Name: DiI זלוף כשיטת ויזואליזציה של כלי הדם Ambystoma מקסיקניום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: למד שיטת צביעת DiI לוויזואליזציה של כלי דם ב-Ambystoma mexicanum באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. טכניקה זו מאפשרת חקר תהליכי רגנרציה ורווסקולריזציה ברקמות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי בית החולים בריגהם &amp; נשים ואת מצעד של דיים. המחברים מבקשים להודות לכל חברי המעבדה הלבנה על תמיכתם ועצתם.

כל הניסויים axolotl בוצע בהתאם בית החולים בריגהם של נשים (BWH) מוסדיים טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה. 1. הגדרת ניסוי perfusion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים axolotl מבוגר במיכל פלסטיק מלא עם פתרון 0.1% tricaine (MS222) במשך 15-20 דקות או עד הרדים לחלוטין. ודא כי מיכל מלא פתרון tricaine מספיק כך axolotl הוא שקוע לחלוטין. הערה: יש לבצע את כל ההליכים בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים. ב BWH, axolotl נחשב להרדים לחלוטין כאשר הוא נכשל מבחן רגל קמצוץ, כלומר אין תנועה רפלקסיבית כאשר כף הרגל הוא סחוט בעדינות. זהירות: למרות tricaine הוא חומר הרדמה המשמש במיוחד עבור אורגניזמים מימיים, מגע ישיר העור עם פתרון tricaine יש להימנע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תחנת זלוף axolotl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אתמשטח סופג על משטח שטוח, שטוח עם הצד סופג כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים חור במסגרת קצף פוליסטירן כי הוא בגודל המתאים ואת הצורה עבור axolotl הרדים להניח במצב שכיבה. מניחים את המסגרת על משטח סופג. הערה: ניתן למקם מגבות נייר נוספות מיד מתחת למסגרת לקבלת ספיגה נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המשאבה peristaltic עם צינורות זלוף. הגדר את המשאבה בקצב זרימה של 0.7 מ&quot;ל / דקה, זורם בכיוון השעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הפתרון מדולל עם 0.7x PBS ו 5% גלוקוז בתערובת 1: 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 10 מ&quot;ל של פתרון diluent עם 200 μL של פתרון המניות DiI בצינור 50 מ&quot;ל חרוטי. כיפה ומערבבים על ידי היפוך. כיסוי זה צינור עם נייר אלומיניום לסכל כדי להגן על פתרון העבודה מחשיפה לאור. הערה: כרכים צריך להיות שונה בהתאם לגודל של axolotl באופן יחסי. ערכים אלה הם עבור axolotl כ 15 ס&quot;מ (אורך snout-to-tail). אנימלים בגודל זה אולי לא הגיעו לבגרות מינית מלאה ולכן המין החיה לא ייקבע בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים צינור חרוטי 50 מ&quot;ל עם 0.7x PBS. הערה: PBS ישמש עבור תחול לולאה exxanguination axolotl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את המחט 27-מד פר כדי סוף היציאה של צינורות זלוף. מקפלים את כנפי פרפר אחד על השני ומניחים בעמדה מהדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקצה החופשי של צינורות זלוף בצינור 50 מ&quot;ל חרוטי מלא 0.7x PBS ולהפעיל את משאבת זלוף עד צינורות כולו מלא פתרון. להשהות את המשאבה פעם את כל צינורות מלא PBS. הערה: ודא צינורות ללא בועות אוויר בכל עת, כמו אלה יגרום האוויר emboli ב axolotl ולמנוע זלוף מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מגבת נייר בצורת axolotl בצורת מסגרת קצף פוליסטירן. באמצעות פיפטה העברה, להשרות את המגבת עם פתרון tricaine. הערה: חותכים ריבוע קטן באמצע מגירת הנייראל כדי לאפשר ניקוז של נוזלים במהלך הליך זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שסתום axolotl הרדים על מגבת נייר בתוך מסגרת קצף פוליסטירן. </li></ol></li></ol> 2. פתיחת חזה האקסולוט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים כירורגיים כדי לצבוט את העור לאורך הציר המרכזי של החזה של axolotl, ממש מתחת לקו הכתפיים. לַעֲקוֹר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אזמל לבצע חתך קטן שבו העור כבר משך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פיסת עור מרובעת על החזה כדי לחשוף שתי צלחות סחוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העור כדי לפתוח חלון מעל חלל בית החזה גדול מספיק כדי לראות בבירור את הלב כ 5 מ&quot;מ של אבי העורקים הסתעפות של הלב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לקרוע את רקמת החיבור באמצעות מלקחיים או מספריים סגורים על מנת למנוע חיתוך כל כלי הדם העיקריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם כל צלחת הסחוס בנפרד באמצעות מלקחיים ובלו אותם WIth את המספריים כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לצבוט את קרום הלב עם מלקחיים, למשוך למעלה, לנקב אותו באמצעות מספריים כירורגית; חתך זה צריך להיות רק מספיק עמוק כדי לנקב את קרום הלב דק מאוד צריך להיות גדול מספיק כדי לאפשר הסרת קרום הלב. הקפד לא לחתוך את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בעדינות את קרום הלב כדי לחשוף את הלב ואת אבי העורקים. הערה: באמצעות פיפטה העברה, מעת לעת לשטוף את חלל החזה ואת הזימים עם פתרון tricaine לשמור על האזור ברור ולשמור על axolotl הרדים. </li></ol> 3. זלוף של Axolotl <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עמדת מהדק עם מחט פרפר טעון ליד מסגרת קצף פוליסטירן, כך זרוע של מהדק יכול בקלות להיות מניפולציה כדי להכניס את המחט לתוך אבי העורקים axolotl. הצבע את קצה המחט לכיוון היבט מקורי של החיה במהלך ההכנסה ולשמור על המחט מקבילים אבי העורקים, כדי למנוע ניקוב זה דרך opצד חיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה peristaltic. 0.7x PBS צריך להמשיך לזרום דרך צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט לתוך אבי העורקים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלק את מלקחיים מתחת לקשת אבי העורקים ולמשוך מעט כדי לאפשר גישה קלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמרן את שילוב מחט המחט כך המחט פועל לאורך אורך של אבי העורקים, מצביע לכיוון הראש. הכנס את המחט תוך שימוש במלקחיים עבור תמיכה מאחורי אבי העורקים. הערה: המחט צריך להיות מוכנס עמוק מספיק לתוך אבי העורקים כדי להבטיח שזה לא יחליק החוצה במהלך זלוף. זה יכול להיות על 5 מ&quot;מ עבור 15 ס&quot;מ axolotl. ודא כי המחט היא באופן מושלם בקנה אחד עם אבי העורקים, כדי למנוע לנקב מוחלט של כלי השיט. באמצעות ו-נקבים יכול לגרום דימום מסיבי ולהפחית את שיעורי ההצלחה של זלוף. ההכנסה מוצלחת ניתן לאשר על ידי הגדלה גלוי של אטריה של הלב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר laterate אטריום אחד עם sciSsors ולאפשר דם להתרוקן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף עם פתרון tricaine כדי למנוע הצטברות דם היווצרות קריש בחלל החזה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse את axolotl עם כ 20-30 מ&quot;ל של PBS. הבהמה צריכה להשתנות מ ורוד בהיר בצבע לבן על זלוף מוצלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשהות את המשאבה peristaltic ולהזיז את הקצה החופשי של צינורות לתוך צינור 15 מ&quot;ל של פתרון DiI. הפעל מחדש את המשאבה, היזהר כדי למנוע יצירת בועות אוויר בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse את axolotl עם מלאי העבודה כולו של DiI. הערה: ב זלוף מוצלח, axolotl עם שינוי צבע ורוד בהיר של DiI. זה יהיה בולט ביותר הזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשהות את המשאבה לאחר זלוף עם DiI הושלם במקום סוף חינם של צינורות לתוך פתרון Paraformaldehyde 4% (PFA) לתקן את הרקמה. הפעל מחדש את המשאבה ואת perfuse לפחות 10 מ&quot;ל של PFA. זהירות: PFA הוא רעיל צריך להיות מטופלים ו dispoSed של כראוי. כפפות וכוסות בטיחות צריך להיות משוחק, ופתרונות צריך להיעשות בתוך מכסה המנוע קטר. זלוף של axolotl עם PFA לתקן את הרקמה תוצאות המוות של החיה. </li></ol> 4. סיום זלוף ההכנה ויזואליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את המשאבה peristaltic ולהסיר את המחט מן האאורטה axolotl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את axolotl על צלחת פלסטיק. הערה: שימוש של חצי צלחת פטרי גדול עובד היטב ומאפשר לשפוך כמות קטנה של Tricaine או PBS על axolotl כדי לשמור על העור רטוב ולשפר את איכות הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשליך את כל החומרים בשימוש בפחים פסולת המתאימים. נקי כלים כירורגיים עם אתנול 70%, לחטא באמצעות מעקר זכוכית חרוז בין בעלי חיים, וכן לעקר ידי מעוקר בעקבות ההליך. צנרת צינורות עם פתרון PBS ולאחר מכן לנקז, יבש לחלוטין, ולאחסן לשימוש נוסף. </li></ol> 5. ויזואליזציה של Axolotl perfused <oL&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את axolotl תחת מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האורות כמו הדמיה של כלי מוכתם DiI הוא מונע על ידי האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ירוק הקרינה הקרינה פליטה קוביית ( למשל ET-CY3) עם מיקרוסקופ confocal לדמיין את כלי הדם של axolotl. השתמש אור עירור 545 ננומטר. הערה: כדי להשיג תמונה באיכות גבוהה, ניתן להשתמש בפרמטרים הבאים: חשיפה ל -1.1 s, רווח של 1x, רוויה של 1.0, הגדלה של 2X. </li></ol>

<ol><li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Rom+J+Morphol+Embryo%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li>
<li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374(2013).</li>
<li>Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23328838"> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li>
<li>Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.formatex.info/microscopy4/29-39.pdf"> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li>
<li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li>
<li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li>
<li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4895330/">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li>
<li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li>
<li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ויזואליזציה של כלי הדם של axolotl ניתן להשיג בהצלחה באמצעות זלוף עם צבע lbophilic carbocyanine, DiI. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול חדש עבור זלוף של axolotl עם DiI באמצעות משאבת peristaltic. כמו כן, אנו מראים את ההדמיה שלאחר מכן של vasculature axolotl באמצעות מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי. פרוטוקול זה היה הסתגלות של המכרסמים DiI זלוף פרוטוקול לראות Li et al. 7 , אולם ההבדלים העיקריים בין מכרסם לבין axolotl נדרש עדכון של הפרוטוקול כדי להתאים את המוד...

ויזואליזציה של כלי הדם משחק תפקיד חיוני בהבנת המבנה והתפקוד של אורגניזמים על פני מינים רבים. החל מהמאה ה -16 עם לאונרדו דה וינצ&#39;י, נחקרו מודלים וייצוגים גרפיים של המחזור. באמצעות שעווה ותבניות גומי, רקמות היו perfused כדי ליצור מודלים תלת מימדיים של כלי הדם, אשר אפשרה את המחקר של אורגנוזה ו פתוגנזה 1 , 2 . שרפים ושעווה היו בצבע עם צבעים כגון הודו דיו או אדום carmine כדי לאפשר להדמיה קלה שלהם 1 , 2 . עם זאת, טכניקות אלה גרמו לבעיות רבות בגלל צמיגות גבוהה שלהם מנעו זלוף מלא של הרקמה של עניין 1 . ככל שהשדה נעשה מתוחכם יותר, השימוש במיקרוסקופים קונפוקליים ואלקטרוניים נכנס לפעולה, והעביר את הטכנולוגיות של הזלוף<html> Ues במרחק של תבניות יצוק לעבר נוזלים נוזלי של כלי הדם, שחלקם מותר זלוף הדמיה של כלי הדם מבלי להרוס את הרקמה הראשונית 3 . DiI, צבע קרבוזינין פלואורסצנטי, הוא כתם אחד כזה המאפשר זלוף של בעלי חיים ללא נזק לרקמות כלי הדם. צבעים Carbocyanine הם צבעים lipophilic המשלבים לתוך קרום התא על המגע. צבעים אלה מאפשרים מכתים קל מיידית של תאים אנדותל כלי דם, אשר לאחר מכן ניתן לצפות תחת מיקרוסקופ confocal ניאון. DiI נע דרך דיפוזיה לרוחב בקרום השומנים של תאים, כפי שמוצג תיוג ואת מעקב של נוירונים 4 . מבחינה כימית, שתי שרשראות אלקיל של DiI לתת לצבוע את זיקה גבוהה של קרום התא, בעוד שני טבעות מצומדות מ fluorochrome אשר אחראי על פליטת אור אדום אדום כאשר נרגש על ידי מסנני אור פלואורסצנטי ירוק&gt; 4. DiI כבר מנוצל יכולות רבות, כולל תיוג מוצלח של קרום פלזמה וגם אנטרוגרד ו תיוג מדרדר נוירונים 5 , 6 . DiI בעבר נעשה שימוש בפרוטוקולים זלוף תוך הדמיה vasculature של עכברים 7 . Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) הם סלמנדרס שחיים אך ורק אגמים מליחים ליד מקסיקו סיטי, מקסיקו. בעלי חיים אלה הפכו למודל חשוב להבנת תהליכי התחדשות, שכן הם יכולים ליצור מחדש את הגפיים המלאות, הזנב (כולל כבל עצב), חלקים של הלב ואיברים פנימיים אחרים, וחלקים בעין כמבוגרים 8 , 9 . בנוסף, עם היישום האחרון של כלים גנטיים ב axolotls, תובנה חסרת תקדים של מולקולות ותאים המניעים תהליכים אלה כעת אפשרי 8 . את regen מוצלחהקצבה של איבר שלם דורש תהליך רחב של רה-וסקולריזציה, אשר עשוי לשחק תפקיד משמעותי התחדשות מעבר פשוט את הפונקציות המסורתיות של כלי הדם במתן חמצן וחומרים מזינים. הבנת רה-וסקולריזציה בהקשר של התחדשות רקמות היא הכרחית. כלי הדם Axolotl בעבר דמיינו באמצעות הודו דיו, בעוד התוצאות היו מסקרנות, תהליך זה לא היה revisited בעשורים הבאים 10 . ביקשנו להתאים פרוטוקול Diusion זלוף שפותחה לשימוש יונקים כדי לאפשר זלוף מלא ויזואליזציה של כלי הדם axolotl 7 . פרוטוקול זה מתאר את הצעדים שננקטו בהצלחה perfuse ולאחר מכן לדמיין את זרימת axolotl עם טכניקה מכתים DiI. הליך זה יאפשר הדמיה מדויקת של כלי הדם הפטנט ברקמות הומיאוסטיות, כמו גם ברקמות התחדשות, ומספק שיטה חדשה visualisatioN וניתוח של תהליך רה-וסקולריזציה ב axolotl.

<table><tbody><tr><td>משאבה פריסטלטית&nbsp;</td><td>מרשל סיינטיפיק&nbsp;</td>צינורות זלוף <td>RD-RP1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>מעבדת אקסלון & צינורות ואקום</td><td></td><td>436901705 גודל S1A</td></tr><tr><td>27 גרם מחט פרפר</td><td>EXELint מוצרים רפואיים</td><td>26709</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AmericanBio</td><td>7747-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>AmericanBio</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>AmericanBio</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr>מים <td></td><td></td><td></td><td>מזוקקים</td></tr><tr><td>HCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>תרמו-פישר</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>1,1&prime;-Dioctadecyl-3,3,3&prime;,3&prime;- טטרמתיל-אינדוקרבוציאנין פרכלוראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>468495</td><td></td></tr><tr><td>אתנול (100% נפח/נפח)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>קדמות כירורגיות&nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDG0748741</td><td></td></tr><tr>מסגרת <td></td><td></td><td>קצף פוליסטירן</td><td>כל ריבוע קצף פוליסטירן עם מספריים כירורגיות בצורת אקסולוטל&nbsp; חתוך</td></tr><tr><td>מספריים כירורגיות</td><td>Medline</td><td>DYND04025</td><td></td></tr><tr><td>אזמל&nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDS15210</td><td></td></tr><tr><td>תחתון סופג</td><td>Avacare רפואי</td><td>PKUFSx</td><td></td></tr><tr><td>מגבות</td><td></td><td></td><td></td>נייר</tr><tr><td>פיפטה העברה חד פעמית סטנדרטית</td><td>Fisherbrand</td><td>50216954</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מהדק</td><td>Adafruit</td><td>291</td><td></td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונאט</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>טריקאין אבקת</td></tr><tr><td>אקסולוטל</td><td></td><td></td><td></td>למבוגרים</tr><tr><td>MgSO4</td><td>AmericanBio</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>מיכלי</td><td></td><td></td> פלסטיק <td>בגודל משתנה המתאים לאקסולוטל</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica מיקרוסקופ Leica Leica</td><td></td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3 מסנן פלורסנט</td><td>Leica</td><td>M205FA/M165FC</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dii זלוף כשיטת ויזואליזציה של כלי הדם<em&gt; ambystoma מקסיקניום</em

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

טכניקות זלוף שימשו במשך מאות שנים כדי להמחיש את זרימת הרקמות. Axolotl (Ambystoma mexicanum) הוא מין של סלמנדרה שהתגלתה כמודל חיוני ללימודי התחדשות. מעט ידוע על איך מתרחשת רה-וסקולריזציה בהקשר של התחדשות אצל בעלי חיים אלו. כאן אנו מדווחים על שיטה פשוטה להדמיה של כלי הדם ב axolotl באמצעות זלוף של 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI הוא צבע lbophilic carbocyanine כי מוסיף לתוך קרום פלזמה של תאים האנדותל באופן מיידי. זלוף נעשה באמצעות משאבת peristaltic כך DiI מזין את זרימת הדם דרך אבי העורקים. במהלך זלוף, צבע זורם דרך כלי הדם של axolotl ומשלב לתוך bilayer השומנים של תאים אנדותל כלי הדם על קשר. הליך זלוף לוקח בערך שעה אחת עבור axolotl שמונה אינץ &#39;. מיד לאחר זלוף wiDiI, axolotl ניתן דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. ה- DiI פולט אור בטווח כתום אדום כאשר מתרגש עם מסנן פלואורסצנטי ירוק. הליך זה זלוף Di ניתן להשתמש כדי לדמיין את המבנה של כלי הדם של axolotls או להדגים דפוסים של רה-וסקולריזציה ברקמות התחדשות.

<html> עם מכתים DiI, vasculature של axolotl ניתן דמיינו בקלות. כלי דם של בעלי חיים perfused עם צבע lipophilic נראים מיד תחת מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי. איור 1-1-1.5 הוא ייצוג סכמטי של פרוטוקול הזלוף. לאחר זלוף עם צבע ורוד בהיר, axolotl perfused בהצלחה יופיע ורוד. באמצעות מסנן פלואורסצנטי ירוק על מיקרוסקופ confocal אדום פליטה של ​​רשת כלי הדם יופיע. מכתים DiI מתרחשת בכל רקמות הגוף כאשר זלוף מוצלח, כו...

באמצעות lipophilic 1,1-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) מכתים טכניקה, Ambystoma mexicanum יכול לעבור זלוף כלי הדם כדי לאפשר ויזואליזציה קלה של כלי הדם.

DiI זלוף כשיטת ויזואליזציה של כלי הדם<em&gt; Ambystoma מקסיקניום</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדמיות של מערכת כלי הדם של האקסולוטל. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הרפואה הרגנרטיבית בנוגע למורכבות של הרבעיזציה (revascularization) של רקמות המתחדשות באקסולוטל. היתרון המרכזי של טכניקת הדמיית כלי דם זו הוא שניתן לצלם בקלות את כל כלי הדם בבעל החיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי.אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התחדשות הגפה באקסולוטל, ניתן ליישמה גם על רקמות אחרות, כגון הזנב, הלב, העיניים, הזימים או איברים אחרים. לפני פתיחת חזה האקסולוטל, ראשית יש לוודא את רמת הסדציה המתאימה באמצעות צביטה בבוהן. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כירורגית כדי לצבוט את העור לאורך הציר המרכזי של החזה, ממש מתחת לקו הכתפיים.בעזרת סקלפל, בצעו חתך במקום שבו העור מורחק והסירו פיסה מרובעת של עור מעל החזה כדי לחשוף שתי פלטות סחוס. לאחר מכן, פתחו חלון מעל חלל בית החזה וקרעו בזהירות את רקמת החיבור מבלי לחתוך כלי דם ראשיים. השתמשו בפינצטה כדי להרים כל פלטת סחוס בנפרד, וגזרו כל פלטה בעזרת מספריים כירורגיים.תפסו בזהירות את הפריקארד (קרום הלב) החשוף באמצעות הפינצטה. משכו את הרקמה כלפי מעלה ונקבו אותה בעזרת מספריים כירורגיים, בעומק המספיק להסרת הפריקארד מבלי לפגוע בלב. לאחר מכן, הסירו בעדינות את הפריקארד כדי לחשוף את הלב ואת האורטה, כדי לראות בבירור את הלב בנקודה שבה האורטה מסתעפת ממנו, במרחק של כחמישה מילימטרים.כדי לבצע פרפוזיה לאקסולוטל, מקמו מעמד עם מחט פרפר טעונה לצד מסגרת קצף פוליסטירן, כך שזרוע המעמד תאפשר מניפולציה קלה להחדרת המחט. הפעילו משאבה פריסטלטית כדי לשטוף 0.7x PBS דרך צינור המשאבה, והפנו את קצה המחט לכיוון הצד הרוסטרלי. החליקו את הפינצטה מתחת לקשת האורטלית ומשכו אותה מעט כלפי מעלה.לאחר מכן, תמרנו את שילוב המחט והתפסן, כך שהמחט תנוע לאורך האבי העורקים לכיוון ראש בעל החיים, והחדירו את המחט כחמישה מילימטרים לתוך האבי העורקים, תוך השארת הפינצטה מאחורי האבי העורקים לתמיכה. ניתן לאשר השחלה מוצלחת על ידי הגדלה נראית לעין של עליות הלב. קרעו במהירות עליה אחת ואפשרו לדם להתנקז.לאחר מכן, בצעו פרפוזיה לאקסולוטל עם כ-20 עד 30 מיליליטר של PBS. לאחר פרפוזיה מוצלחת, צבע בעל החיים אמור להשתנות מוורוד בהיר ללבן. כאשר כל ה-PBS עבר בפרפוזיה, עצרו את המשאבה הפריסטלטית והעבירו את הקצה החופשי של הפתיל לתוך מבחנה של 15 מיליליטר המכילה תמיסת Dil.הפעילו מחדש את המשאבה, תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות בצינור, ובצעו פרפוזיה לבעל החיים עם כל מלאי ה-Dil המוכון. בפרפוזיה מוצלחת, צבעו של ה-axolotl ישתנה לוורוד בהיר, דבר שיהיה בולט ביותר בזימים. כאשר כל ה-Dil יסתיים, הפסיקו את פעולת המשאבה והכניסו את הקצה החופשי של הצינור לתוך תמיסת 4%paraformaldehyde.לאחר מכן, הפעילו מחדש את המשאבה והזרימו לפחות 10 milliliters של חומר הקיבוע. כאשר כל ה-paraformaldehyde הוזרק, עצרו את המשאבה והסירו את המחט. העבירו את ה-axolotl לצלחת פלסטיק, והניחו את הצלחת על משטח של מיקרוסקופ פלואורסצנטי.לאחר מכן, כאשר האורות כבויים, בחרו מסנן המאפשר עירור של Dil, הפולט אור כתום-אדום. לאחר פרפוזיה מוצלחת, צביעת ה-Dil נראית כאות קבלה אדום בכל רקמות ה-axolotl, כולל הזנב, הגפיים, הזימים והעיניים. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן להשלימה בתוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להיזהר שלא לפצוע את כלי הדם הראשיים או את הלב במהלך פתיחת חלל בית החזה, ולהחדיר את המחט בקו אחד עם האורטה כדי למנוע דקירות שחוצות את הדופן. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון הכנות שלד, כדי להשיב על שאלות נוספות. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביו-רפואי לחקור את מערכת כלי הדם של מינים שונים.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד לבצע פרפוזיה לבבית של an axolotl באמצעות צבע הקרבוןיאנין, Dil. זכרו כי עבודה עם מחטים ופרהפורמלהיד יכולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים, בעת ביצוע הפרוצדורה.

dii-perfusion-as-method-for-vascular-visualization-ambystoma

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקת לנדיס המותאמת מאפשרת מדידה זוגית של המוליכות ההידראולית של מיקרו-כלים בודדים במזנטריה של חולדות רגילות וחולדות מהונדסות גנטית בתנאי בקרה ובדיקה באמצעות טכניקות מיקרו-פרפוזיה. הוא מספק שיטה נוחה להערכת מנגנונים המווסתים את חדירות המיקרו-כלי דם וחילופי כלי דם בתנאים פיזיולוגיים.

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo .

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

כאן אנו מציגים אקוקרדיוגרפיה פרוטוקולים עבור ייבוא תמונות דו-ממדיות ותלת -ממדיים של הלב הפועם של הסלמנדרה אקסולוטל מקסיקני (Ambystoma mexicanum), זן מודל ב לב התחדשות. שיטות אלה מאפשרות האורך הערכה של תפקוד הלב ייתכן ברזולוציה גבוהה.

אקוקרדיוגרפיה מימד ב אקסולוטל מקסיקני (Ambystoma Mexicanum)

המאמר מתאר פרוטוקול מהיר לתיוג כלי דם בדגים teleost על ידי זלוף הלב של dii מדולל בתיקונים, באמצעות מסדר (oryziasלטיפס) כמודל והתמקדות במוח ובבלוטת יותרת השומן.

הוספת תוויות של כלי דם במוח Teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם DiI-fixative

פרוטוקול מתואר על הפרזיה באתרו של גוף העכבר התחתון, כולל שלפוחית השתן, הערמונית, איברי מין, עצם, שרירים ועור כף הרגל.

הקמת מעגל באתרו של איברי הבטן התחתונה וגפיים האחוריות בעכברים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל ייחודי ורלוונטי מבחינה קלינית של מחלת עורקים היקפית המשלב עורק הירך ואלקטרו-קרישת ורידים עם ניהול מעכב סינתאז תחמוצת החנקן כדי לגרום לנמק אחורי בעכברים FVB. זלוף תוך-לבבי DiI משמש לאחר מכן להדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של כלי הדם של משטח כף הרגל.

הדמיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה של כלי הדם של משטח כף הרגל במודל נמק הינדלימב מורין

מוצג כאן פרוטוקול יעיל של זילוח דם מהיר להכנת דגימות רקמה מצפרדעים אפריקאיות בעלות טפרים למחקרי שעתוק ופרוטאומיקה.

זילוח דם מהיר יעיל בקסנופוס

פרוטוקול זה מציג מודל גידול-על-שבב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לביצוע מחקר סרטן אנושי בסיסי ותרגומי בתפוקה גבוהה, קידום בדיקות סקר לתרופות, מידול מחלות וגישות רפואה מותאמת אישית עם תיאור של נהלי העמסה, תחזוקה והערכה.

הקמת מודל פיזיולוגי למיקרו-גידולים וסקולריים אנושיים לחקר הסרטן

פרוטוקול זה מציג שיטה מהירה להדמיית כלי דם תלת מימדית כמותית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור. יעילות השיטה מודגמת באמצעות מערכת עורקי קשת הלוע של מודל עובר האפרוח, עם כוחות המודינמיים המכומתים באמצעות דינמיקת נוזלים חישובית.

הדמיה מהירה ברזולוציה גבוהה של כלי דם של בעלי חיים קטנים למחקרים כמותיים

פרוטוקול זה מכיל תיאור מקיף של גישה שלב אחר שלב למודל עכבר חלון גולגולתי כרוני ותסחיף מיקרווסקולרי מותאם להדמיה מיקרוסקופית דו-פוטונית בתוך ה-vivo באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות.

מודל עכבר של תסחיף מיקרווסקולרי למיקרוסקופיה דו-פוטונית בחיים באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות

למד שיטת צביעת DiI לוויזואליזציה של כלי דם ב-Ambystoma mexicanum באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. טכניקה זו מאפשרת חקר תהליכי רגנרציה ורווסקולריזציה ברקמות שונות.

DiI זלוף כשיטת ויזואליזציה של כלי הדם

גלה סרטונים נוספים