מחטים מותאמים אישית עבור Microinjections במוח מכרסמים
24 בינואר 2018
נתאר כאן עבור microinjection במוח מכרסמים המשתמשת קוורץ מחטים פרוטוקול. מחטים אלה לא לייצר נזק לרקמות לזיהוי ולהבטיח משלוח אמין אפילו באזורים עמוקים. יתר על כן, הם יכולים להיות מותאם לצרכי מחקר מאת עיצובים מותאמים אישית, ניתן להשתמש מחדש.
המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא לשכלל פרוטוקול להזרקה מיקרוסקופית למוח באמצעות מחט קוורץ מותאמת אישית וניתנת לשימוש חוזר, אשר אינה גורמת לנזק רקמתי שניתן לזיהוי ומבטיחה הובלה מהימנה של החומר גם לאזורים עמוקים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי העצבים, כגון הפתופיזיולוגיה של מחלות נוירודגנרטיביות ופסיכיאטריות והשפעות של טיפולים גנטיים ותאיים באמצעות וקטורים ויראליים והשתלת תאים. היתרון העיקרי הוא שמחטים אלו אינן גורמות לנזק רקמתי שניתן לזיהוי, דבר המבטיח הובלה מהימנה לאזורים עמוקים במוח.
הן חסכוניות כיוון שניתן לנקות אותן ולהשתמש בהן שוב. כדי להתחיל בהליך זה, יש לנקות ולסטרליז את קפילרות הקוורץ על ידי השקיהן למשך חמש דקות במים מזוקקים, חמש דקות ב-99% ethanol, ולאחר מכן חמש דקות ב-diethyl ether.
לאחר מכן, השאירו את הקפילריים תחת המנדף למשך שעה אחת לפחות כדי שיתייבשו לחלוטין. בינתיים, הכינו את המחטים הארוכות והדקות באמצעות laser puller. לאחר מכן, הניחו את המחטים בצלחת פטרי שננקתה מראש ב-70% ethanol.
כסו את הצלחת בסרט פלסטיק פראפין. לאחר מכן, חתכו את הנימיים באמצעות המיקרו-דיסקטור. קבעו את המחט בחוזקה על שולחן המיקרוסקופ ומקמו את קצה המחט במרכז מסך המחשב.
בסרגל התפריטים, לחצו על סמל העיפרון והשתמשו בו כדי לסמן את נקודת החיתוך של המחט. בתפריט הפונקציות שבסרגל הצד, בחרו בלשונית המכילה את כפתור Start Cut כדי לאפשר ללייזר לחתוך את הנקודה שסומנה קודם לכן. במידת הצורך, חתכו את החורים הצדדיים על ידי סימונם וחזרה על הליכי החיתוך ללא שינוי מיקום המחט.
לאחר חיתוך המחט, חברו אותה למשאבת ואקום באמצעות צינור פלסטיק. לאחר מכן, הפעילו את המשאבה וקבעו ידנית את קצב הזרימה קדימה ל-3 µL לדקה. לאחר מכן, שאבו את ה-99% ethanol ולאחריו את המים המזוקקים כדי להסיר זיהומים שנוצרו כתוצאה מהחיתוך.
לאחר מכן, שאבו שוב את ה-99% ethanol כדי להקל על הייבוש. לאחר מכן, אחסנו את המחטים בצלחת פטרי מכוסה כראוי עד ליום הניתוח. כדי להשתמש במחטים שוב, בסוף הניסוי, נקו אותן עם חומרי ניקוי מתאימים ו-70% ethanol כדי להסיר את התמיסה שהוזרקה ושיירי רקמה אפשריים.
במידת הצורך, ניתן אפילו להרתיח מחטים אלו בצנצנות זכוכית ייעודיות מלאות במים מזוקקים. בשלב זה, בחרו בתפריט ההגדרות כדי לכייל את המשאבה בהתאם לקוטר לנפח של מזרק המיקרו-הזרקה. קבעו את קצב הזרימה ל-0.3 µL לדקה.
לאחר מכן, מלאו מזרק של 10 milliliter במים סטריליים. השתמשו בו כדי למלא את מזרק המיקרו-הזרקה ואת ערכת חלקי מכלול ההזרקה עבור משאבת המיקרו-הזרקה הידנית. לאחר מכן, חברו את המחט לערכת משאבת המיקרו-הזרקה הידנית.
נתק את המזרק של 10 מיליליטר ממזרק המיקרו-הזרקה תוך כדי לחיצה איטית על הבוכנה, כדי להשאיר טיפה של מים בחלק העליון של מזרק המיקרו-הזרקה. לאחר מכן, הכנס את הבוכנה לתוך מזרק המיקרו-הזרקה. כעת, חבר את מזרק המיקרו-הזרקה למשאבה והגדר את קצב הזרימה ל-0.3 מיקרוליטר לדקה.
לאחר מכן, שנו את קצב הזרימה ל-0.1 microliters per minute והתחילו בהליך הניתוח. כדי לבצע את הניתוח, גלחו את ראשו של בעל החיים ונקו אותו באמצעות מגבון אלכוהול. לאחר מכן, מקמו את החולדה במסגרת הסטריאוטקסיס.
בצעו חתך אורכי מעל הגולגולת באמצעות סקלפל סטרילי. פעלו בעדינות כדי למנוע דימום מוגבר. לאחר מכן, פתחו את קרקפת הראש באמצעות שפכטל שטוח, והניחו סירגיות כירורגיות על פתיתי העור כדי להשאירו פתוח.
הסר בעדינות רבה את הפריאוסטאום (קרום העצם) כדי לחשוף את הברגמה (bregma) ואת אזור הגולגולת שדרכו תוכנס המחט. לאחר מכן, התקן את הזרוע על המסגרת הסטריאוטקסית והזז את קצה המחט אל מעל הברגמה, תוך הקפדה שלא לשבור את קצה המחט. רשום את הקואורדינטות הקדמיות-אחוריות והמדיאליות-לטרליות של הברגמה והזז את המחט לקואורדינטות הרצויות.
לאחר מכן, הורד את המחט עד שקופה כמעט נוגעת בגולגולת, וסמן את נקודת הקידוח לאחר הרמה קלה של הזרוע הסטראאוטקסית. קדח את הגולגולת בנקודה המסומנת, תוך הקפדה לא לפגוע בקרומי המוח ובמוח. לאחר מכן, גזור חתיכה קטנה של סרט פלסטיק פראפיני והנח אותה על הגולגולת.
באמצעות פפטה של 10 µL, צרו טיפה מהתמיסה והניחו אותה על סרט פראפין פלסטי. הפסיקו את פעולת המשאבה, משכו מעט את דוחף המשאבה ויצרו בועת אוויר קטנה בנייר את הנימי על ידי משיכה עדינה של בוכנת מזרק המיקרו-הזרקה. הורידו את קצה המחט עד שייגע בטיפה.
שאבו את הדגימה על ידי משיכה איטית מאוד של בוכנת מזרק המיקרו-הזרקה, תוך הימנעות מיצירת בועות. החזירו את דוחף המשאבה למגע עם הבוכנה והפעילו את המשאבה בקצב זרימה של 0.3 microliters per minute. לאחר מכן, המתינו להיווצרות טיפה לפני המעבר לשלב הבא.
לאחר מכן, הנמיכו את קצב הזרימה ל-0.1 microliters per minute. חרצו את הקשייה (dura) באמצעות מחט בעלת חוד אלכסוני מפלדה אל-חלודה והנמיכו את המחט באיטיות כדי לחדור לרקמת המוח. כאשר תגיעו למיקום הרצוי, רדו 0.1 millimeters נוספים, ואז עצרו את המשאבה.
הגביהו את הזרוע הסטריאוטקסיסטית ב-0.1 millimeters והפעילו שוב את המשאבה בקצב של 0.3 microliters לדקה. לאחר מכן, הפעילו את הטיימר ואת ההזרקה. עקבו אחר תנועת הבועה במהלך ההזרקה.
בסיום, הפסיקו את פעולת המשאבה והמתינו חמש דקות לפני הוצאה איטית של המחט. כאשר מחט הקוורץ הוצאה לחלוטין, הפעילו שוב את המשאבה ובדקו אם נוצרת טיפה בקצה המחט. לאחר מכן, אטמו את הפתח במשטח הגולגולת באמצעות שעוות עצם.
הסר את התפסנים ההמוסטטיים ותפר את הקרקפת. מרח קרם אנטיביוטי באזור שסביב הפצע והחזר את בעל החיים לכלוב הבית. אלו הם חתכים קורונליים בעובי שמונה מיקרומטר של מוחות חולדות בגובה הסטריאטום.
תמונה זו מציגה את הנזקים שנגרמו מהזרקה של 2 µL של ACSF, באמצעות מחט מפלדת אל-חלד בעלת קצה קהה ובגודל 26-gauge. לעומת זאת, בסטריאטום שהוזרק באמצעות מחט קוורץ, לא נראה נזק שניתן לזיהוי. תמונות אלו מציגות את הנזקים שנגרמו על ידי שתי המחטים ברמה של ההיפוקמפוס הדורסלי.
אולם מחט הקוורץ לא גרמה לנזק שניתן לזיהוי. הזרקות מוצלחות עם שתי המחטים הוכחו באמצעות התפזורות של Trypan blue. ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן לבצעה בשלוש שעות, במידה והיא מבוצעת כראוי.
בעקבות נהלים אלו, ניתן לבצע כל פעולה רלוונטית, כגון ניתוחים נוספים, כדי לענות על שאלות שונות כמו השפעות מושראות מתרופות. פיתוח זה סלל את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי העצב לבחון את השפעתם של רעלים ותרופות, ולאחרונה, של מוצרי תרפיה גנטית ותאית במודלים של בעלי חיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד לבצע מיקרו-הזרקות באזורי מוח עמוקים ללא נגעים ניתנים לגילוי, תוך שימוש במחטי קוורץ מותאמות אישית.
אל תשכחו כי שימוש בריאגנטים ו/או פתוגנים שעברו דיסקציה בלייזר עלול להיות מסוכן ביותר. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון נהלי בטיחות בלייזר וציוד מיגון אישי, בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מעודכן להזרקה מיקרוסקופית למוח באמצעות מחטי קוורץ רב-פעמיות ומותאמות אישית. מחטים אלו ממזערות את הנזק לרקמה ומבטיחות הובלה אמינה לאזורים עמוקים במוח, ובכך הן מתאימות למגוון יישומים במדעי המוח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- טכניקות של מיקרו-הזרקה
- מחלות נוירודגנרטיביות
רקע
- מיקרו-הזרקה היא חיונית לחקר תפקודי המוח.
- שיטות מסורתיות עלולות לגרום לנזק לרקמה.
- מחטי קוורץ מציעות פתרון עם השפעה מינימלית.
- עיצובים רב-פעמיים משפרים את היעילות הכלכלית.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול להזרקה מיקרוסקופית (microinjection) בטוח ויעיל.
- סיוע למחקר על מחלות ניוורו-דגנרטיביות ופסיכיאטריות.
- שיפור שיטות להעברה של טיפולים גנטיים ותאיים.
שיטות ששימשו במחקר
- ניקוי ועיקור של קפילרות קוורץ.
- שימוש במים מזוקקים, אתנול ודיאתיל אתר לצורך עיקור.
- מיקרו-הזרקה לאזורי מוח של מכרסמים.
- הערכת נזקי רקמה לאחר ההזרקה.
תוצאות עיקריות
- מחטי קוורץ לא גרמו לנזק רקמתי שניתן לזיהוי.
- הושגה הזרקה אמינה לאזורים עמוקים במוח.
- חסכוני בעלויות הודות לאפשרות שימוש חוזר.
- פוטנציאל לקידום ההבנה של מצבים נוירולוגיים שונים.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את הבטיחות והיעילות של מיקרו-הזרקה למוח.
- עיצובים מותאמים אישית יכולים לתת מענה לצרכי מחקר ספציפיים.
- שיטה זו עשויה להשפיע באופן משמעותי על המחקר במדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
מחטי קוורץ מותאמות אישית להזרקה זעירה (microinjection) למוח של מכרסמים נותנות מענה לאתגר קריטי במדעי העצבים הפרה-קליניים על ידי מתן אפשרות להחדרה מדויקת ומינימלית פולשנית של תרכובות, תאים או טיפולים גנטיים לאזורים עמוקים במוח. חידוש זה מפחית את הנזק לרקמה ומשפר את השחזוריות, ובכך תומך במחקר תרגומי ובתיקוף מטרות (target validation) במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות ופסיכיאטריות. גישה זו מציעה פתרונות ניתנים להרחבה וכלכליים עבור תהליכי מו"פ ארגוניים המתמקדים בתרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מדויקת של מסלולים נוירוביולוגיים באזורי מוח רלוונטיים למחלה.
- מפחית נזק לרקמות המהווה גורם מתערב, ובכך תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף תפקודי של המטרה.
- מאפשר הובלה מהימנה של טיפולים גנטיים, תאיים או של מולקולות קטנות לצורך בדיקת השערות.
- תומך בוודאות חיזויית בבחירת מטרות בשלב מוקדם במערכת העצבים המרכזית (CNS).
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכות מיקרו-הזרקה מתוקשבות וניתנות לשחזור להחדרת תרכובות או תאים in vivo.
- תומך בסטנדרטיזציה של פרמטרי ההזרקה ובהערכה כמותית של דיוק ההחדרה.
- מאפשר הכנה בקנה מידה רחב של מחטים עם מאפיינים הניתנים להתאמה אישית עבור צרכי בדיקה מגוונים.
- משפר את המוכנות לסריקה של מועמדים טיפוליים המכוונים למערכת העצבים המרכזית (CNS).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תואם למודלים של בעלי חיים הרלוונטיים למחלה לצורך מחקרי ביומרקרים טרנסלציונליים.
- מבטיח רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף הפרה-קליני על ידי מזעור ארטיפקטים פרוצדורליים.
- תומך בקידום מותאם-סיכון של תוכניות CNS על ידי הפחתת אי-ודאות ביולוגית בשלבים מאוחרים.
- מאפשר הערכה חסונה של הובלת טיפולים גנטיים ותאיים in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני בפיתוח תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS), ותומכת הן במחקרים מכניסטיים מוקדמים והן בתיקוף תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקות מונחות-השערה של חומרים נוירו-אקטיביים ומודולציה של מסלולים in vivo.
- סריקה: מספק תוצרי מיקרו-הזרקה כמותיים וניתנים לשחזור עבור מחקרים השוואתיים.
- אנליטיקה: מאפשר הערכה של דיוק ההזרקה ושל שלמות הרקמה לאחר ההחדרה.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלב הגילוי לאימות פרה-קליני על ידי מתן אפשרות להחדרה אמינה במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת להתאמה אישית ושימוש חוזר עבור מחקר ופיתוח מתמשכים של ה-CNS.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של נהלי מיקרו-הזרקה ותמיכה בתהליכי עבודה ניתנים להרחבה וכלכליים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ומפחית את הסיכון לנשירה בשלבים מאוחרים בתיקי פיתוח של CNS.
- השפעה על פורטפוליו הנכסים: מאפשר תעדוף של נכסי CNS מותאם סיכונים, בהסתמך על נתוני in vivo חסונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים סטריאוטקסיים ובטכניקות של מיקרו-הזרקה.
- נדרשת גישה למשכי לייזר (laser pullers), מיקרו-דיסקטורים ומשאבות מיקרו-הזרקה מכויילות.
- דורש פרוטוקולים קפדניים של ניקוי ועיקור לצורך שימוש חוזר במחטים.
- ניתן להתאימו למודלים שונים של מכרסמים ולקואורדינטות הזרקה שונות באמצעות כיול מתאים.
- אמצעי בטיחות הם חיוניים בעת טיפול בריאגנטים, פתוגנים או ציוד לייזר.
