זיהוי ליגנדים אסטרוגניים במוצרי טיפוח אישי באמצעות של שמרים אסטרוגן מסך ממוטב עבור המעבדה הוראה לתואר ראשון

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש בסריקת אסטרוגן בשמרים (yeast estrogen screen) כדי לכמת אגוניסטים של קולטן אסטרוגן אנושי שהופקו ממוצרי טיפוח אישיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מרכזיות בתחומי הרעלנות, שיבוש אנדוקריני ואקופיזיולוגיה, מכיוון שהיא מזהה ומכמתה אסטרוגנים סביבתיים במים, במזונות ובמוצרי טיפוח אישיים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו in vitro הם עלותה הנמוכה, נפוצותה הרבה והעובדה שהיא מספקת פלטפורמה מצוינת להוראת מיומנויות מעבדה טכניות.

גילוי אסטרוגנים סביבתיים הוא קריטי כיוון שהם עלולים לשנות את האיתות ההורמונלי, במיוחד במהלך ההתפתחות העוברית ובתקופות של מעבר פיזיולוגי כמו גיל ההתבגרות. החלקים המאתגרים ביותר בשיטה זו הם החישובים וניתוח הנתונים, אותם פשטנו באמצעות פיתוח יישום קל לשימוש. כמו כן, פיפטינג מדויק הוא חיוני.

פרוטוקול זה מתחיל בהכנת ריאגנטים. הכינו מצעי גלוקוז וגלקטוז, בקרות נשאי ethanol 50%, וסטנדרטים של estradiol שישמשו ביום הראשון של הבדיקה, וכן בופר LacZ, dithiothreitol וסודיום קרבונט ליום השני. סטריליזו את מצעי הגלוקוז והגלקטוז באמצעות סינון דרך מסנן של 0.2 micrometer.

ניתן לבחון עד 23 מוצרי טיפוח אישיים שונים (PCPs) ובקרות מיצוי בשלוש חזרות על גבי פלטה אחת של 96 בארות. מוצרי ה-PCPs כוללים סבון, קרם לשיער, שמפו, קרם הגנה מהשמש, איפור, קרם גילוח ותחליב. לצורכי הצילום, דגימות יוכנו משמונה מוצרי PCPs בלבד.

ערבבו גרם אחד מכל דגימה עם 10 milliliters של ethanol אנहाइडר בתוך מבחנה קונית של 15-milliliters. בנוסף, הכינו בקרת מיצוי שלילית המורכבת מ-11 milliliters של ethanol אנहाइडר במבחנה קונית של 15-milliliters. הומוגניזו את תכולת כל מבחנה קונית למשך 30 דקות באמצעות שילוב של ניעור ידני ו-vortexing.

סובב את המבחנות הקוניות במהירות המקסימלית המותרת בצנטריפוגת סלים למשך 10 דקות. העבר את הנוזל העליון (supernatant) מכל מבחנה דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר למבחנה קונית של 50 מיליליטר. לאחר מכן, העבר את התוכן של כל מבחנה של 50 מיליליטר לבקבוק זכוכית לסנצילציה (scintillation vial).

השאירו את המבחנות פתוחות במנדף מאוורר למשך שבוע כדי לאפשר לאתנול להתאדות לחלוטין. הגנו על הדגימות המתייבשות מאור כדי למנוע פירוק של רכיבים רגישים לאור. כאשר הדגימות יבשות, המיסו מחדש כל דגימה ב-1 mL של 50% ethanol ולאחר מכן ערבבו ב-vortex להומוגניזציה.

שני לילות או כ-42 שעות לפני הכנת סריקת האסטרוגן לשמרים או פלטות YES, השתמש בטכניקה סטרילית כדי לבצע תת-תרבית לשמרים על ידי הוספת 0.1 milliliters של כל תרבית שמרים פעילה ל-10 milliliters של מצע גלוקוז שעבר סטריליזציה בסינון בתוך בקבוק ארלנמאייר סטרילי. דגרו בטמפרטורה של 30 °C והמשיכו לדגור את התרביות המקוריות כמאגרי סטוק. יומיים לאחר מכן, ביום הראשון של בדיקת ה-YES, השתמש בטכניקה סטרילית כדי לדלל את תרביות השמרים התלויות ומצע גלקטוז שעבר סטריליזציה בסינון בתוך כלי כימי סטרילי.

אששו את הצפיפות האופטית על ידי פפיטציה של 120 microliters מכל דגימת שמרים בשלוש חזרות, יחד עם שלושה בלאנקים של מצע גלקטוז, אל תוך פלטת פוליסטירן שקופה. השתמשו בספקטרופוטומטר לפלטות כדי לוודא שלתרבית השמרים המדוללת יש צפיפות אופטית נטו של 0.065 פלוס או מינוס 0.005 באורך גל של 610 nanometers. קבעו את ה-OD610 נטו של השמרים על ידי הפחתת ה-OD610 של בלאנקים של מצע גלקטוז.

באמצעות פלטר תחומי (repeating pipetter) עם טיפ של מזרק סטרילי, העבירו את תרחיף השמרים המדולל לבארות של פלטת מיקרו polypropylene סטרילית בעלת 96 בארות, בהתאם למבנה הפלטה זה. במהלך ההעברה, שמרו על תרחיף השמרים במצב סוספנסיה על ידי סיבוב רציף של הכוס או ערבוב באמצעות הפלטר. לבסוף, הוסיפו 120 µL של מצע גלקטוז שעבר סינון סטרילי לבארות H10 עד H12, המסומנות בירוק במבנה הפלטה, כדי שישמשו כביקורת מצע אשר תנטר את הבליעה הנובעת מהמצע עצמו.

הכינו פלטות נפרדות עבור כל שילוב של זן שמרים ומצע קלורימטרי שייבדקו. לאחר מכן, בצעו עקומת סטנדרט בכל פלטה באמצעות דילול סדרתי בהתאם למבנה הפלטה. השתמשו בפיפט בעל ערוץ בודד עם טיפים סטריליים כדי להוסיף 5 µL של סטנדרט estradiol לבארות A1, A2 ו-A3. השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי לערבב את תכולת הבארות על ידי שאיבה ושחרור, ולאחר מכן העבירו 205 µL מבארות A1 עד A3 לבארות B1 עד B3. חזרו על העברת ה-205 µL לאורך שורה G. עם סיום הדילול הסדרתי, השליכו 205 µL מבארות G1 עד G3. בסיום שלב זה, כל בארות הסטנדרט צריכות להכיל 120 µL.

הוסיפו 5 µL של 50% ethanol לכל באר של בקרת רכב (vehicle control) המכילה את תרחיף השמרים, בארות H1, H2 ו-H3, המסומנות בכחול בפריסת הפלטה זו. השלב הבא הוא הוספה של שלשות של 5 µL מדגימות או מבקרי מיצוי שליליים לבארים המכילות את תרחיף השמרים, המסומנות בסגול בפריסת הפלטה. רשמו אילו דגימות או בקרי מיצוי הוכנסו לאילו בארות.

כדי לעקוב אחר הבארים המכילות דגימות ואלו שאינן, התחילו עם קופסת טיפים חדשה והשתמשו בטיפים מאותם מיקומים בקופסה כפי שהם המיקומים של הבארים התואמות בלוחית. ערבבו את תכולת הבארים של הדגימות, בקרת המיצוי ובקרת הנשא באמצעות פיפטינג. התאימו את הנפחים של בארים אלו ל-120 microliters על ידי הסרה של 205 microliters מכל אחת.

אטמו כל פלטה באמצעות סרט דביק נקבובי סטרילי, סמנו אותן והדגירו בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך 17 שעות. לאחר דגירה של 17 שעות, הוציאו את הפלטות מהאינקובטור. במידה ואינן ניתנות לעיבוד מיידי, עטפו אותן בנייר נצמד ושמרו את הפלטות העטופות בקירור בטמפרטורה של four degrees Celsius למשך שישה ימים.

כאשר הפלטות מוכנות לעיבוד, יש להסיר מהן את העטיפה. השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי לערבב את תכולת כל שורה של בארות, ולאחר מכן העבירו 50 µL של תרחיף שמרים מכל בארה לבארה המתאימה בפלטת מיקרו של 96 בארות מפוליסטירן שקוף. סמנו את הפלטה החדשה.

כדי למנוע זיהום צולב בין הבארות, השתמשו בקצות פיפטה חדשים עבור כל בארה, אך אין צורך שהקצות יהיו סטריליים. במנדף כימי, הוסיפו 20 µL של DTT בריכוז 1 M ל-20 mL של LacZ buffer שהופשר והגיע לטמפרטורת החדר, כדי להגיע לריכוז סופי של 1 mM DTT. ערבבו היטב את ה-LacZ buffer.

באמצעות פיפטה רפטיטיבית (repeating pipetter), יש להוסיף 200 microliters של בופר LacZ המכיל DTT ו-ONPG או CPRG לכל בארות פלטת הפוליסטירן, ולמדוד ולתעד מיד את הצפיפות האופטית ב-610 nanometers של כל הבארות באמצעות קורא פלטות. חזור על הפעולה לפי הצורך עבור פלטות נוספות. כסה את הפלטות במכסה והדגר אותן בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך הזמנים המצוינים.

עם סיום הדגירה, הוצא את הפלטות מהאינקובטור. השתמש בפיפטה חוזרת (repeating pipetter) כדי להוסיף 100 microliters של sodium carbonate לכל באר כדי לעצור את תגובת ה-beta-galactosidase. מדוד ורשום את הצפיפות האופטית ב-405 nanometers עבור ONPG או ב-574 nanometers עבור CPRG של כל הבארות באמצעות ספקטרופוטומטר פלטות.

ניתן לבצע חישוב של ערכי LacZ באמצעות אפליקציה אוטומטית הדורשת התקנה של Java. כדי להתחיל, פתחו את האפליקציה האוטומטית של LacZ המתוארת בנספח one. הדביקו את קריאות הצפיפות האופטית ב-405 nanometers עבור ONPG או ב-574 nanometers עבור CPRG של כל הבארות, תוך שימוש בפריסת פלטה זהה לזו המוצגת באיור one.

הזינו את משך זמן האינקובציה והשעות הדרושים לבדיקה כדי שתיווצר צבע, ולחצו על Next. הדביקו את קריאות הצפיפות האופטית ב-610 nanometers עבור כל הבארות. לחצו על Submit כדי להציג את תוצאות ה-LacZ.

ניתן להעתיק את תוצאות ה-LacZ באמצעות פקודות מקלדת ולהדביקן בגיליון אלקטרוני או בקבצים אחרים לפי הצורך. התחילו את הניתוח על ידי פתיחת אפליקציית ניתוח הנתונים המקוונת של בדיקת ה-YES. העלו קובץ נתוני CSV המעוצב כפי שמתואר בלשונית הראשונה.

בצעו דיגיטציה של עקומת הסטנדרט של האסטרדיול בלשונית השנייה והעריכו את פרמטרי הרגרסיה. צפו בתוצאות מודל הרגרסיה בלשונית השלישית, ולאחר מכן מצאו את ערכי ציר ה-x שחושבו באינטרפולציה והמתאימים לערכי ה-LacZ של הדגימות בלשונית הרביעית. לחצו על הלשונית החמישית כדי לראות את ערכי השקילות לאסטרוגן או ערכי ה-EEQ של הדגימות.

לבסוף, יש לנרמל את ערכי ה-EEQ למסה המקורית של הדגימה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. מוצגים כאן דוגמאות לעקומות סטנדרט לאחר דגירה של 17 שעות של שמרים עם 17 beta-estradiol. מהסיבות הנדונות במאמר, CPRG מהווה לעיתים קרובות בחירה טובה יותר של סובסטרט מאשר ONPG.

בדומה לתצפיות קודמות, בדיקות עם שמרים המבטאים ER Beta היו רגישות יותר בסדר גודל אחד לפחות מבדיקות עם שמרים המבטאים ER Alpha. לפיכך, פעילות אסטרוגנית זוהתה לעיתים קרובות יותר בשמרים המבטאים ER Beta. מטרה נוספת של המחקר הייתה לבחון זמני דגירה התואמים את לוח הזמנים של קורס מעבדה לתואר ראשון.

כאשר הוכנסה תקופת קירור של שישה ימים לאחר דגירה של 17 שעות, עקומות הסטנדרט מהלוחיות שהוקררו היו דומות לאלו של לוחות שלא קוררו. השגיאות הסטנדרטיות של הפרמטרים שהוערכו באמצעות מודלים של רגרסיה לוגיסטית בעלי ארבעה פרמטרים היו כולן קטנות יותר עבור לוחות שהוקררו מאשר עבור לוחות שלא קוררו. לפיכך, קירור לוחות למשך שישה ימים מפחית את השגיאה ומשפר את דיוק הערכות ה-EEQ.

לאחר שילמדו את הטכניקה, ניתן להשלימה בשני מפגשים של שלוש עד ארבע שעות כל אחד. בעת ביצוע הפרוצדורה, חשוב לזכור להשתמש בטכניקה סטרילית בכל השלבים המבוצעים לפני תקופת האינקובציה של 17 שעות, לפעול בזהירות ובדיוק בפיפטור, ולפעול לפי תכנית סידור המגש המוצגת באיור 1. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקות in-vivo בבעלי חיים, כדי לחקור מנגנונים נוספים של פעילות אסטרוגנית והשפעות על האורגניזם השלם.

לאחר פיתוחו, הפך סקר האסטרוגן בשמרים (YES) לשיטה מקובלת וזולה למדידת ליגנדים אסטרוגניים בדגימות סביבתיות כגון מזון, רקמות צמחים ומוצרי טיפוח אישי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע מיצויים פשוטים של מוצרי טיפוח אישי, גידול שמרים, הכנת עקומות דילול של סטנדרטים, הרצת בדיקת ה-YES בלוחית 96 בארות וביצוע החישובים הנלווים. זכרו כי עבודה עם estradiol עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות ושימוש בציוד מגן אישי אחר, וכן להבטיח סילוק נאות של החומרים בעת ביצוע הליך זה.