שיטות להפקת endosymbionts מן Whitefly Bemisia Tabaci

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לחלץ אנדוסימביונטים מחרקים זעירים לניסויים נוספים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח באנטומולוגיה ובהשקפת המקרוביולוגיה מכיוון שרוב האנדוסימביונטים אינם ניתנים לתרבית במבחנה. שיטה מראה לבודד כמויות נאותות של חיידקים לניסויים נוספים חשובים מאוד.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לבודד בנוחות אנדוסימביונטים של חיידקי זבוב לבן. ניתן ליישם זאת גם על בידוד של אנדוסימביונטים מחרקים אחרים כגון כנימות, קופסאות צמחים ותריפסים. כדי להתחיל, אסוף זבוב לבן בוגר בודד והומוגניזציה שלו ב -30 מיקרוליטר של מאגר ליזה.

דגרו על ההומוגנאט בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה. ואז 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בעזרת DNA של זבוב לבן, ופריימרים של ציטוכרום אוקסידאז 1 מיטוכונדיאלי, הכינו 25 תגובות PCR של מיקרוליטר באמצעות הריאגנטים הבאים.

לאחר מכן, הפעל את תגובות ה-PCR באמצעות התוכנית המוצגת כאן. לאחר מכן, השתמש בערכת מיצוי ג'ל DNA בהתאם לפרוטוקול המומלץ לניקוי מוצר ה-PCR. לאחר מכן, בצע ניתוח רצף בהתאם לפרוטוקול הטקסט.

כדי להגביר גנים ספציפיים של כל אנדוסימביונט בתוך הזבוב הלבן, בצע PCR על DNA של זבוב לבן. על פי פרוטוקול שפורסם בעבר, הכניסו את הדגימה המוגברת לאלקטרופורזה וריצוף של ג'ל אגרוז כדי לקבוע את מיני החיידקים בתוך הזבוב הלבן ולזהות את הגן הספציפי של כל חיידק. כדי לנתח ולטהר את חיידק הזבוב הלבן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת PBS 1x על שקופית מיקרוסקופ.

לאחר מכן, בחרו נימפות כוכב שלישי או רביעי מעלי כותנה. ולטבול אותם ב-PBS. תחת מיקרוסקופ, השתמש במחטים אנטומולוגיות עדינות כדי לשלוף את החיידקים החוצה מגוף הזבוב הלבן.

היזהר בעת בידוד החיידק מכיוון שהוא קטן ושביר. חותכים בעדינות חור בצד אחד של הנימפה ולוחצים מעט על הצד השני כדי לשחרר את החיידקים. לאחר מכן, הרכיבו מיקרו-מטען של 20 מיקרוליטר על פיפטה של 0.5 עד 10 מיקרוליטר, וחלצו את החיידק הבודד מה-PBS לתוך המיקרו-טוען.

שטפו את החיידק כדי למנוע את הזיהום של רקמות זבוב לבן אחרות על ידי הזרמת החיידק לתוך PBS וחילוצו. חזור על הכביסה שלוש פעמים. מומלץ מאוד לחזור על הכביסה בכדי לחסל כמה שיותר זיהום.

פיפטה מיד את החיידק השטוף לצינור צנטריפוגה המכיל 60 מיקרוליטר PBS. מזרק מסנן את החיידק המורכב דרך קרום פילטר של חמישה מיקרומטר. חזור על הסינון מספר פעמים כדי להעביר היטב את הנוזל המעורב דרך הממברנה.

כדי להגביר את הסינון, הכן את המאגר D2 לשימוש עם הפרוטוקול המומלץ להגברת DNA גנומי מדם או תאים עם שינויים מסוימים. הוסף ישירות 1.5 מיקרוליטר של פילטר לצינור צנטריפוגה ואחריו 1.5 מיקרוליטר של מאגר D2. מערבבים היטב ומדגרים את הדגימה על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן הוסף 1.5 מיקרוליטר של תמיסת עצירה.

מוסיפים 15 מיקרוליטר ממאגר התגובה ומיקרוליטר אחד של DNA פולימראז ומערבבים בעדינות. דגרו את התערובת בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות ולאחר מכן 65 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. בצע PCR ישירות על הסינון המוגבר באמצעות פריימרים ספציפיים המיועדים לחיידקים כדי לאשר את מיני החיידקים.

כמו כן, בצע PCR כדי לאשר אם יש זיהום מהגנום המארח על ידי שימוש בפריימרים לגנים של הזבוב הלבן בטא-אקטין ו-EF1 על פי השיטה שפורסמה בעבר. לבסוף, בצע ריצוף מטא-גנום על פי פרוטוקול הטקסט. באיור זה מוצגים כותנה לגידול זבובים לבנים ומספר שלבי התפתחות של זבובים לבנים.

כולל נימפות בוגרות ונימפות כוכב ראשון, שני ורביעי. ניתוח FISH של האנדוסימביונטים Portiera ו-Hamiltonella בתוך נימפה כוכב רביעית של MEAM1 מוצג כאן. נצפית חפיפה של שני החיידקים ושניהם מוגבלים לבקטריוציטים של הזבוב הלבן.

מוצגות כאן תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של האנדוסימביונט Portiera של הזבוב הלבן, המצביעות על כך ש-Portiera עלולה לאבד את דופן התא שלה. לאחר ריצוף וניקוי נתוני הזיהום עבור מתאמים ושכפולים, נרכש הגנום המלא של הסימביונט המחייב Portiera. התוצאה היא גנום מעגלי של 358, 232 זוגות בסיסים.

בנוסף, הושגה טיוטת גנום של המילטונלה שכללה 138 קונטיגים שהורכבו ל-89 פיגומים המבוססים על יחסי קצה זוגיים. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך 20 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על הדגימות מזיהום החיידקים הסביבתיים.

לאחר הליך זה, ניתן לבצע ניתוחים אחרים כמו רצף RA ובקטריום המסה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו ביטוי גנים אנדוסימביונט ומטבוליזם. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האנטומולוגיה והמיקרוביולוגיה לחקור את תפקודם של אנדוסימביונטים בחרקים או פרוקי רגליים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ סימביונטים מחיידקי חרקים.

אל תשכח שעבודה עם חלק מהריאגנטים עלולה להיות מסוכנת ותמיד יש לנקוט באמצעי הזהירות כמו לבישת כפפות בעת ביצוע הליך זה.