת ה-DMEM בצלחת ל-37 °C, על ידי ויסות מחמם הזרימה ופלטת החימום.כעת, הניחו פרוסה ונטריקולרית לתוך הצלחת הממולאת ב-DMEM. באמצעות המיקרוסקופ ההפוך, בדקו את השלמות המבנית ואת החיוניות של הרקמה. לאחר מכן, מלאו אלקטרודת זכוכית להקלטה ב-potassium chloride בריכוז three molar, ואלקטרודת גרייה ב-DMEM.בשלב הבא, מקמו את אלקטרודת ההקלטה ואת אלקטרודת הגירוי על תומכי האלקטרודות. לאחר מכן, הנחו בזהירות את אלקטרודת הגירוי על הפרוסה. הפעילו את הגירוי החשמלי והתחילו בתדירות גירוי של 1 עד 2 Hertz.לאחר מכן, העבירו את אלקטרודת ההקלטה באמצעות מיקרו-מניפולטור למיקום ההקלטה המיועד. הורידו באיטיות את אלקטרודת ההקלטה עד שהקצה יגע ברקמה. ברגע שההקלטה תזהה את המגע, השריעו פולס חשמלי מלבני קצר דרך אלקטרודת ההקלטה כדי לחדור את ממבנה התא.בשלב הבא, ממרקזו בזהירות את אלקטרודת ההקלטה עד להבטחת אות יציב. לאחר מכן, התחילו בהקלטה של פוטנציאלי פעולה. כדי להעריך אינטגרציה והבשלה, תאי שריר לב (cardiomyocytes), שהופקו מ-iPSCM המבטאים eGFP, הושתלו בלבבות בריאים של עכברים בוגרים.מוצג כאן פרוס של חדר הלב, המכיל iPSCM מושתלים, אשר עבר גרייה מוקדית באמצעות אלקטרודה חד-קוטבית שהוצבה ברקמת המארח. פוטנציאלי פעולה תוך-תאיים הוקלטו באמצעות מיקרו-אלקטרודות מזכוכית חדה מלאות ב-three molar potassium chloride ב-iPSCM מושתלים חיוביים ל-eGFP, וכן ברקמת מארח שכנה בתוך הפרוסות. להלן הקלטות פוטנציאל הפעולה ברקמת המארח הבריאה וב-iPSCM המושתלים.הפרוסה עוררה באופן מוקדי באמצעות אלקטרודת גירוי שהוצבה ברקמת המארח, בתדר של כ-2 Hertz ו-5 Hertz. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשעה עד שעתיים, במידה והיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על מהירות התקדמות איטית ככל האפשר של להב המיקרוטום.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מדידות ראשוניות, על מנת לענות על שאלות נוספות. לאחר פיתחו, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הטיפול התאי לבחון אינטגרציה חשמלית והבשלה של קרדיומיוציטים מושתלים בלב של מקבלים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן הכנת פרוסות חיות של ציר קצר של החדרים, באמצעות מיקרוטום עם להב רוטט.פרוסות אלו מתאימות במיוחד להקלטות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות אלקטרודות זכוכית חדות.

murine-short-axis-ventricular-heart-slices-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

תדירות גבוהה אולטרסאונד דופלר היא טכנולוגיה חדשנית להערכת תפקוד שריר הלב באזור. עבודה זו מציגה את העדות הראשונה הוכחת הישימות של פלטפורמה זו הדמיה תכליתי עבור למדוד את חוזרות ונשנות של מתח שריר הלב, dp / dt, ו regurgitation צניפי בלב אדום (IR) איסכמיה reperfused Murine.

בתדירות גבוהה ברזולוציה גבוהה אקו: העדות הראשונה על מדוד לא פולשני חוזרות ונשנות של הזנים Contractility שריר הלב, ו regurgitation צניפי בלב איסכמיה reperfused Murine

טראומה ניתוחית גורם לתגובה דלקתית. ציטוקינים ligands אנדוגניים ידועים לווסת את גודל האוטם בשריר הלב בעקבות איסכמיה ו reperfusion. אנו מציגים שונה סגור החזה מודל של איסכמיה reperfusion Murine באמצעות משקולות תלויות כדי למזער את ההשפעות של פתיחת בית החזה.

דגם Murine סגור החזה של איסכמיה של שריר הלב reperfusion

סרטון זה מדגים הליך מבוסס ויברטומים ליצירת חלקים דקים במיוחד של לב חזיר. פרוסות הרקמה המוכנות ניתנות לתרבית ומשמשות כמערכות מודל לבדיקות פרמקולוגיות.

יצירת פרוסות חדריות חזיריות: טכניקה מבוססת ויברטומים להכנת פרוסות דקות במיוחד של רקמת לב חזיר

אנחנו מראים איך להכין פרוסות אלכסוניות של חוט השדרה בעכברים צעירים. הכנה זו מאפשרת גירוי של שורשי הגחון.

הכנת פרוסות קורד אלכסון שדרה עבור גחון רוט גירוי

פתחנו תכשיר חתך אופקי של הרשתית היונקת הבוגרת עם המטוס של חתך במקביל לפני שטח הרשתית. שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית אוריינטציה nonradially לא היו מקוצץ, המאפשר חקר עיבוד אותות עם טכניקות תיקון- clamp והדמיה.

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור הנחת פרוסות לב של האדם לניסויים פרה-קליניים ופרטים השימוש במיפוי אופטי עבור הקלטת מתח טרנסממברניות ואותות סידן תאיים בו מפרוסות אלה.

מיפוי אופטי של הערכת החשמל לניתוחי לב באמצעות מתח כפול וסידן

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחתוך את רקמת הלב והתרבות בתנאים פיסיולוגיים במשך 6 ימים. מערכת זו של התרבות יכול לשמש פלטפורמה לבדיקת היעילות של אי ספיקת לב הרומן therapeutics, כמו גם בדיקות אמינות של הקרדיוקרדיטיות חריפה במודל לב תלת-ממדי.

חיתוך ולבבות חזיר מקולף בתנאים פיסיולוגיים

מוצג הוא פרוטוקול לבידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים ובעלי חיים מפרוסות שריר הלב לחתוך vibratome. תפוקות גבוהות של תאים סובלניים סידן (עד 200 תאים / מ"ג) ניתן להשיג כמויות קטנות של רקמה (&lt;50 מ"ג). הפרוטוקול ישים על שריר הלב החשוף לאישמיה קרה עד 36 שעות.

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

מודלים עכבריים מאפשרים ללמוד מנגנוני מפתח של arrhythmogenesis. לשם כך, קרדיומיוציטים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק תיקון. כאן מתוארת שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר מדידות בו זמנית של סידן חולף וזרם סידן מסוג L.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

בשל האנטומיה המורכבת, פרוטוקול דיסקציה וקציר הניתן לשחזור עקבי עבור דגימות לב יכול להיות מאתגר ליישום. כתב יד זה מציג את המרכיבים המרכזיים של כמה פרוטוקולים סטנדרטיים של דיסקציה לבבית, המדגישים הן את גישות הבדיקה הגסה והן את אתרי הדגימה המשמשים בדרך כלל לבדיקה היסטופתולוגית.

טכניקות דיסקציה ודגימה היסטולוגית של הלב במודלים של בעלי חיים גדולים למחלות לב וכלי דם

אנו מציגים פרוטוקול לטיפוח ex vivo של רקמת שריר הלב החדרית האנושית. זה מאפשר ניתוח מפורט של כוח התכווצות וקינטיקה, כמו גם את היישום של pre- ו- afterload כדי לחקות את הסביבה הפיזיולוגית in vivo מקרוב יותר.

הכנת רקמת שריר הלב האנושית לטיפוח ארוך טווח

למד הכנת פרוסות לב חיים מעכברים בוגרים לאלקטרופיזיולוגיה. השיטה שומרת על מבנה רקמה דומה לתנאי in vivo ומאפשרת מדידות ישירות בכל אזורי הלב לחקר תרופות וטיפולים.

מורין קצר ציר הלב ואת פרוסות הלב עבור מחקרים אלקטרו

גלה סרטונים נוספים