Name: כימות פיגמנטציה בטן ב תסיסנית מלנוגאסטר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: למד שיטה לכימות פיגמנטציה בבטן ב-Drosophila melanogaster באמצעות ניתוח תמונה דיגיטלי. טכניקה זו מאפשרת מדידה לא הרסנית של פיגמנטציה לחקר ביולוגיה אבולוציונית וגנטיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע מענקים IOS-1256565 ו- IOS-1557638 ל- AWS. אנו מודים לפטרישיה ויטקופ ולשלושה מבקרים אנונימיים על הערותיהם המועילות על גרסה קודמת של מאמר זה.

למחברים אין מה לחשוף.

מתודולוגיה זו מאפשרת את הרכישה המדויקת, המהירה והדירנטית של נתוני הפיגמנטציה בצורה כמותית המתאימה למספר ניתוחים במורד הזרם. השיטה שימשה כדי לרכוש נתונים על השפעת הטמפרטורה על פיגמנטציה בטן בקו איזוגני של זבובים. עם זאת, ניתן להשתמש במתודולוגיה במחקרים עתידיים על גנטיקה כדי לזהות גנים המונחים ביסוד הבדלי הפיגמנטציה בין פרטים, אוכלוסיות או מינים, או מחקרים גנטיים-לאחור כדי לחקור את ההשפעות של גנים ספציפיים על דפוסי פיגמנטציה. אמנם, כפי שצוין לעיל, היו מחקרים רבים אשר בחנו את התפתחות...

פיגמנטציה מראה וריאציה פנוטיפית עצומה בין מינים, אוכלוסיות, יחידים, ואפילו בתוך אנשים במהלך אונטוגני 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . למרות שיש מספר רב של מחקרים על פיגמנטציה במגוון רחב של בעלי חיים, פיגמנטציה אולי למד הכי טוב ב תסיסנית melanogaster , שבו מלוא העוצמה של גנטיקה מולקולרית שימש כדי להבהיר את המנגנונים ההתפתחותיים והפיזיולוגיים להסדיר פיגמנטציה וכיצד מנגנונים אלה מתפתחים 1 , 6 . הרבה ידוע על הגנים המסדירים את הסינתזה הביוכימית של פיגמנטים בד. מלנוגאסטר 7 , 8 והגנים השולטים בדיאטה הזמני והמרחביהפצה של ביוסינתזה זו 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . יתרה מזאת, מיפוי גנטי זיהה את הלוקים הגנטיים שעמדו ביסוד ההבדלים הבין-בין-אישיים בפיגמנטציה ב- d melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . כמו כן נבדקו היחסים בין פיגמנטציה לבין תכונות פליאוטרופיות, כגון התנהגות 18 , 19 וחסינות 19 , 20 , כמו גם המשמעות האדפטיבית של דפוסי פיגמנטציה 15 , 21 , 22 . ככזה, פיגמנטציה ב מלנוגאסטר התפתחה כמו מ &#39;חזק אך פשוטOdel לפיתוח ואבולוציה של פנוטיפים מורכבים. פיגמנטציה אצל מבוגרים ד מלנוגאסטר מאופיין על ידי דפוסים שונים של מלניזציה על פני הגוף, במיוחד על הכנפיים ועל החזה הגב והבטן. זה הפיגמנטציה של כל צלחת cuticular (tergite) על הבטן הגב, עם זאת, כי קיבל את תשומת הלב המחקרית ביותר. יש וריאציה ניכרת פיגמנטציה זו ( איור 1A- F ), בגלל הן גנטי 17 , 23 ו 24 סביבתיים , 25 גורמים. לציפורן של tergite הבטן מורכב תאים התפתחותיים הקדמי אחורי ( איור 1G ), שכל אחד מהם ניתן לחלק נוסף בהתאם בהתאם פיגמנטציה וקישוט 26 . התא הקדמי כולל שישה cuticleסוגים (a1-a6), ואת התא האחורי כולל שלושה (p1-p3) ( איור 1G ). מבין אלה, את p1, p2, ו a1 cuticle הם בדרך כלל מקופל תחת tergite ב abdomens un-stretched כך שהם מוסתרים. הציפורן הנראית לעין מאופיינת על ידי רצועה של פיגמנטציה כבדה, הנקראת כאן &quot;רצועת פיגמנט&quot;, המורכבת מטיפוסים מסוג A4 (שעיר עם זיפים מתונים) ו- A5 (שעיר עם זיפים גדולים), עם הקצה האחורי של הלהקה פיגמנט אינטנסיבי יותר מהקצה הקדמי ( איור 1G ). קדמית להקה זו הוא אזור של פיגמנטציה קלה שעיר, אשר יש זיפים האחורי (a3), אבל לא anteriorly (a2). שינוי בפיגמנטציה בין זבובים הוא ציין הן את עוצמת הפיגמנטציה ואת רוחב של פיגמנט הלהקה. באופן כללי, וריאציה היא הגדולה ביותר במגזרים האחורי ביותר (קטעים הבטן 5, 6, ו -7) והוא נמוך יותר קטעים הקדמי יותר (הבטן se3 ו -4). יתר על כן, יש דימורפיזם מיני ב d melanogaster פיגמנטציה, עם זכרים בדרך כלל יש פיגמנטציה מלאה 5 ו tergites הבטן ( איור 4 ג ). במרבית המחקרים של פיגמנטציה בטנית ב- d melanogaster , הפיגמנטציה טופלה כמאפיין קטגורי או סודי, כאשר הדפוס נמדד איכותית 27 , 28 , 29 או חצי כמותי בסולם 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . שיטות אלה סובלות בהכרח מחוסר דיוק, ומכיוון שהן מסתמכות על הערכה סובייקטיבית של פיגמנטציה, קשה להשוות את הנתונים בין המחקרים. מחברים אחדים כימו את הממדים המרחביים של פיגמנטציה 38 , 39 , את עוצמת הפיגמנטציה של סוג מסוים של קוטיקולה 23 , 25 , 39 , 40 , או את העוצמה הממוצעת של פיגמנטציה על פני הטרגיט הבטן כ -41 , 42 , 43 . אף על פי כן, שיטות כימות אלה אינן מודדות הן את האינטנסיביות והן את ההתפלגות המרחבית של הפיגמנטציה הבבטית בו זמנית, ולכן אינם לוכדים את הניואנסים של האופן שבו הפיגמנטציה משתנה על פני הבטןטחון. יתר על כן, כמה שיטות כימות אלה 38 , 41 , 42 , 43 דורשים את הנתיחה ואת הרכבה של cuticle הבטן. זה גם זמן רב הורס את המדגם, מה שהופך אותו זמין עבור ניתוחים מורפולוגיים נוספים. ככל שהבנת ההתפתחות והאבולוציה של הפיגמנטציה הבטן מעמיקה, כלים מתוחכמים יותר כדי למדוד במהירות ובדייקנות הן את ההתפלגות המרחבית והן את עוצמת הפיגמנטציה. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לנצל את ניתוח התמונה הדיגיטלית כדי להשיג מדידה חוזרת ומדויקת יותר של פיגמנטציה הבטן ד melanogaster . המתודולוגיה כוללת שלושה שלבים. ראשית, הזבוב הבוגר הוא רכוב ללא הרס, ואת התמונה הדיגיטלית של הבטן הגב נלקח. שנית, באמצעות מאקרו ImageJ, המשתמשמגדיר פס קדמי קדמי של פיקסלים המשתרע הקדמי של a2 לציפורן האחורי של a5 cuticle (קופסה ירוקה, איור 1G ) על שני קטעים הבטן השלישי והרביעי. ערך הפיקסל הממוצע לאורך רוחב הרצועה מחולק לאורך ציר הזמן, ומייצר פרופיל המבחין בחלוקה המרחבית ובעוצמת הפיגמנטציה כפי שהיא משתנה מהחלק הקדמי לחלק האחורי של הטרגיט. שלישית, סקריפט R משמש לתיאור פרופיל הפיגמנטציה במתמטיקה באמצעות קו מעוקב. התסריט R משתמש בשפכים ובנגזרות הראשון והשני שלו כדי לחלץ את רוחב הציפורן a2-a5, את רוחב רצועת הפיגמנט ואת רמות הפיגמנט המקסימליות והמינימליות. השיטה ולכן מכמת הן את המאפיינים המרחביים ואת עומק הפיגמנטציה בטן. מתודולוגיה זו מכמתת את הפיגמנטציה של הטרגיטים הבטן השלישית והרביעית,אשר היו מוקד של מחקרים קודמים רבים 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , או באופן בלעדי או בשילוב עם tergites האחורי. אם כי פחות משתנה מאשר טרגיטים הבטן החמישית והשישית, tergites השלישי והרביעי אינם פיגמנטציה לחלוטין אצל גברים, כך פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על גברים ונשים כאחד. עם זאת, כפי שמוצג כאן, פרוטוקול ניתן להשתמש כדי למדוד פיגמנטציה של 5 ו tergites הבטן הנקבות אצל נקבות. יתר על כן, שינויים קלים של סקריפטים המשמשים כדי לחלץ את המאפיינים של פרופיל פיגמנטציה צריך לאפשר את השיטה לשמש לכמת וריאציה פיגמנטציה במגוון רחב של אחריםאורגניזמים.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 ביולוגיה מלקחיים</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח היקף</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>בסיס</td><td>Leica</td><td>MDG41</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>Leica</td><td>DFC280</td><td></td></tr><tr><td>צוואר אווז מקור אור קר</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>תמונה תוכנת בקרת רכישה</td><td>Micro-Manager v1.3.20</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr> תוכנה <tr><td>לניתוח תמונה</td><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>תוכנת ניתוח נתונים</td><td>R 3.3.2</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDWE-15</td><td></td></tr><tr><td>מולטימטר</td><td>Fluke</td><td>Fluke 75 סדרה II</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי</td><td>Celltreat מוצרים מדעיים</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומטר שלב</td><td>Klarman Rulings, Inc.</td><td>KR-867</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות פיגמנטציה בטן ב<em&gt; תסיסנית מלנוגאסטר</em

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

פיגמנטציה היא תכונה פשוטה מבחינה מורפולוגית אך משתנה מאוד שלעתים קרובות יש לה משמעות מסתגלת. היא שימשה באופן נרחב כמודל להבנת ההתפתחות והאבולוציה של פנוטיפים מורפולוגיים. פיגמנטציה בטן ב תסיסנית melanogaster היה שימושי במיוחד, המאפשר לחוקרים לזהות את loci כי ביסודו inter- ו intrapecific וריאציות במורפולוגיה. עם זאת, עם זאת, d. melanogaster פיגמנטציה בטן כבר assayed במידה רבה מבחינה איכותית, באמצעות ניקוד, ולא כמותי, אשר מגביל את צורות ניתוח סטטיסטי שניתן להחיל על נתונים פיגמנטציה. עבודה זו מתארת ​​מתודולוגיה חדשה המאפשרת כימות של היבטים שונים של דפוס פיגמנטציה הבטן של המבוגר ד melanogaster . הפרוטוקול כולל הדגימה הדגימה, לכידת תמונה, מיצוי נתונים, וניתוח. כל התוכנה המשמשת לכידת תמונות וניתוח מאקרו תכונהשנכתב עבור ניתוח תמונות קוד פתוח. היתרון של גישה זו היא היכולת למדוד במדויק תכונות פיגמנטציה באמצעות מתודולוגיה כי הוא לשחזור מאוד על פני מערכות הדמיה שונות. בעוד הטכניקה שימשה למדידת וריאציה של דפוסי הפיגמנטציה טרגאל של המבוגר ד melanogaster , המתודולוגיה היא גמישה וישימה רחב על דפוסי פיגמנטציה במספר עצום של אורגניזמים.

הפרוטוקול שימש כדי לחקור את ההשפעה של טמפרטורת גידול על פיגמנטציה בטנית. מחקרים קודמים הראו כי עלייה בטמפרטורה התפתחותית גורמת לירידה בהתפשטות הפיגמנטציה הבטן במספר מינים של תסיסנית , כולל ד מלנוגאסטר 30 , 32 . באופן ספציפי, ב tergites בטן 3 ו 4, היקף הפיגמנטציה (רוחב של פיגמנט הלהקה) פוחתת מ 17 ° C עד 25 ° C ו נשאר זהה מ 25 ° C עד 28 ° C 24 ,<...

עבודה זו מציגה שיטה במהירות ובמדויק לכמת את הפיגמנטציה הבטן של תסיסנית melanogaster באמצעות ניתוח תמונה דיגיטלית. שיטה זו מייעלת את ההליכים בין רכישת פנוטיפ וניתוח נתונים וכולל הדגימה הרכבה, רכישת תמונה, מיצוי ערך פיקסל, ומדידה תכונה.

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא כימות מהיר של פיגמנטציה בבטן זבוב הפירות *Drosophila melanogaster*. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה האבולוציונית, כגון זיהוי הלוקוסים הגנטיים העומדים בבסיס וריאציה מורפולוגית ספציפית למאכלס, והבנת הפיתוח והאבולוציה של פנוטיפים מורפולוגיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת למשתמשים למדוד באופן לא הרסני היבטים שונים של פיגמנטציה בבטן, כולל את פריסתה ועומקה של הפיגמנטציה.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הפיגמנטציה הבטנית של Drosophila melanogaster, ניתן להחילה אותה גם על מיני Drosophila אחרים ולהתאימה בקלות למדידת דפוסי פיגמנטציה בחרקים ובתקסונים של בעלי חיים אחרים. לפני הדימוי, ניתן לשמור את הזבובים ב-70% ethanol כדי לשמר את הפיגמנטציה שלהם. לצורך הוויזואליזציה נדרשת משטח קיבוע.מלאו צלחת פטרי בקוטר 60 מילימטר בכ-10 מיליליטר של 1.25% agar במים. תחת מיקרוסקופ, השתמשו בפינצטה עדינה כדי לחפור בג'ל תעלה באורך 20 מילימטר, ברוחב שני מילימטר ובעומק מילימטר אחד. ניתן ליצור מספר תעלות בצלחת אחת.לאחר מכן, טמנו את הזבובים בתוך התעלה כך שהמשטח המיועד לניתוח יהיה ממוקם ממש מעל פני הג'ל. במקרה זה, הצד הגבי (dorsal) הוא זה שמעניין אותנו. כעת, מלאו את הצלחית ב-70% ethanol עד שהזבובים יהיו שקועים לחלוטין.פעולה זו מפחיתה השתקפ

quantifying-abdominal-pigmentation-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

וריאציה פנוטיפי עבור תכונות יכול לנבוע מוטציות cis-הרגולציה (Cre) רצפים אלמנט השליטה דפוסי ביטוי גנים. שיטות נגזר לשימוש תסיסנית melanogaster יכול כמותית להשוות את רמות דפוסי במרחב ובזמן של ביטוי גנים בתיווך או שונה באופן טבעי וריאנטים cre.

השוואה כמותית של Cis-רגולטוריות (Cre) אלמנט פעילות טראנסגנטי תסיסנית melanogaster</em

פרוטוקולים עבור היערכות תקופות הגולמי ומדידה של אגף פיגמנטציה של דרוזופילה guttifera מתוארים. האחסון הזמני, כימות של פיגמנטציה לספק בסיס מוצק לימוד מנגנוני התפתחותית של תכונות למבוגרים ולאפשר השוואה interspecific של תכונה הפיתוח.

שיטות מדידה של אגף פיגמנטציה של דרוזופילה guttifera ותקופות הגולמי הזמני

דרוזופילה הוא מודל ניסיוני נפוץ המתאים לסינון תרופות עם יישומים פוטנציאליים לטיפול בסרטן. כאן, אנו מתארים את השימוש של דרוזוהילה מגוונים העין פנוטיפים כשיטה להקרנה תרכובות קטנות מולקולה לקדם את היווצרות הטרוכרומטין.

שיטת הקרנה לזיהוי הטרוכרומטין-קידום תרופות באמצעות דרוזוהילה

פוליפואידציה הנגרמת על-ידי פצע היא אסטרטגיה של תיקון רקמות שוחמרות שבה תאים גדלים בגודל במקום לחלק כדי לפצות על אובדן תאים. הנה פרוטוקול מפורט על איך להשתמש בזבוב הפירות כמודל למדוד תכסיסה ויסות גנטי שלה בתיקון פצעים אפיתל.

מודל Drosophila לחקר פוליפלואידים הנגרמים על ידי פצע

רגולטורים של פונקציות מלנוציטים שולטים בהבדלים גלויים בתוצאות הפיגמנטציה. פענוח הפונקציה המולקולרית של גן הפיגמנטציה המועמד מציב אתגר. כאן אנו מדגימים את השימוש במערכת מודל דגי זברה כדי לזהות מועמדים ולסווג אותם לווסתים של תכולת המלנין ומספר המלנוציטים.

גישה גנטית הפוכה לזיהוי מווסתי פיגמנטציה באמצעות דגי זברה

כאן מתוארות שיטות לא פולשניות ללוקליזציה של חלבוני קרום פוטורצפטור ולהערכת ניוון הרשתית בעין המורכבת דרוזופילה באמצעות פלואורסצנציה eGFP.

חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי דרוזופילה פוטורצפטור באמצעות חלבונים המתויגים על ידי eGFP

אנו מציגים פרוטוקול לאפיון אלקטרופיזיולוגי של פוטופיגמנטים דו-יציבים: (1) ניצול תזוזות המטען בתוך מולקולות הפוטוגמנט בעקבות בליעת הפוטונים וכמותם העצומה בפוטורצפטורים, ו-(2) ניצול הבדלי הספיגה-ספקטרום של מצבי הפוטוגמנט של רודופסין ומטרהודופסין. פרוטוקולים אלה שימושיים לסינון מוטציות המשפיעות על מערכות פוטופיגמנט דו-יציבותיות.

שיטות אלקטרופיזיולוגיות למדידת רמות פוטופיגמנט בדרוזופילה פוטורצפטורים

מערכת העיניים דרוזופילה היא כלי שימושי לחקר תהליכים ביולוגיים שונים, במיוחד מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות. עם זאת, כימות ידני של פנוטיפים של עיניים גסות יכול להיות מוטה ולא אמין. כאן אנו מתארים שיטה שבה ilastik ו Flynotyper משמשים לכימות פנוטיפ העין בצורה משוחדת.

כימות דרוזופילה מלנוגסטר פנוטיפים בעין: גישה חישובית המשלבת אילסטיק ופלינוטיפר

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה מהירה, בעלות נמוכה, עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של עיני דרוזופילה בוגרות כדי לכמת דפוסי דפוס ופגמי גדילה. אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו להכנת דגימות על ידי הרכבה נקודתית, רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה וניתוח תמונה.

תהליך עבודה מהיר ופשוט לכימות מבני דרוזופילה חיצוניים למבוגרים

למד שיטה לכימות פיגמנטציה בבטן ב-Drosophila melanogaster באמצעות ניתוח תמונה דיגיטלי. טכניקה זו מאפשרת מדידה לא הרסנית של פיגמנטציה לחקר ביולוגיה אבולוציונית וגנטיקה.

כימות פיגמנטציה בטן ב

גלה סרטונים נוספים