זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולשייך רקמת עצב של עכבר E17, על מנת לתרבית, להקליט ולעורר רשתות עצביות על מערכי מיקרואלקטרודות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר דינמיקת רשת, כפי שהן מתייחסות למנגנונים הבסיסיים של למידה וזיכרון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמערכי מיקרו-אלקטרודות מסוגלים להקליט ממספר אתרים בו זמנית ולכן יכולים לתת רזולוציה מרחבית וזמנית טובה יותר, בהשוואה לפיפטה הזכוכית המסורתית יותר בהקלטה באתר יחיד.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי דינמיקת הרשת של למידה וזיכרון, ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור רעילות תרופות או לעצב פרדיגמות לרפואה מותאמת אישית של הדור הבא. הדגמה חזותית של תהליך זה היא קריטית, שכן קשה ללמוד מניפולציה של הרקמה, במהלך תהליך הדיסקציה והדיסוציאציה מקריאת פרוטוקולים בלבד. להכנת המערך, הוסף 40 עד 50 מיקרוליטר למינין מופשר למרכז כל MEA, ו -0.2 מיליליטר למינין ללוחות הבקרה, באמצעות קצות פיפטה סטריליים.

מכסים את כל ה-MEA וכלי הבקרה בביו-הוד, ומעבירים אותם לאינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר שעה, הסר בזהירות את עודפי הלמינין ממרכז ה-MEA באמצעות יניקה עם פיפטות פסטר סטריליות, ותן למשטח להתייבש באוויר לפני הציפוי. לאחר מכן, יוצקים L-15 בינוני לארבע צלחות פטרי של 100 מילימטר, מכסים אותן ומניחים אותן במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך כ- 40 עד 60 דקות, עד שלמדיום יש עקביות רפש, אך אינו קפוא מוצק.

כדי להתכונן לניתוח, הניחו צלחת פטרי מזכוכית עם הפנים כלפי מטה במגש מלא בקרח. כעת רססו את הבטן התחתונה של בעלי החיים באתנול 70%. בעזרת מספריים כירורגיים קטנים, בצע חתך בצורת V דרך העור והשומן התת עורי של הבטן התחתונה, הרחב את החתך לקצוות הדיסטליים של חלל בית החזה וחשוף את הרחם.

בעזרת מלקחיים הרם בזהירות את הרחם בין העוברים. חותכים את רקמת החיבור בעזרת מספריים לדיסקציה עד שכל הרחם פנוי. לאחר מכן שטפו לזמן קצר את הרחם עם אתנול 70% כדי להסיר דם, והניחו אותו באחת מארבע צלחות הפטרי המלאות ב-L-15 קר.

לאחר מכן, שחררו כל עובר מהרחם ומהשק העוברי הפנימי, באמצעות שני זוגות מלקחיים דקים. מניחים את העוברים המשוחררים בצלחת השנייה המלאה ב-L-15 קר, ואז מעבירים את הראשים לצלחת הפטרי השלישית, ואת הגופות לרביעית. בביוהוד, הניחו טריז של נייר סינון חיטוי על צלחת פטרי הזכוכית המצוננת, והניחו ראש עובר אחד על נייר הסינון.

לאחר מכן, הנח את קצה החיתוך של הגזירה התחתונה של מספרי הקשתית לבסיס הגולגולת, תוך שמירה על הגזירה התחתונה כנגד המשטח הפנימי של הגולגולת והרחק מהמוח, חתוך דרך הצלחת העורפית ולאחר מכן לאורך קו האמצע בין הלוחות הקודקודיים. המשך לחתוך בחוזקה בין לוחות הגולגולת הקדמית הסחוסית. לאחר מכן, החל ממרכז הצלחת העורפית, בצע חתך בניצב שמאלה ומימין לחיתוך המרכזי.

לאחר מכן, החלק בזהירות מרית קטנה בין פני הגחון של המוח לבין לוחות הגולגולת התחתונים, עד שהיא נמצאת לגמרי מתחת למוח. לאחר מכן הרם את המרית למעלה כדי להסיר את המוח. בעזרת מרית נקייה, הסר תחילה את נורת הריח, ואז נתח את האונה הקדמית בתבנית טרפזית.

לאחר מכן, העבירו את הרקמה לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר המכיל אמצעי אחסון. בהליך זה, השתמש בשני להבי אזמל סטריליים כדי לטחון את הרקמה. לאחר מכן מוסיפים 2.5 מיליליטר מתערובת הפפאין של דנאז לרקמה הטחונה בצלחת הפטרי.

סובבו בעדינות את צלחת הפטרי כדי להבטיח שכל הרקמות יהיו חופשיות בתמיסה, ולא נדבקות לתחתית המנה. לאחר מכן מניחים את המנה באינקובטור בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. בביוהוד, השתמש בפיפטה סטרילית בעלת קדח רחב כדי להעביר את כל המדיה והרקמות לצינור קריוגני סטרילי של חמישה מיליליטר.

הניחו את הקצה של אותה פיפטת העברה קרוב לתחתית הצינור, וטרפו בעדינות את התערובת 10 עד 15 פעמים. לאחר מכן הוסף שני מיליליטר של DMEM 5/5 מחומם לתערובת התאים המנותקים, וכסה את צינור הצנטריפוגה. מערבבים אותו בעדינות על ידי היפוך, וצנטריפוגה בחום של 573 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

בביוהוד, השליכו את כל הסופרנטנט מבלי לשבור את המזרן. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של DMEM 5/5 מחומם למשטח בצינור כדי להשעות מחדש את התאים. השתמש בפיפטה סטרילית בעלת קדח קטן כדי לפרק את המזרן על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה עד שהתערובת הומוגנית.

לאחר מכן העבירו 10 מיקרוליטר של מתלה התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה. מחוץ למכסה המנוע, הוסף 10 מיקרוליטר של טריפאן כחול ל-10 מיקרוליטר של תרחיף התאים בצינור המיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן טען 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים הכחולים של הטריפן על שבב המוציטומטר לסילוק על מנת לספור את התאים.

בביוהוד, השתמש במיקרופיפטה סטרילית כדי להעביר 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים למרכז כל מערך, וכל צלחת פטרי בקרה. לאחר מכן מניחים את צלחות הפטרי המכוסות באינקובטור המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד ארבע שעות. לאחר מכן, הוסף בעדינות מיליליטר אחד של DMEM 5/5 מחומם לכל MEA.

הוסף בזהירות את המדיום טיפה אחת בכל פעם סביב הקצוות הפנימיים של ה-MEA, והימנע משטיפת התאים ממרכז המערך. לאחר מכן, הנח מכסה המכיל קרום FEP חדיר גז על כל MEA לפני החזרתם לחממה. לאחר יומיים, בצע החלפת מדיום מלאה ב- DMEM + מחומם על ידי הוצאת המדיום מהצלחת.

הניחו בזהירות את קצה הפיפטה על הקיר הפנימי, והוציאו מיליליטר אחד של DMEM מחומם+להאכלות הבאות, הוציאו 500 מיקרוליטר של מדיום מהצלחת, והוציאו שוב 500 מיקרוליטר של DMEM+ מחומם. בהליך זה, בדוק את דגימות המנה אחת ליומיים תחת מיקרוסקופ, כדי לחפש כיסוי תאים על פני המערך, וזיהום על ידי חיידקים או פטריות. לפני הוצאת התרביות מהחממה, חבר את בקר הטמפרטורה והפעל את המערכת, מה שמאפשר ללוחית הבסיס המחוממת של המגבר המקדים להגיע ל -35 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן הנח את התרבות המכוסה במגבר המקדים, כך שהקו השחור ב- MEA יתיישר היטב עם קרקע הייחוס. ודא שהקדם-מגבר פינים מסתדרים כך שהחלק העליון של הקדם-מגבר מאובטח, ומכסה התרבות עדיין דולק. לאחר מכן, לחץ על התחל בסביבת התוכנה כדי להתחיל לדמיין את האותות.

בחלון הראשי בחר Spikes, Detection, Automatic, שנה את ערך סטיית התקן למינוס חמש ולחץ על Refresh כדי לאפס את הסף. לאחר הדמיית האותות, לחץ על עצור, הקלט והפעל כדי להתחיל להקליט פעילות. נוירונים של עכברים עובריים מצופים ב-60 ערוצים MEAs, המאפשרים רישום בו זמנית של הפעילות העצבית על פני הרשת מכל אלקטרודה.

להלן תרשים רסטר מייצג של פעילות משמונה אלקטרודות בתגובה לגירוי לפני ואחרי האימון. הקו האדום האנכי מציין את זמן הגירוי, וסימני הסימון השחורים מציינים פוטנציאל פעולה. באימון מקדים יש תגובה מיידית לדופק הגירוי על פני ערוצים.

לאחר האימון, הרשת מציגה תגובת פעילות ממושכת יותר, כמו גם תגובה מיידית לגירוי. מוצג כאן הממוצע של 12 רשתות מאומנות ו-10 רשתות בקרה, הרשתות המאומנות מצביעות על שינוי משמעותי בתדרי הספייק. לאחר צפייה בסרטון זה אתם אמורים להבין היטב כיצד לבודד ולשייך רקמות עצביות מעכברים עובריים, ולהיות מסוגלים לתרבית, להקליט ולעורר רשתות עצביות ממערכי מיקרואלקטרודות.