כימות פיגמנטציה בטן ב תסיסנית מלנוגאסטר
1 ביוני 2017
עבודה זו מציגה שיטה במהירות ובמדויק לכמת את הפיגמנטציה הבטן של תסיסנית melanogaster באמצעות ניתוח תמונה דיגיטלית. שיטה זו מייעלת את ההליכים בין רכישת פנוטיפ וניתוח נתונים וכולל הדגימה הרכבה, רכישת תמונה, מיצוי ערך פיקסל, ומדידה תכונה.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לכמת במהירות פיגמנטציה בטנית בזבוב הפירות Drosophila melanogaster. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה האבולוציונית, כגון זיהוי המיקומים הגנטיים העומדים בתורם בבסיס מורפולוגיה של וריאציות ספציפיות לאמון והבנת ההתפתחות והאבולוציה של פנוטיפים מורפולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת למשתמשים למדוד באופן לא הרסני היבטים שונים של פיגמנטציה בבטן, כולל התפשטות ועומק הפיגמנטציה.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי פיגמנטציה בבטן של דרוזופילה מלנוגסטר, ניתן ליישם אותה גם על מינים אחרים של דרוזופילה ולהתאים אותה בקלות למדידת דפוסי פיגמנטציה בחרקים אחרים ובמינים של בעלי חיים. לפני ההדמיה, ניתן לאחסן את הזבובים ב-70% אתנול כדי לשמור על הפיגמנטציה שלהם. הדמיה דורשת כרית הרכבה.
טען צלחת פטרי בגודל 60 מילימטר עם כ -10 מיליליטר של 1.25% אגר במים. תחת מיקרוסקופ, השתמש במלקחיים עדינים כדי לחפור תעלה באורך 20 מילימטר, ברוחב שני מילימטרים, בעומק מילימטר אחד לתוך הג'ל. ניתן להכין מספר תעלות במנה אחת.
לאחר מכן הטמיעו זבובים בתעלה כשהמשטח לניתוח יושב ממש מעל משטח הג'ל. במקרה זה, הצד הגבי מעניין. כעת, מלאו את המנה באתנול 70% עד שהזבובים שקועים לחלוטין.
זה מפחית השתקפויות מהציפורן שעלולות לטשטש את דפוס הפיגמנטציה. כעת, הפעל את תוכנת ההדמיה והמצלמה הדיגיטלית המחוברות למיקרוסקופ. עבור מקור אור, אור קר ממכשיר צוואר אווז כפול הוא מספיק.
בתוכנת ניתוח התמונות, הגדר את סוג התמונה ל-8 סיביות. לאחר מכן, בתוכנת לכידת התמונה, החלף את ההגדרה Live כדי לפתוח view חלון של המצלמה. הגדר את סוג התמונה לגווני אפור.
כעת, הגדר את מקור האור לעוצמתו המקסימלית ומקם את האורות במרחק של כ-120 מילימטרים מהבמה. הגדר את המיקרוסקופ להגדלה פי 60 כך ששדה הראייה יהיה ברוחב של שלושה מילימטרים. לאחר מכן הנח את המיקרומטר של שני מילימטר במה בשדה הראייה והתמקד בו.
בחזרה לתוכנה, התאם את זמן החשיפה לצפייה במיקרומטר באמצעות השדה שנמצא בתיבת החשיפה. ואז הגדר את קנה המידה. פתח את כלי הקו הישר וצייר אורך של שני מילימטרים לאורך המיקרומטר של הבמה.
לאחר מכן הזן את האורך הזה תחת הגדר קנה מידה אופציה. לאחר מכן החלון אמור להציג את קנה המידה בפיקסלים למיקרון. שימו לב לקנה המידה ואשרו את ההתאמות.
כעת, חזור לתוכנת לכידת התמונות והשתמש בפקודות עצור והצמד כדי ללכוד תמונה של מיקרומטר הבמה. לאחר מכן חזור לתוכנת ניתוח התמונות ושמור את התמונה כקובץ Tiff. כעת, התמקדו בקו האמצע הגבי של זבוב רכוב.
יש למקם את קו האמצע ישר כלפי מעלה לקבלת תוצאות ההדמיה הטובות ביותר. דחפו הצידה את הכנפיים וכל מבנה בולט אחר והתאימו את התאורה כך שתאיר את הציפורן בצורה הטובה ביותר. לאחר מכן, הגדר את החשיפה בתוכנת לכידת התמונות באמצעות היסטוגרמה של ערך הפיקסלים כמדריך ללכידת טווח הפיקסלים המלא של התמונה ללא רוויה, ובכך למקסם את הניגודיות.
שמור על החשיפה והתאורה הזו לאורך כל הניסוי. כעת, לפני צילום תמונה, ודא שקטעי הבטן המעניינים נראים לעין. לאחר מכן צלם תמונה ושמור את התמונה עם מספר המזהה לדוגמה בשם הקובץ.
השתמש בתבנית המתוארת בפרוטוקול הכתוב. ניתוח זה עושה שימוש במאקרו שסופקו על ידי המחברים. כל סדרת התמונות לניתוח צריכה להיות כלולה באותה תיקיית קבצים.
כעת, הפעל את המאקרו ופעל לפי הפקודות המתבקשות. ראשית, זהה את מיקום הקבצים המאוחסנים. לאחר מכן זהה את המיקום שבו יש לאחסן את נתוני הניתוח.
לאחר מכן, הזן את מספר התווים ששימשו בשמות הקבצים כך שהתוכנה תקרא את סדרת התמונות בצורה נכונה. ההנחיה הבאה היא לרוחב אזור העניין. כאן, הזן את מספר הפיקסלים לאורך הרצועה הקדמית-אחורית שצריך לנתח.
כעת, בהנחיה, בחר לנתח את התמונה הראשונה בסדרה. האפשרויות האחרות הן לנתח את התמונה הבאה בסדרה או לצאת מהניתוח. כלי הקו נבחר אוטומטית.
השתמש בו כדי לזהות את קו האמצע בתמונה על ידי ציור קו לאורכו בכיוון הקדמי לאחורי. לאחר מכן, עקוב אחר הנחיות המאקרו כדי לזהות את הקצה האחורי של Tergite4 באמצעות כלי הקו. כלי הקו זמין לציור הקו מקצה קו האמצע האחורי לקצה הצדדי הימני, כך שמרכז הקו יהיה רק אחורי לקצה האחורי של רצועת הפיגמנט.
לאחר מכן הגדר את הקצה הקדמי של Tergite4 באמצעות כלי הקו. צייר קו מקצה קו האמצע הקדמי לקצה הצדדי הימני. אמצע הקו המוגדר על ידי ריבוע לבן צריך לשבת בקצה הקדמי של הקוטיקולה בעלת הפיגמנט הקל.
עם מידע זה, המאקרו מייצר כעת פרופיל פיגמנטציה. עם זאת, הפרופיל עלול להיות לא מדויק אם זיפים או פגמים אחרים חוצים את הרצועה שלאורכה נמדד הפרופיל. כדי לתקן זאת, בחרו בתצוגה מקדימה חיה בחלון ההיסטוגרמה והתאימו את הקו כך שהפרופיל יהיה חלק.
כדי שרצועת ניתוח התמונה תלכוד במדויק את ההיבטים השונים של פיגמנטציה, חיוני לזהות אזור ניתוח שיהיה בו רעש מינימלי הנגרם על ידי אי סדרים בתמונה או בדגימה. כעת המשך לנתח את Tergite3 באותה תמונה ולאחר מכן עבור לתמונה הבאה. ההליך המתואר שימש כדי לחקור שינוי ידוע בפיגמנטציה של הבטן שנגרם על ידי טמפרטורת הגידול.
הטרגיט השלישי והרביעי נבדקו מספר פעמים תחת תאורה וחשיפות שונות. נחקרו היבטים שונים של הפיגמנטציה. ובאופן ספציפי, נמצא כי רצועות הפיגמנטציה היו רחבות יותר כאשר זבובים גודלו בטמפרטורות נמוכות יותר.
לאחר מכן הושוו הערכים המחושבים למדדים סובייקטיביים כלליים שנעשו על אותם זבובים על ידי חמישה צופים שונים. בהערכה של 45 נקבות זבובים, הדירוג הממוצע שנצפה של רוחב רצועת הפיגמנטציה הרביעית בבטן היה בקורלציה הדוקה עם המדידה האוטומטית של המאקרו. אותה רצועת פיגמנטציה נמדדה גם באופן ידני באמצעות תוכנת הדמיה.
תוצאות אלה היו גם בקורלציה חזקה עם מדידות שנוצרו באמצעות המאקרו. לאחר מכן נבדקה התוכנה כדי למדוד פיגמנטציה במוטציות הובנה נקביות, הידועות כמגבירות פיגמנטציה ברצועות הפיגמנטציה השלישית והרביעית. השיטה שימשה גם למדידת רצועות הבטן החמישית והשישית של נקבות מסוג בר.
הטכניקה האוטומטית תמיד סיפקה מדידות שימושיות של צפיפות הפיגמנט וגודל הרצועה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכמת במהירות ובדייקנות פיגמנטציה בטנית בדרוזופילה. שליטה בטכניקה דורשת בעיקר שימוש עמוק במלקחיים.
לאחר השליטה, ניתן לבצע את חלק ההדמיה של טכניקה זו בקצב של 50 דגימות לשעה. חילוץ אמצעי הפיגמנטציה מתמונות אלה יכול להיעשות בקצב של 70 תמונות בשעה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
עבודה זו מציגה שיטה לכימות מהיר ומדויק של הפיגמנטציה הבטנית של Drosophila melanogaster באמצעות ניתוח תמונות דיגיטלי. טכניקה זו מאפשרת מדידה לא-הרסנית של התפשטות ועומק הפיגמנטציה, ובכך מספקת תובנות בתחום הביולוגיה האבולוציונית.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה אבולוציונית
- גנטיקה
רקע
- Drosophila melanogaster היא אורגניזם מודל במחקרים גנטיים ואבולוציוניים.
- הבנת הפיגמנטציה יכולה לחשוף לוקוסים גנטיים הקשורים לווריאציה מורפולוגית.
- טכניקות דימוי לא-הרסניות הן חיוניות לניתוח מדויק של הפנוטיפ.
- אחסון מוקדם ב-70% ethanol מסייע בשמירה על הפיגמנטציה לצורך דימוי.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהירה לכימות פיגמנטציה בבטן.
- סיוע בבחינת שאלות גנטיות ואבולוציוניות ב-Drosophila.
- אספקת טכניקה שניתן להחיל על מיני Drosophila אחרים ועל חרקים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח תמונות דיגיטלי לכימות פיגמנטציה.
- קיבוע הדגימה על פד ויזואליזציה.
- רכישת תמונות והפקת ערכי פיקסלים.
- מדידה של מאפייני פיגמנטציה.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת כימות מדויק של תכונות פיגמנטציה.
- היא מייעלת את התהליך מרכישת הפנוטיפ ועד לניתוח הנתונים.
- התוצאות יכולות לתרום למחקרים על אבולוציה מורפולוגית.
- הטכניקה ניתנת להתאמה לשימוש בטקסונים שונים של חרקים.
מסקנות
- מתודולוגיה זו משפרת את חקר הפיגמנטציה הבטנית ב-Drosophila.
- היא מספקת מסגרת למחקרים עתידיים בביולוגיה אבולוציונית.
- ניתן להרחיב את הגישה למינים אחרים ולתכונות מורפולוגיות אחרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח פנוטיפי כמותי מאפשר מדידה מדויקת של תכונות מורפולוגיות, ובכך תומך בתיקוף של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. שיטה זו מספקת הפקת נתונים הניתנת לשחזור ובקנה מידה רחב עבור דפוסי פיגמנטציה, דבר המקל על שיתוף פעולה רב-תחומי ומגביר את הביטחון החיזוי במחקרי גנוטיפ-פנוטיפ. יכולת ההסתגלות שלה בין טקסוני חרקים שונים משפרת את הרצף התרגומי ואת הרלוונטיות של פורטפוליו המחקר בתהליכי סינון פנוטיפיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של לוקוסים גנטיים העומדים בבסיס שונות מורפולוגית באמצעות מדידה כמותית של תכונות.
- ערך תפעולי: מספק דימוי שאינו הרסני ובעל תפוקה גבוהה, התואם למערכי סריקה גנטית.
- ערך אסטרטגי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי מסלולים התפתחותיים המשפיעים על ביטוי פנוטיפי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות וסטנדרטיות של עוצמת הפיגמנטציה ורוחב הפס בקרב דגימות.
- ערך תפעולי: עושה שימוש במאקרו של תוכנה בקוד פתוח לצורך הפקת נתונים עקבית בין מערכות דימות שונות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר מוכנות של הבדיקה לסריקת משנים גנטיים של מסלולי פיגמנטציה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקל על מידול מערכות רלוונטיות למחלה על ידי כימות של תכונות מורפולוגיות אדפטיביות.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות בין מעבדות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של קיבוע ודימות.
- ערך אסטרטגי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי מתאם בין הגנוטיפ לתוצר פנוטיפי מדיד.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של ביולוגיה גילויית על ידי מתן אפשרות לניתוח כמותי של תכונות בעקבות הפרעה גנטית או מודולציה סביבתית.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת היפותזות ובהבהרת מסלולים באמצעות כימות מורפולוגי מדויק.
- סריקה: מספק סטנדרטיזציה של בדיקות ותוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך הערכת תרכובות או משנים גנטיים.
- אנליטיקה: מספק מדידות מבוססות פיקסלים ותוצאות סטטיסטיות להשוואת התפלגויות פנוטיפיות.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות תכונות מדידות בעלות רלוונטיות אבולוציונית.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמת דימות וניתוח רב-פעמית ליישומי סריקה מורפולוגית מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי במערכות יחסים בין גנוטיפ לפנוטיפ באמצעות מדידה אובייקטיבית וכמותית של תכונות.
- ערך תפעולי: הדירות ויכולת הרחבה גבוהות, עם דימוי של 50 דגימות לשעה ואנליזה של 70 תמונות לשעה.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) באמצעות הפחתת העמימות בהערכה הפנוטיפית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות גנטיות מבוסס סיכון באמצעות ספי הפנוטיפ כמותיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, במיקרוסקופיה ובתוכנות לניתוח תמונות.
- תלוי בתאורה סטנדרטית, בהגדלה ובכיול קנה מידה לצורך מדידות מדויקות.
- מחייב הקפדה על הפרוטוקול בין הצוותים השונים לצורך קיבוע דגימות ואחסון באתנול באופן עקבי.
- שיקולי התאמה כוללים כיוונון של רוחב אזור העניין (ROI) עבור מינים או סוגי רקמות שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות לרעש הנובע מסיסות או מאי-סדירויות בדגימה, הדורשות תיקון ידני של הפרופיל.
