ניתוח של microglia ומונוציטים הנגזרות מקרופאגים ממערכת העצבים המרכזית על ידי cytometry זרימה

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להעריך את הסמנים השונים המתבטאים על ידי תת-אוכלוסיות מקרופאגים בתוך מערכת העצבים המרכזית או CNS. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירו-אימונולוגיה, כגון מקרופאגים דופריים כאשר אנו מנסים לגרום למערכת העצבים המרכזית לעשות סחרחורות, ומהם הפנוטיפים של מערכת העצבים המרכזית במקרופאגים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם בידוד של מספר רב של תת-אוכלוסיית מקרופאגים מטוהרים מאוד, כמו גם קונטציה של סמן תאים תת-אוכלוסיית מקרופאגים.

התחל במספריים עדינים כדי לחתוך את עור הגחון ממש מתחת לתהליך ה-xiphoid כדי לחשוף את חלל בית החזה. בצע חתך בסרעפת, וחתוך את ההיבטים הצדדיים של כלוב הצלעות בכיוון זנב עד רוסטרל כדי לחשוף את הלב. לאחר זיהוי החדר השמאלי והפרוזדור הימני, הכנס קטטר פרפר עם מחט 25 מד לחדר השמאלי.

בצע חתך בפרוזדור הימני והתחל להזרים 20 מיליליטר PBS דרך הצנתר בקצב של עשרה מיליליטר לדקה ברגע שהדם מתחיל לזרום. שפע מוצלח יצוין על ידי הלבנה של הריאות והכבד עם עקירת הדם. לאחר מכן, השתמש במספריים עדינים כדי לנתח את עמוד השדרה.

כריתת שרירי דופן הבטן בצד הגחון של עמוד השדרה, וחיתוך עמוד השדרה בבסיס הזנב כדי להסיר את עמוד השדרה בזמן שהוא נקצר. הכנס מזרק של עשרה מיליליטר של PBS המצויד בקצה פיפטה שונה של 200 מיקרוליטר לצד המותני של עמוד השדרה. לאחר מכן שטוף את חוט השדרה בצד צוואר הרחם.

הסר את העור מעל הגולגולת, והכנס קצה אחד של המספריים בבסיס הגולגולת. חותכים את הגולגולת בעקבות התפר הסגיטלי. לאחר מכן הכניסו מלקחיים קטנים לחתך והסירו בעדינות את החלק העליון של הגולגולת.

נתח את המוח מראש העכבר והסר את נורת הריח והמוח הקטן. לאחר מכן הנח את המוח וחוט השדרה בצינור של נקודה וחמישה מיליליטר המכיל נקודה אחת שתיים שמונה מיליליטר של קוקטייל עיכול. כדי לנתק את התאים, השתמשו במספריים קטנים כדי לחתוך דק את המוח וחוט השדרה לחתיכות של מילימטר מעוקב עד שניים ולהניח את החתיכות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים של פחמן דו חמצני למשך 30 דקות.

בתום הדגירה יש להפסיק את העיכול עם 20 מיקרוליטר של EDTA אפס נקודה חמש טוחנת, ואחריו טריטורציה עדינה עם פיפטה של חמישה מיליליטר. סנן את תרחיף התאים שנוצר דרך מסננת רשת של 70 מיקרון לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר באמצעות הבוכנה של מזרק של עשרה מיליליטר כדי להשרות בעדינות כל רקמת מוח או חוט שדרה שנותרה. שוטפים את המסננת עם 20 מיליליטר של חמישה אחוז FBS ו- PBS.

ולאסוף את התאים המסוננים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. לצורך הפרדת שיפוע צפיפות של התאים, אנו משעים את הגלולה בארבעה מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות של 30 אחוז, והעברנו את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

שכב בעדינות ארבעה מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות של 37 אחוז, ואחריו ארבעה מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות של 70 אחוז מתחת למדיום שיפוע צפיפות של 37 אחוז. העבירו את הצינור לצנטריפוגה על ספסל כדי להפריד בין התאים. תאי המיקרוגליה והמקרופאגים יהיו בממשק של שכבות שיפוע הצפיפות של 70 ו-37 אחוזים.

הצינור ייראה מרובד. לאחר הסרת השכבה העליונה של המיאלין בזהירות, העבירו שלושה עד ארבעה מיליליטר משכבת הבין-פאזה של מקרופאג המיקרוגליה לתוך צינור חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן שטפו את תאי החיסון בשלוש צנטריפוגות ב-15 מיליליטר PBS, והשעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBS לאחר הכביסה האחרונה.

כדי להעריך את ביטוי סמן תת-אוכלוסיית המקרופאגים, העבירו את התאים לצינור ניתוח ציטומטריה של חמישה מיליליטר, ואחריו תוספת של מיקרוליטר אחד של מגיב כתמי תאים מתים הניתן לתיקון. לאחר 30 דקות על קרח, מוגן מאור, שטפו את הדגימות בשני מיליליטר PBS, ותלו מחדש את הגלולה ב-400 מיקרוליטר של מאגר פקס לכל צינור ניתוח ניסיוני. פצל את התאים למספר המתאים של צינורות ניתוח ציטומטריית זרימה של חמישה מיליליטר.

לאחר מכן חסום את קשירת קולטן ה-FC הלא ספציפית עם מיקרוגרם אחד של CD 16 CD 32 קוקטייל נוגדנים חוסם לכל 100 מיקרוליטר תאים למשך 10 עד 15 דקות דגירה על קרח, מוגן מפני אור. לאחר מכן, סמנו את התאים ב-100 מיקרוליטר של הנוגדנים הראשוניים המתאימים, למשך 30 דקות דגירה על קרח, מוגנים מפני אור. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים בשני מיליליטר PBS ארבע פעמים.

לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של הנוגדנים המשניים המתאימים למשך 30 דקות על קרח, מוגנים מאור, ולאחר מכן ארבע שטיפות ב-PBS כפי שהודגם זה עתה. לאחר הכביסה האחרונה, השעו בעדינות את הכדורים ב -100 מיקרוליטר של אחוז אחד פרפורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני אור. לאחר מכן שטפו את התאים ארבע פעמים ב- PBS.

השעו מחדש את הכדורים הסופיים ב-200 מיקרוליטר של PBS טרי, ונתחו את התאים על ידי ציטומטריית זרימה. מיקרוגליה שמקורה במוח ובחוט השדרה ומקרופאגים שמקורם במונוציטים מזוהים על סמך ביטוי CD 11 B ו-CD 45 שלהם. הביטוי של CX3CR1 ו-Tmem119 על ידי תאי מיקרוגליאה בינוניים CD 11 B חיוביים CD 45 מאפשר להבחין בין אוכלוסיית תאים זו לבין מקרופאגים שמקורם במונוציטים גבוהים CD 11 C חיוביים, שאינם מבטאים אף אחד מהסמנים הללו, אך מבטאים CCR2.

לאחר הפרדת שיפוע הצפיפות, 85 עד 95 אחוז מהתאים עדיין ברי קיימא. בהיעדר בידוד שיפוע צפיפות, תת-אוכלוסיות המקרופאגים אינן ניתנות לזיהוי בתרשים פיזור דו-צדדי קדימה, בגלל נוכחותם של תאים שאינם מקרופאגים, ופסולת מיאלין. מכיוון שהאפיטופ המזוהה על ידי הנוגדן נגד Tmem119 הוא תוך-תאי, נדרשת חדירות לתיוג של סמן תאי מיקרוגליה חשוב זה.

שימו לב שחדירות גורמת להתכווצות התאים, עם זאת, מה שגורם לתת-אוכלוסיות המקרופאגים להיראות קטנות יותר על ידי ניתוח פיזור קדימה לעומת פיזור צד. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן שניסיתי את ההליך הזה, חשוב לזכור להגדיר את שיפוע הצפיפות בזהירות רבה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו rt-PCR כמותי כדי לענות על שאלות נוספות לגבי מסלולי איתות תת-אוכלוסיית מקרופאגים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור את ההפעלה של תת-אוכלוסיית מקרופאגים במודל עכברי של מחלות נוירולוגיות. לאחר צפייה בסרטון זה, עליך לבצע בדיקות או לעקוב אחר מסורת זו כתת-אוכלוסיות מקרופאגים על ידי ציטומטריית זרימה.

אל תשכח שעבודה עם פרפורמלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש במכסה מנוע בעת ביצוע הליך זה.