זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד ולחבר רקמה עצבית של עכבר ביום העובר E17, על מנת לגדל, להקליט ולגרות רשתות עצביות על מערכי מיקרו-אלקטרודות. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בחקר דינמיקה של רשתות, כפי שהיא קשורה למנגנונים הבסיסיים של למידה וזיכרון. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שמערכי מיקרו-אלקטרודות מסוגלים להקליט ממספר אתרים בו-זמנית, ולכן יכולים לספק רזולוציה מרחבית וזמנית טובה יותר, בהשוואה להקלטה מסמיכה על אתר בודד באמצעות פיפטת זכוכית מסורתית.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הדינמיקה הרשתית של למידה וזיכרון, ניתן להשתמש בה גם כדי לבחון רעילות של תרופות או לתכנן פרדיגמות לרפואה מותאמת אישית מהדור הבא. הדגמה חזותית של תהליך זה היא קריטית, שכן מניפולציה של הרקמה במהלך תהליך הניתוח והפירוק (dissociation) קשה ללמידה מקריאת פרוטוקולים בלבד. להכנת המערך, הוסף 40 עד 50 µL של למינין מופשר למרכז של כל MEA, ו-0.2 mL של למינין ללוחיות הביקורת, באמצעות טיפים סטריליים של פיפטה.

כסו את כל ה-MEAs ואת צלחות הבקרה במCסוף הביולוגי, והעבירו אותם לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר שעה, הסירו בזהירות את עודפי הלמינין ממרכז ה-MEAs באמצעות שאיבה עם פיפטות פסטור סטריליות, והניחו למשטח להתייבש באוויר לפני הזריעה. לאחר מכן, שפכו מצע L-15 לארבע צלחות פטרי של 100 מילימטר, כסו אותן והניחו אותן במקפיא בטמפרטורה של 20- °C למשך כ-40 עד 60 דקות, עד שהמצע יגיע למרקם של שCריקה אך לא יהיה קפוא לחלוטין.

כדי להכין את הדגימה לניתוח, הניחו פטריה של זכוכית הפוכה במגש מלא בקרח. כעת רססו את הבטן התחתונה של החיה ב-70% ethanol. באמצעות מספריים כירורגיים קטנים, בצעו חיתוך בצורת V דרך העור והשומן התת-עורי של הבטן התחתונה, והרחיבו את החיתוך עד לקצוות הדיסטליים של חלל בית החזה, כדי לחשוף את הרחם.

בעזרת פינצטה, הרם בזהירות את הרחם שביעי העוברים. גזור את רקמת החיבור בעזרת מספרי דיסקציה עד להסרה מלאה של הרחם. לאחר מכן, שטוף קצרות את הרחם ב-70% ethanol כדי להסיר שאריות דם, והנח אותו באחת מארבעת פטריות הפטרי המולאות ב-L-15 קר.

בהמשך, שחררו כל עובר מהרחם ומתוך שק העובר, באמצעות שני זוגות של פינצטות בעלות קצוות דקות. העבירו את העוברים ששוחררו לצלחנית השנייה המלאה ב-L-15 קר, לאחר מכן העבירו את הראשים לצלחנית פטרי השלישית ואת הגופים לרביעית. במבתר הביולוגי, הניחו רצועת נייר סינון שעברה אוטוקלאב על במה של צלחנית פטרי מזכוכית מקוררת, והניחו ראש עובר אחד על נייר הסינון.

בשלב הבא, מקמו את קצה החיתוך של הלהב התחתון של מספרי איריס בבסיס הגולגולת. תוך כדי שמירה על הלהב התחתון צמוד למשטח הפנימי של הגולגולת ובמרחק מהמוח, חתכו דרך הלוח העורפי ולאחר מכן לאורך קו האמצע בין הלוחות הפריאטליים. המשיכו לחתוך לכיוון רוסטראלי בין לוחות הגולגולת הפרונטליים הסחוסיים. לאחר מכן, החל מהמרכז של הלוח העורפי, בצעו חיתוך מאונך לשמאל ולימין של החיתוך המרכזי.

לאחר מכן, החליקו בזהירות שפכטל קטן בין הפני השטח הגבתיים (ventral) של המוח לבין לוחיות הגולגולת התחתונות, עד שיהיה הוא כולו מתחת למוח. לאחר מכן, הרימו את השפכטל כדי להוציא את המוח. באמצעות שפכטל נקי, הסירו תחילה את הפחית הריחית (olfactory bulb), ולאחר מכן בצעו דיסקציה של האונה המצחית בתבנית טרפזית.

בשלב הבא, העבירו את הרקמה לתוך מבחנה לסנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר המכילה מדיום אחסון. בהליך זה, השתמשו בשני להבי סכין מנתח סטריליים כדי לקצוץ את הרקמה. לאחר מכן, הוסיפו 2.5 מיליליטר של תערובת Dnase papain לרקמה הקצוצה בתוך פטריית המאגס.

סובבו בעדינות את צלחת הפטרי כדי לוודא שכל הרקמה חופשית בתמיסה ואינה דבוקה לתחתית הצלחת. לאחר מכן, הניחו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. במנדף הביולוגי, השתמשו בפיפט העברה סטרילי בעל קוטר רחב כדי להעביר את כל המצע והרקמה לשפרוֹר קריוגני סטרילי בנפח 5 mL.

הנח את קצה אותה פיפטת העברה קרוב לתחתית המבחנה, וערבב בעדינות את התערובת באמצעות שאיבה ושחרור (chiterate) 10 עד 15 פעמים. לאחר מכן, הוסף שני milliliters של DMEM 5/5 מחומם לתערובת התאים המופרדים, וסגור את מכסה מבחנת הצנטריפוגה. ערבב בעדינות על ידי היפוך, וסבב בצנטריפוגה ב-573 times g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

בתוך קבוב המגורם (biohood), השליכו את כל הנוזל העליון (supernatant) מבלי להרוס את המשקע. לאחר מכן, הוסיפו למשקע שבמבחנה מיליליטר אחד של DMEM 5/5 מחומם כדי להשעות מחדש את התאים. השתמשו בפיפט העברה סטרילי בעל קוטר קטן כדי לפרק את המשקע על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה עד שהתערובת תהיה הומוגנית.

לאחר מכן, העבירו 10 µl מתליה של תרחיף התאים לפרונטת מיקרוצנטריפוגה. מחוץ למCב biohood, הוסיפו 10 µl של trypan blue ל-10 µl של תרחיף התאים בפרונטת המיקרוצנטריפוגה. לאחר מכן, טענו 10 µl של תרחיף התאים עם trypan blue לשבב המוסימטר (hemocytometer) חד-פעמי לצורך ספירת התאים.

בתוך מ 빠르게 המגירה הביולוגית (biohood), השתמשו במיקרופיפטה סטרילית להעברה של 50 µL של תרחיף תאים למרכזו של כל מערך, ולכל צלחת פטרי של בקרה. לאחר מכן, הכניסו את צלחות הפטרי המכוסות לאנקובטור המכוון ל-37 °C למשך שלוש עד ארבע שעות. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 1 mL של DMEM 5/5 מחומם לכל MEA.

הוסיפו בזהירות את המצע, טיפה אחת בכל פעם, מסביב לשוליים הפנימיים של ה-MEA, והימנעו משטיפה של התאים ממרכז המערך. לאחר מכן, מקמו מכסה המכיל ממברנת FEP חדירה לגזים על כל MEA לפני החזרתם לאינקובטור. לאחר יומיים, בצעו החלפה מלאה של המצע באמצעות DMEM+ מחומם, על ידי שאיבת המצע מהצלחת.

הניחו בזהירות את קצה הפפטה על הדופן הפנימית, וטפטפו 1 mL של DMEM+ מחומם. להאכלות הבאות, שאבו 500 µL של מצע מהצלחת, וטפטפו שוב 500 µL של DMEM+ מחומם. בהליך זה, בחנו את דגימות הצלחת מדי יומיים תחת מיקרוסקופ, כדי לבדוק את כיסוי התאים על המערך ואת קיומה של זיהום חיידקי או פטרייתי. לפני הוצאת התרביות מהאינקובטור, חברו את בקר הטמפרטורה לחשמל והפעילו את המערכת, כדי לאפשר לפלטת הבסיס המחוממת של הקדם-מגבר להגיע ל-35 °C.

לאחר מכן, מקם את התרבית הסגורה במגבר הקדם, כך שהקו השחור בבאר ה-MEA יהיה מיושר עם האדמה של הייחוס. ודא שפיני מגבר הקדם מיושרים כך שחלקו העליון של מגבר הקדם מאובטח, ומכסה התרבית עדיין מורכב. לאחר מכן, לחץ על start בסביבת התוכנה כדי להתחיל בהדמיית האותים.

בחלון הראשי בחרו ב-Spikes, Detection, Automatic, שנו את ערך סטיית התקן למינוס חמישה, ולחצו על Refresh כדי לאפס את הסף. לאחר הדמיית האותים, לחצו על Stop, Record ו-Play כדי להתחיל בהקלטת הפעילות. נוירונים של עכברים עובריים נזרעים על MEAs בעלי 60 ערוצים, המאפשרים הקלטה סימולטנית של הפעילות הנוירונלית ברחבי הרשת מכל אלקטרודה.

להלן תרשים רסטר מייצג של פעילות משמונה אלקטרודות בתגובה לגירוי לפני ואחרי האימון. הקו האדום האנכי מציין את זמן הגירוי, והסימנים השחורים מציינים פוטנציאלי פעולה. לפני האימון, קיימת תגובה מיידית לפולס הגירוי בכל הערוצים.

בשלב שלאחר האימון, הרשת מציגה תגובת פעילות ממושכת יותר, לצד התגובה המיידית לגירוי. מוצג כאן הממוצע של 12 רשתות מאומנות ו-10 רשתות בקרה; הרשתות המאומנות מעידות על תדרי פריקה (spike frequencies) ששנויים באופן משמעותי. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן הבידוד וההקשרה של רקמה עצבית מעוברים של עכברים, ותהיו מסוגלים לבצע תרבית, הקלטה וגירוי של רשתות עצביות באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרודות.