Name: זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: חקור דינמיקת רשתות עצביות בתרביות תאי עצב מעכבר E17 על מערכי מיקרו-אלקטרודה. שיטה זו מאפשרת הקלטה סימולטנית מרובת אתרים לחקר מנגנוני למידה וזיכרון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע מענק CMMI-1300007. ברצוננו להכיר בחברי מעבדה קודמים, שסייעו בתכנון הפרוטוקולים הללו ובתחזוקת התרבויות במשך למעלה מחמש שנים באוניברסיטת ג&#39;ורג &#39;מייסון: ד&quot;ר ג&#39;וזף פנקראציו, ד&quot;ר חמיד צ&#39;רקר, ד&quot;ר גרטשן קנאק , ד&quot;ר פרנץ המילטון, מייקל מאקורה ורוברט גרהם.

<ol><li>Charkhkar, H., Frewin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cortical+neuronal+networks+for+in+vitro+material+biocompatibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing.</a> Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).</li>
<li>Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-frequency+stimulation+enhances+burst+activity+in+cortical+cultures+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development.</a> Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).</li>
<li>Fröhlich, F., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+electric+fields+may+guide+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endogenous electric fields may guide neocortical network activity.</a> Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nature Neurosci. 14 (2), 217-223 (2011).</li>
<li>Ozen, S., Sirota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+electric+stimulation+entrains+cortical+neuronal+populations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats.</a> J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J. Neurosci. 21 (22), 8782-8788 (2001).</li>
<li>Marom, S., Shahaf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+learning+and+memory+in+large+random+networks+of+cortical+neurons%3A+lessons+beyond+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy.</a> Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).</li>
<li>Marom, S., Eytan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+ex-vivo+developing+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons.</a> Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+learning+in+cultured+neuronal+networks+with+antagonists+of+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors.</a> Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+synchronized+bursts+in+cultured+hippocampal+neuronal+networks+with+learning+training+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays.</a> Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur. J. Neurosci. 28 (1), 221-237 (2008).</li>
<li>le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+slow+electrical+stimuli+to+achieve+learning+in+cultured+networks+of+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons.</a> PloS one. 5 (1), 8871(2010).</li>
<li>Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+neurocomputer%3A+image+processing+and+pattern+recognition+with+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).</li>
<li>Hamilton, F., Graham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Dependent+Increase+in+Network+Response+to+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation.</a> PloS one. 10 (11), 0142399(2015).</li>
<li>Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf">https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf</a> (2016).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="https://mitpress.mit.edu/books/culturing-nerve-cells">Culturing Nerve Cells: Business Source</a>. , MIT Press. Cambridge. (1998).</li>
<li>Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-latency+cross-and+autocorrelation+identify+clusters+of+interacting+cortical+neurons+recorded+from+multi-electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array.</a> J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).</li>
<li>Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Adaptation+in+Networks+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons.</a> J. Neurosci. 23 (28), (2003).</li>
<li>Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+properties+of+information+processing+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Statistical properties of information processing in neuronal networks.</a> Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השלבים המתוארים בפרוטוקול זה לספק פירוט מספיק למתחילים לצלחת שלו / שלה תרבויות עצביים על MEAs להקליט פעילות הרשת. פרוטוקול זה יעזור להבטיח כי התרבויות לדבוק כראוי, יצירת שכבת השטיח של תאים מעל מערכי האלקטרודה, ולהישאר בריאים מזהמים בחינם במשך חודשים. אמנם עדיף לדבוק בכל חלקי הפרוטוקול, ישנם שלבים לאורך כל התהליך, כי הם קריטיים לתוצאה מוצלחת. השימוש בטכניקה aseptic לאורך כל התהליך הוא הכרחי כדי למנוע את התרבויות מלהיות מזוהמים. חדש MEAs חייב להיעשות הידרופילי, כמתואר בפרוטוקול, או אחר הידבקות התא המסכן יביא. הימנעות pipetting קשה היווצרות בועות אוויר במהלך ניתוק תקטין את מספר תאים פגומים מצופה יוביל תשואה גבוהה ובריאה יותר. החל מ DMEM 5/5 ל DMEM + אחרי הראשוןהאכלה היא גם חשובה. DMEM 5/5 מכיל סרום סוס, אשר יגרום לתאי גלייה לשלוט על התרבות אם משתמשים ברציפות, וכתוצאה מכך פעילות העצבית המסכנה, למרות התרבויות יופיעו בריא 17 . האכלה תרבויות כמו מתוזמן ושמירה אותם בתנאים דוגרים ראוי גם חיוני. ציפוי תרבויות תאים על MEAs כרוך במשתנים רבים שיכולים להוביל לתוצאות פחות אופטימליות. למרות המטרה היא &quot;השטיח&quot; המושלם של תאים, כישלון כתובת השלבים הקריטיים שהוזכרו לעיל תגרום התבגרות תאים עניים או זיהום. דבק התא המסכן, אשר שונה התבגרות התא המסכן, הוא גם דאגה. זה יכול להיגרם על ידי מספר גורמים, כולל הכנה MEA עניים לפני ציפוי או שימוש בינוני ישן. אם המדיום הישן המכיל צורה מיוצב של L- גלוטמין ותוספת ללא תוסף עבור תרבות תאים עצביים (ראה טבלת חומרים) משמש, התאים בתחילה לדבוק אבל אז לצוף משם אחרי כשבועיים. אם זיהום בקטריאלי הוא בעיה מתמשכת, ניתן להוסיף לאנטיביוטיקה, כגון אמפיצילין או סטר-פטר. יש גם קוטלי פטריות זמינים לטיפול זיהום פטרייתי. אלה הם חלק מהמשתנים הנפוצים יותר שיכולים להשפיע על התוצאה של התרבויות. ישנם רבים אחרים כי יהיה רק ​​נתקל לאחר זמן וניסיון. בהשוואה לשימוש microelectrodes זכוכית, טכניקה זו מצוינת ללימוד דינמיקה רשת ותגובות פרמקולוגיות. זה מאפשר את השימוש של דפוסי גירוי שונים- temporal שונים ומאפשר הקלטה של ​​תגובות עצביים מאזורים מרובים בבת אחת. קבוצות קודמות הראו תוצאות מעניינות באמצעות פרוטוקולים דומים לאלה המתוארים כאן 18 . מאז תרבויות האחרון במשך שבועות או חודשים ואותן תרבויות ניתן לעשות בה שימוש חוזר, טכניקה זו גם אLlows עבור ניסויים מרובים לאורך זמן באותה רשת. עם זאת, יש מגבלות על טכניקה זו. MEAs אינם פולשניים. לכן, הם יכולים רק להקליט פעילות חוץ תאית, לעומת הקלטה clamping או תאיים עם טפטפות. יתר על כן, מאז כל אלקטרודה במערך מכוסה על ידי תאים אחדים, לא ניתן לפתור את הפעילות של נוירון אחד. לעומת זאת, כי אלה הם תרבויות חוץ גופית , הם לא יכולים לשחזר באופן מלא את המאפיינים המבניים של רשתות במוח. כמו כן, הפעילות יכולה להיות מוקלט רק פחות מ -30 דקות בכל פעם, ללא מנגנון כלשהו לספק אווירה CO 2 עבור התאים כדי לשמור על איזון ה- pH שלהם. לאחר טכניקה זו היא שולטת, מניפולציות תרופתי עם או ללא גירוי חשמלי ניתן לחקור. פרוטוקולים חדשים לבדיקת למידה והיווצרות זיכרון ברשתות עצביות יכולים גם להיות מתוכננים ונבדקים, יחד עם pרוקטולים לרשתות בהיפוקמפוס או בעמוד השדרה. פרוטוקולים לגירוי והכשרה של רשתות כבר פורסמו בעבר, וחלקם פותחו עוד לתוך פרוטוקולים vivo , כגון &quot;הסתגלות סלקטיבית&quot; המוצעים על ידי איתן et al. 19 . נבדקו מספר פרוטוקולים. עם זאת, רק תוצאות מתוך שינוי כדי טטנוס ההליך המוצע על ידי Ruaro בשנת 2005 מוצגים כאן 14 , 20 .

מערכי מיקרו-אלקטרודה (MEA) יכולים לשמש לבדיקת רעילות סמים, פרדיגמות עיצוב לדור הבא של הרפואה המותאמת אישית, וללמוד דינמיקה רשתית בתרבויות עצביות 1 . בניגוד לשיטות מסורתיות יותר, כגון תיקון הידוק, אשר יכול רק להקליט פעילות מתא בודד, או הקלטה שדה עם פיפטה זכוכית, אשר יכול להקליט תגובות תאיים מן הנוירונים המקיפים את האלקטרודה באתר יחיד MEAs יכול בו זמנית להקליט מאתרים מרובים בתרבות תאים ללא צורך במשימה מפרך של הצבת כל אלקטרודה בנפרד. זה מאפשר את המחקר של אינטראקציות דינמיות בין קבוצות של תאים היוצרים רשת בתוך תרבות זו. יתר על כן, את ההשפעות של גירוי חשמלי על דפוסי ירי ברשת 2 , 3 , 4 , 5 ושליטה ברשת 6 &lt;/ Sup&gt; בתרבויות העצביות תועדו היטב, ותצורות רבות של גירוי חשמלי ובקרות ניתן ליישם בקלות בתוך אותו ההתקנה ניסיוני, המאפשר מגוון רחב של דינמיקה ספקטור-טמפורלית להיחקר. אחד הדינמיקה המרכזית של עניין אלה במבחנה מחקרים היה עד כמה רשתות תרבותיות להציג מאפיינים המעידים על למידה 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . מעבדה Peixoto בעבר בחן את ההשפעות של אותות אימון בתדר גבוה, כמתואר Ruaro et al. 14 , על רשתות של נוירונים העכבר מצופה על מערכים microelectrode 15 . בניסויים אלה, רשתות הראו עלייה בתגובה followinG האימון המושרה על ידי גירוי חשמלי. התגובה המוגברת נחשבה לצורה של למידה באמצעות הכרה בגירוי, לפיה הרשתות הגיבו באופן עקבי לשינוי הגירוי לאחר יישום פרוטוקול גירוי ספציפי ( כלומר, אימון). פרוטוקול זה מדגים כיצד התרבות תאים עצביים על MEAs, להקליט בהצלחה מעל 95% של מנות מצופה, להקים פרוטוקול להכשיר את הרשתות להגיב על דפוסים של גירוי, מיון יחידה יחידה יחידה, היסטוגרמה העלילה, ולפרש את התוצאות מ ניסויים כאלה. השימוש במערכת קניינית (ראה טבלה של חומרים ) עבור גירוי והקלטת תרבויות עצביים מוכיח, כמו גם את היישום של חבילות תוכנה (ראה טבלה של חומרים ) כדי למיין יחידות עצביים. ממשק משתמש גרפי מעוצב בהתאמה אישית (ראה טבלה של חומרים ) משמש לדמיין post-sזמן היסטוגרמה זמן, מרווחי inter-interstals, משך פרץ, כמו גם להשוות את התגובה הסלולרית לגירוי לפני ואחרי פרוטוקול אימון.

<table><tbody><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td>מייצרים 4 מ"ג/מ"ל aliquots</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>תוסף ללא סרום לתרבית תאים עצביים. הכינו 1 מ"ל כוסות והקפיא</td></tr><tr><td>כוסות - זכוכית - 100 מ"ל</td><td>VWR</td><td>13912-160</td><td></td></tr><tr><td>כוסות - זכוכית - 500 מ"ל</td><td>VWR</td><td>10754-956</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים קהים עם קצה אגודל</td> World <td>Precision Instruments</td><td>500365-G</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון קריוגני - סטרילי, 2 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-26</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון קריוגני - סטרילי, 5 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-27</td><td></td></tr><tr><td>DMEM עם Glutamax</td><td>Gibco Life Technology</td><td>10569-010</td><td>מדיית תרבית תאים המכילה צורה מיוצבת של L-גלוטמין</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003172</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2030</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td> <td>עם קצה אגודל עדיןWorld Precision Instruments</td><td>501324-G</td><td></td></tr><tr><td>צנרת זכוכית</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX -- I (100X)</td><td>Gibco Life Technology</td><td>35050-061</td><td>צורה מיוצבת של L-גלוטמין המשמשת</td></tr><tr><td>כשבב המוציטומטר</td> משפר <td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-600-101</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate EB שלם</td><td>BrainBits</td><td>D00118</td><td>Ambient CO2 תא אחסון מדיה</td></tr><tr><td>סוס סרום</td><td>אטלנטה ביולוגי</td><td>S12195H</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MCS מגבר מסנן</td> מערכת <td>רב ערוצית</td><td>FA60SBC</td><td></td></tr><tr><td>MCS headstage/קדם מגבר</td><td>מערכת רב ערוצית</td><td>MEA1060-INV</td><td></td></tr><tr><td>MCS מערך מיקרואלקטרודות</td><td>מערכת רב ערוצית</td><td>60MEA200/ ספק כוח 10IR-ITO</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MCS מערכת רב ערוצית</td><td>PS20W</td><td></td></tr><tr><td>MCS מחלק אותות</td><td>מערכת רב ערוצית</td><td>SDMEA</td><td></td></tr><tr><td>MCS מחולל גירויים</td><td>מערכת רב ערוצית</td><td>STG4002</td><td></td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה MCS</td><td>מערכת רב ערוצית</td><td>TC02</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק אחסון מדיה - זכוכית 500 מ"ל</td><td>VWR</td><td>10754-818</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה אוטוקלאב - 0.4 מ"ל</td><td>תרמו פישר</td><td>3485</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה אוטוקלאב - 2 מ"ל</td><td>תרמו פישר</td><td>3434ECONO</td><td></td></tr><tr><td>קצות מיקרופיפטה אוטוקלאב - 10 &mu; L</td><td>VWR</td><td>37001-166</td><td></td></tr><tr><td>קצות מיקרופיפטה חיטוי - 1,000 &mu; L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13503-464</td><td></td></tr><tr><td>קצות מיקרופיפטה חיטוי - 200 &mu; L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>37001-596</td><td>מיקרופייפטר אוטוקלאב</td></tr><tr><td>- 10 &mu; L&nbsp;</td><td>תרמו פישר</td><td>4641170N</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטר - 1,000 &mu; L&nbsp;</td><td>תרמו פישר</td><td>4641210N</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטר - 200 &mu; L&nbsp;</td><td>תרמו פישר</td><td>4641230N</td><td></td></tr><tr><td>פפאין - 0.22</td><td>LK003178</td><td></td><td>ביוכימי וורת'ינגטון</td> מסונן</tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (Pen Strep)</td><td>תרמו פישר</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>כלי פטרי -100 מ"מ חד פעמי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי -100 מ"מ זכוכית</td><td>VWR</td><td>10754-788</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי -35 מ"מ&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>מלח מאגר פוספט (PBS) (1x)</td> <td>קורנינג</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>מערכת ניקוי פלזמה</td><td>Plasma Etch, Inc.</td><td>PE-50</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>צינור פוליאתילן חרוטי (צנטריפוגה) -15 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>צינור פוליפרופילן חרוטי (צנטריפוגה) -50 מ"ל</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>מסכות נוהל</td><td>Imco</td><td>1530-imc</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4562-5G</td><td></td></tr><tr><td>להבי אזמל</td><td>מכשירים מדויקים בעולם</td><td>&nbsp; 500237-G</td><td></td></tr><tr><td>מספריים - איריס</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>14111-G</td><td></td></tr><tr><td>מספריים -</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td> גדולים <td>14214</td><td></td></tr><tr><td>מספריים - מכשירי דיוק עולמיים כירורגיים קטנים</td><td></td><td>&nbsp; 501733-G</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית - סטרילית, 1 מ"ל&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-892</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית - סטרילית, 2 מ"ל&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית - סטרילית, 25 מ"ל&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית - סטרילית, 50 מ"ל&nbsp;</td><td>תוכנת VWR</td><td>89130-902</td><td></td></tr>: <tr><td>Matlab GUI</td><td>Peixoto Lab</td><td>npeixoto@gmu.edu</td><td>משמש לניתוח קבצי .mat.&nbsp; זמין בחינם על פי בקשה.&nbsp; צור קשר עם npeixoto@gmu.edu כדי לבקש עותק.</td></tr><tr><td>תוכנה: MCS MC_Rack</td><td>מערכת רב-ערוצית</td><td>לא ישים</td><td>משמשת לרכישת נתונים</td></tr><tr><td>תוכנה: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/neuroexplorer</td><td>משמש להמרת קבצי .nex ל-.mat</td></tr><tr><td>תוכנה: Plexon Sorter לא מקוון</td><td>&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/offline-sorter</td><td>משמש למיון קוצים עצביים ולהמרת קבצי נתונים ל-.plx ולאחר מכן ל-.nex</td></tr><tr><td>מדריך תוכנה: MCS MC_Rack</td><td>MultiChannel System</td><td></td><td>https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf</td></tr><tr><td>מדריך תוכנה: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf מדריך תוכנה: Plexon Sorter לא מקוון</td><td>&nbsp;</td><td></td><td>www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf</td></tr><tr><td>מרית - מכשירים קטנים ודו-צדדיים</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 503440</td><td></td></tr><tr><td>סטריקאפ 0.22 ומיקרו; מסנן נקבוביות m - 250 מ"ל</td><td>Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>העברת פיפטה - קדח גדול&nbsp;</td><td>פיפטת העברה Thermo Fisher</td><td>335-1S</td><td></td></tr><tr><td>- קדח קטן&nbsp;</td><td>תרמו פישר</td><td>242-1S</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון Whatman</td><td></td><td>1442 150</td><td>חותכים ל -8 טריזי פאי ואוטוקלאב בצלחת פטרי זכוכית</td></tr></tbody></table>

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

מערכי מיקרו-אלקטרודה (MEA) יכולים לשמש לבדיקת רעילות לתרופות, פרדיגמות עיצוב עבור הרפואה המותאמת אישית של הדור הבא, וללמוד את הדינמיקה של הרשת בתרבויות עצביות. בניגוד לשיטות מסורתיות יותר, כגון תיקון clamping, אשר יכול רק להקליט פעילות מתא יחיד, MEAs יכולים להקליט בו זמנית מאתרים מרובים ברשת, ללא צורך במשימה מפרך של הצבת כל אלקטרודה בנפרד. יתר על כן, רבים תצורות שליטה גירוי ניתן ליישם בקלות בתוך ההתקנה ניסיוני אותו, ומאפשר מגוון רחב של דינמיקה להיחקר. אחד הדינמיקה המפתח של עניין אלה במבחנה מחקרים כבר עד כמה רשתות תרבותיות להציג מאפיינים המעידים על למידה. תאים עצביים עכבר מתורבת על MEAs להציג עלייה בתגובה לאחר האימון המושרה על ידי גירוי חשמלי. פרוטוקול זה ממחיש כיצד התרבות תאים עצביים על MEAs; בהצלחהכבל מ מעל 95% של מנות מצופה; להקים פרוטוקול להכשרת הרשתות להגיב לדפוסים של גירוי; ו למיין, מגרש, ולפרש את התוצאות של ניסויים כאלה. השימוש במערכת קניינית לגירוי והקלטת תרבויות עצביות מוכיח. חבילות תוכנה משמשות גם למיון יחידות עצביים. ממשק משתמש גרפי מעוצב בהתאמה אישית משמש לדמיין היסטוגרמות שלאחר הגירוי שלאחר, מרווחי inter-interst, משך התפרצות, כמו גם להשוות את התגובה הסלולרית לגירוי לפני ואחרי פרוטוקול האימון. לבסוף, נדונו תוצאות מייצגות וכיוונים עתידיים של מאמץ מחקרי זה.

תאים עצביים עכבר מתורבת על מערכים אלקטרודה רב להציג עלייה בתגובה בעקבות גירוי חשמלי. פרוטוקול זה מדגים כיצד נוירונים תרבות, כיצד להקליט פעילות, וכיצד להקים פרוטוקול להכשיר את הרשתות להגיב על דפוסי גירוי.

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד ולחבר רקמה עצבית של עכבר ביום העובר E17, על מנת לגדל, להקליט ולגרות רשתות עצביות על מערכי מיקרו-אלקטרודות. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בחקר דינמיקה של רשתות, כפי שהיא קשורה למנגנונים הבסיסיים של למידה וזיכרון. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שמערכי מיקרו-אלקטרודות מסוגלים להקליט ממספר אתרים בו-זמנית, ולכן יכולים לספק רזולוציה מרחבית וזמנית טובה יותר, בהשוואה להקלטה מסמיכה על אתר בודד באמצעות פיפטת זכוכית מסורתית.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הדינמיקה הרשתית של למידה וזיכרון, ניתן להשתמש בה גם כדי לבחון רעילות של תרופות או לתכנן פרדיגמות לרפואה מותאמת אישית מהדור הבא. הדגמה חזותית של תהליך זה היא קריטית, שכן מניפולציה של הרקמה במהלך תהליך הניתוח והפירוק (dissociation) קשה ללמידה מקריאת פרוטוקולים בלבד. להכנת המערך, הוסף 40 עד 50 µL של למינין מופשר למרכז של כל MEA, ו-0.2 mL של למינין ללוחיות הביקורת, באמצעות טיפים סטריליים של פיפטה.כסו את כל ה-MEAs ואת צלחות הבקרה במCסוף הביולוגי, והעבירו אותם לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר שעה, הסירו בזהירות את עודפי הלמינין ממרכז ה-MEAs באמצעות שאיבה עם פיפטות פסטור סטריליות, והניחו למשטח להתייבש באוויר לפני הזריעה. לאחר מכן, שפכו מצע L-15 לארבע צלחות פטרי של 100 מילימטר, כסו אותן והניחו אותן במקפיא בטמפרטורה של 20- °C למשך כ-40 עד 60 דקות, עד שהמצע יגיע למרקם של שCריקה אך לא יהיה קפוא לחלוטין.כדי להכין את הדגימה לניתוח, הניחו פטריה של זכוכית הפוכה במגש מלא בקרח. כעת רססו את הבטן התחתונה של החיה ב-70% ethanol. באמצעות מספריים כירורגיים קטנים, בצעו חיתוך בצורת V דרך העור והשומן התת-עורי של הבטן התחתונה, והרחיבו את החיתוך עד לקצוות הדיסטליים של חלל בית החזה, כדי לחשוף את הרחם.בעזרת פינצטה, הרם בזהירות את הרחם שביעי העוברים. גזור את רקמת החיבור בעזרת מספרי דיסקציה עד להסרה מלאה של הרחם. לאחר מכן, שטוף קצרות את הרחם ב-70% ethanol כדי להסיר שאריות דם, והנח אותו באחת מארבעת פטריות הפטרי המולאות ב-L-15 קר.בהמשך, שחררו כל עובר מהרחם ומתוך שק העובר, באמצעות שני זוגות של פינצטות בעלות קצוות דקות. העבירו את העוברים ששוחררו לצלחנית השנייה המלאה ב-L-15 קר, לאחר מכן העבירו את הראשים לצלחנית פטרי השלישית ואת הגופים לרביעית. במבתר הביולוגי, הניחו רצועת נייר סינון שעברה אוטוקלאב על במה של צלחנית פטרי מזכוכית מקוררת, והניחו ראש עובר אחד על נייר הסינון.בשלב הבא, מקמו את קצה החיתוך של הלהב התחתון של מספרי איריס בבסיס הגולגולת. תוך כדי שמירה על הלהב התחתון צמוד למשטח הפנימי של הגולגולת ובמרחק מהמוח, חתכו דרך הלוח העורפי ולאחר מכן לאורך קו האמצע בין הלוחות הפריאטליים. המשיכו לחתוך לכיוון רוסטראלי בין לוחות הגולגולת הפרונטליים הסחוסיים. לאחר מכן, החל מהמרכז של הלוח העורפי, בצעו חיתוך מאונך לשמאל ולימין של החיתוך המרכזי.לאחר מכן, החליקו בזהירות שפכטל קטן בין הפני השטח הגבתיים (ventral) של המוח לבין לוחיות הגולגולת התחתונות, עד שיהיה הוא כולו מתחת למוח. לאחר מכן, הרימו את השפכטל כדי להוציא את המוח. באמצעות שפכטל נקי, הסירו תחילה את הפחית הריחית (olfactory bulb), ולאחר מכן בצעו דיסקציה של האונה המצחית בתבנית טרפזית.בשלב הבא, העבירו את הרקמה לתוך מבחנה לסנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר המכילה מדיום אחסון. בהליך זה, השתמשו בשני להבי סכין מנתח סטריליים כדי לקצוץ את הרקמה. לאחר מכן, הוסיפו 2.5 מיליליטר של תערובת Dnase papain לרקמה הקצוצה בתוך פטריית המאגס.סובבו בעדינות את צלחת הפטרי כדי לוודא שכל הרקמה חופשית בתמיסה ואינה דבוקה לתחתית הצלחת. לאחר מכן, הניחו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. במנדף הביולוגי, השתמשו בפיפט העברה סטרילי בעל קוטר רחב כדי להעביר את כל המצע והרקמה לשפרוֹר קריוגני סטרילי בנפח 5 mL.הנח את קצה אותה פיפטת העברה קרוב לתחתית המבחנה, וערבב בעדינות את התערובת באמצעות שאיבה ושחרור (chiterate) 10 עד 15 פעמים. לאחר מכן, הוסף שני milliliters של DMEM 5/5 מחומם לתערובת התאים המופרדים, וסגור את מכסה מבחנת הצנטריפוגה. ערבב בעדינות על ידי היפוך, וסבב בצנטריפוגה ב-573 times g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.בתוך קבוב המגורם (biohood), השליכו את כל הנוזל העליון (supernatant) מבלי להרוס את המשקע. לאחר מכן, הוסיפו למשקע שבמבחנה מיליליטר אחד של DMEM 5/5 מחומם כדי להשעות מחדש את התאים. השתמשו בפיפט העברה סטרילי בעל קוטר קטן כדי לפרק את המשקע על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה עד שהתערובת תהיה הומוגנית.לאחר מכן, העבירו 10 µl מתליה של תרחיף התאים לפרונטת מיקרוצנטריפוגה. מחוץ למCב biohood, הוסיפו 10 µl של trypan blue ל-10 µl של תרחיף התאים בפרונטת המיקרוצנטריפוגה. לאחר מכן, טענו 10 µl של תרחיף התאים עם trypan blue לשבב המוסימטר (hemocytometer) חד-פעמי לצורך ספירת התאים.בתוך מ 빠르게 המגירה הביולוגית (biohood), השתמשו במיקרופיפטה סטרילית להעברה של 50 µL של תרחיף תאים למרכזו של כל מערך, ולכל צלחת פטרי של בקרה. לאחר מכן, הכניסו את צלחות הפטרי המכוסות לאנקובטור המכוון ל-37 °C למשך שלוש עד ארבע שעות. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 1 mL של DMEM 5/5 מחומם לכל MEA.הוסיפו בזהירות את המצע, טיפה אחת בכל פעם, מסביב לשוליים הפנימיים של ה-MEA, והימנעו משטיפה של התאים ממרכז המערך. לאחר מכן, מקמו מכסה המכיל ממברנת FEP חדירה לגזים על כל MEA לפני החזרתם לאינקובטור. לאחר יומיים, בצעו החלפה מלאה של המצע באמצעות DMEM+ מחומם, על ידי שאיבת המצע מהצלחת.הניחו בזהירות את קצה הפפטה על הדופן הפנימית, וטפטפו 1 mL של DMEM+ מחומם. להאכלות הבאות, שאבו 500 µL של מצע מהצלחת, וטפטפו שוב 500 µL של DMEM+ מחומם. בהליך זה, בחנו את דגימות הצלחת מדי יומיים תחת מיקרוסקופ, כדי לבדוק את כיסוי התאים על המערך ואת קיומה של זיהום חיידקי או פטרייתי. לפני הוצאת התרביות מהאינקובטור, חברו את בקר הטמפרטורה לחשמל והפעילו את המערכת, כדי לאפשר לפלטת הבסיס המחוממת של הקדם-מגבר להגיע ל-35 °C.לאחר מכן, מקם את התרבית הסגורה במגבר הקדם, כך שהקו השחור בבאר ה-MEA יהיה מיושר עם האדמה של הייחוס. ודא שפיני מגבר הקדם מיושרים כך שחלקו העליון של מגבר הקדם מאובטח, ומכסה התרבית עדיין מורכב. לאחר מכן, לחץ על start בסביבת התוכנה כדי להתחיל בהדמיית האותים.בחלון הראשי בחרו ב-Spikes, Detection, Automatic, שנו את ערך סטיית התקן למינוס חמישה, ולחצו על Refresh כדי לאפס את הסף. לאחר הדמיית האותים, לחצו על Stop, Record ו-Play כדי להתחיל בהקלטת הפעילות. נוירונים של עכברים עובריים נזרעים על MEAs בעלי 60 ערוצים, המאפשרים הקלטה סימולטנית של הפעילות הנוירונלית ברחבי הרשת מכל אלקטרודה.להלן תרשים רסטר מייצג של פעילות משמונה אלקטרודות בתגובה לגירוי לפני ואחרי האימון. הקו האדום האנכי מציין את זמן הגירוי, והסימנים השחורים מציינים פוטנציאלי פעולה. לפני האימון, קיימת תגובה מיידית לפולס הגירוי בכל הערוצים.בשלב שלאחר האימון, הרשת מציגה תגובת פעילות ממושכת יותר, לצד התגובה המיידית לגירוי. מוצג כאן הממוצע של 12 רשתות מאומנות ו-10 רשתות בקרה; הרשתות המאומנות מעידות על תדרי פריקה (spike frequencies) ששנויים באופן משמעותי. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן הבידוד וההקשרה של רקמה עצבית מעוברים של עכברים, ותהיו מסוגלים לבצע תרבית, הקלטה וגירוי של רשתות עצביות באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרודות.

time-dependent-increase-network-response-to-stimulation-neuronal-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מספק את המידע הדרוש להקמת, טיפול, הקלטה מ - ו - גירוי חשמלי תרבויות על MEAs.

איך להקליט התרבות לעידוד רשתות נוירונים על מיקרו אלקטרודה מערכים (MEAs)

דרך חזקים כדי ללמוד מפולות העצבית, כלומר בקנה מידה משתנה במרחב ובזמן פרצי פעילות, מעיד על דינמיקה מצב קריטי בקליפת המוח. מפולות לצאת באופן ספונטני בפיתוח בשכבות השטחיות של קליפת תרבותי המאפשר לטווח ארוך מדידות של הפעילות עם מערכים מישוריים משולב רב אלקטרודה (MEA) בתנאים מבוקרים בדיוק.

Multi-אלקטרודה מערך הקלטות של מפולות העצבית תרבויות Organotypic

הסרטון מדגים כיצד להשתמש במערך מיקרואלקטרודות (MEA) כדי להקליט את הפעילות האלקטרופיזיולוגית של תאי עצב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs). פעילות אלקטרופיזיולוגית מ-MEA רב-באר המכיל תרבית משותפת של נוירון-אסטרוציטים נרשמת כדי לזהות פוטנציאלי פעולה מתאי עצב מרובים ברשת, מה שמאשר את ההתמיינות המוצלחת של hiPSCs לנוירונים.

מדידת הפעילות האלקטרופיזיולוגית של רשתות נוירונים באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרודות

סרטון זה מדגים את הליך השימוש במערך רב-אלקטרודות (MEA) למדידת פיזיולוגיה סינפטית בספירות קוקולטורה תלת-ממדיות. שיטה זו מאפשרת להבין את הדינמיקה של הרשת העצבית ואת פעילות פרץ הרשת הסינפטית בתוך הספירות התלת-ממדיות.

שימוש במערכים מרובי אלקטרודות למדידת פיזיולוגיה סינפטית בספירות קוקולטורה תלת-ממדית

בעבודה זו, מודל ניסיוני חדשני שבו תרביות עצביות תלת-ממדיות מחוברות למערכי מיקרו-אלקטרודות מישוריים (MEAs) presented. 3D רשתות נבנות על ידי זריעת נוירונים בפיגום המורכב ממיקרו-חרוזי זכוכית שעליהם גדלים נוירונים ויוצרים מבנים תלת-ממדיים המחוברים זה לזה.

התממשקות תרבויות 3D הנדסה עצבית למערכי מיקרו-אלקטרודה: חדשני<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם ניסיוני

אנו מציגים פרוטוקול לתרבית נוירונים של גנגליון ספירלי עכברי ראשוני על מערכי אלקטרודות מרובים כדי לחקור פרופילי תגובה עצבית ולייעל את פרמטרי הגירוי. מחקרים כאלה נועדו לשפר את ממשק הנוירו-אלקטרודה של שתלי שבלול כדי להועיל לשמיעה אצל מטופלים כמו גם לצריכת האנרגיה של המכשיר.

ספירלת גנגליון Neuron explant תרבות Electrophysiology על מערכי אלקטרודה רבות

חשיפה ל: רעלנים סביבתיים יכולים להשפיע בחריפות עוברי המתפתח. משבשי כגון bisphenols ידועים להשפיע לרעה על מערכת העצבים. כאן נתאר פרוטוקול באמצעות מודל הרשת העצבית בעלי חוליות (אפרוח העובר) במבחנה לחקור את ההשפעה הפונקציונלית של חשיפה הרעלן על עוברי מוקדם.

הערכת ההשפעה של משבשי תרכובות על הפיתוח של רשת עצבית חוליות הפונקציה באמצעות אלקטרודה מרובה מערכים

פרוטוקול זה מטרתו להדגים כיצד לשלב במבחנה microelectrode מערכים להתקנים microfluidic לימוד פוטנציאל הפעולה שידור בתרבויות עצביים. ניתוח נתונים, כלומר זיהוי ואפיון של הפצת פוטנציאל פעולה, הוא שבוצעו באמצעות חדש מתקדם, אך ידידותי למשתמש, זמינה בחופשיות, כלי חישובית.

התממשקות מיקרופלואידיקה עם מערכים Microelectrode ללמוד תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב

מאמר זה מכיל קבוצה של פרוטוקולים לפיתוח של האדם המושרה הנגרמת לתאי גזע (היפנוsc-CM) רשתות המתורבתות על לוחות בעלי השפעה מרובת המידות כדי electroporate הפיך קרום התא עבור מדידות פוטנציאליות פעולה. הקלטות תפוקה גבוהה מתקבלות מאותם אתרי תא במשך ימים ברציפות.

האדם הנגזר iPSC האנטי נטוורקס רשתות על Multiwell מיקרו מערכים אלקטרודה לפעולה ונשנים הקלטות פוטנציאליות

הדפסה תלת ממדית בקנה מידה מיקרומטרי מאפשרת אב טיפוס מהיר של התקנים פולימריים עבור תרביות תאים עצביים. כהוכחה עקרונית, קשרים מבניים בין נוירונים הוגבלו על ידי יצירת מחסומים וערוצים המשפיעים על צמיחת נוירוטים, בעוד שההשלכות התפקודיות של מניפולציה כזו נצפו על ידי אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית.

פילמור שני פוטונים הדפסה תלת-ממדית של התקני תרבית תאים עצביים בקנה מידה מיקרוני

פרוטוקול זה נועד להרכיב ביציבות מכלולים מאוחים גביים-גחונים על מערכים מרובי אלקטרודות לצורך מידול אפילפסיה במבחנה.

פלטפורמה מרובת אלקטרודות למידול אפילפסיה באמצעות מכלולי מוח פלוריפוטנטיים אנושיים שמקורם בתאי גזע

חקור דינמיקת רשתות עצביות בתרביות תאי עצב מעכבר E17 על מערכי מיקרו-אלקטרודה. שיטה זו מאפשרת הקלטה סימולטנית מרובת אתרים לחקר מנגנוני למידה וזיכרון.

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

גלה סרטונים נוספים