Name: שיטות להפקת endosymbionts מן Whitefly Bemisia Tabaci (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: למד שיטה לבידוד אנדוסימביונטים מזבובי לבן Bemisia tabaci באמצעות חיתוך וסינון. הפרוטוקול מאפשר בידוד חיידקים לריצוף DNA ומחקרי אנטומולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תמיכה כספית במחקר זה ניתנה על ידי לאומי מפתח מחקר ופיתוח התוכנית (2016YFC1200601) ואת הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31390421).

1. Whitefly Rearing ומין מינים זיהוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על מינים לבן על כותנה Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zian-mian 1973) בכלובים בתנאים סטנדרטיים של 27 ± 1 ° C, לחות 70 ± 10% ו 14 שעות אור: 10 שעות משטר כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף לבן יחיד מבוגר ו homogenize ב 30 μL של חיץ תמוגה (10 מ&quot;מ טריס, pH 8.4, 50 מ&quot;מ KCl, 0.45% [wt / vol] Tween-20, 0.2% [wt / vol] ג &#39;לטין, 0.45% [vol / Vol] Nonidet P 40, 60 גרם / מ&quot;ל ​​Proteinase K). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה homogenate ב 65 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות ולאחר מכן 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הערה: זמן דגירה על 65 מעלות צלזיוס ניתן להגדיל אם יש צורך. זמן דגירה על 100 מעלות צלזיוס צריך להיות מבוקר בביקורתית מספיק להשבית Proteinase K ולהימנע נזק DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את התגובה שרשרת פולימראז (PCR) באמצעות DNA לבן (שנרכש בסעיף 1.3) על בסיס אוקטידאז ציטוכרום המיטוכונדריה אני primers. COI-F: 5&#39;-TTGATTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 &#39; COI-R: 5&#39;-TAATATGGAGATTAGTGCATTGGA-3 &#39; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את התגובות PCR בנפח סופי של 25 μL המכיל 1 U של פולימרז DNA Taq , 2.5 מאגר μL 10x, 0.2 מ&quot;מ dNTP, 0.2 מ&quot;מ של כל תחל ו 2 μL של DNA לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתנאים הבאים הליך PCR: denaturation הראשונית 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ואחריו 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות (denaturation), 50 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות (חישול) ו 72 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות (הרחבה) ו עוד 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס להארכה נוספת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המוצר מוגבר PCR באמצעות ערכת ג &#39;ל DNA החילוץ עם פרוטוקול מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף דגימות DNA מטוהרים עם דגימה דנ&quot;א רצף המערכת בעקבות ההוראה של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את sequences באמצעות כלי בסיסי מקומי יישור כלי (BLAST) כדי לזהות את מינים סתומים של זבוב לבן ולמנוע זיהום של speci אחריםEs. </li></ol> 2. זיהוי Endosymbiont לוקליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע PCR על DNA לבן (שנרכש בשלב 1.3) כדי להגביר את הגנים הספציפיים של endosymbiont כל בתוך whitefly (מתכון ה- PCR מתואר בסעיף 1.4, ו PCR נהלים פריימרים המפורטים בטבלה 1 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא המדגם מוגבר על ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose על פי פרוטוקול שפורסם בעבר 20 (1% agarose ג&#39;ל, Tris-אצטט-EDTA כמו חיץ פועל, מתח 5 V / cm) כדי לזהות את הגן הספציפי של כל חיידק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר ורצף כל הלהקה כדי לקבוע את מינים חיידקי בתוך whitefly (ראה סעיפים 1.5-1.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הקרינה באתר הכלאות (FISH) על whiteflies לזהות את המיקום של endosymbionts על פי פרוטוקול שפורסם בעבר 19 . הערה: יש להגדיל את הריכוז של בדיקות פלורסנט במידת הצורך. </li></oL&gt; 3. הילוכים אלקטרונים מיקרוסקופית (TEM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול לתקן whiteflies במאגר פוספט (0.1 M, pH 7.0) המכיל 2.5% [vol / vol] glutaraldehyde עבור 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את דגימות במאגר פוספט (0.1 M, pH 7.0) שלוש פעמים, 15 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול ולתקן את דגימות שוב במאגר פוספט (0.1 M, pH 7.0) המכיל 1% [wt / vol] OsO 4 עבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים את הדגימות על ידי סדרה מדורגת של אתנול (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ו 100%), 15 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לטבול את דגימות לתוך אצטון 100% במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימות בתערובת של אצטון 100% ו 100% שרף spurr (1: 1) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הדגימות לתערובת של אצטון 100% ו 100% שרף Spurr (1: 3) במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לטבול את דגימות 100% שרף spurr (מודגרות על 70 מעלות צלזיוס) במשך יותר מ 9 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף דגימות פרפר באמצעות מיקרולי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם את הסרטים דק במיוחד (שנרכש בסעיף 3.9) על ידי טבילה ב אצטט uranyl מוחלטת עבור 5-10 דקות, ואחריו טבילה ב 50% אלקטרלי ציטראט להוביל עוד 5-10 דקות. הערה: כרכים של ריאגנטים מנוצל בסעיף 3.1-3.10 תלויים הדגימות. ודא דגימות שקועים ריאגנטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב לדגימות במיקרוסקופ אלקטרונים בתדר (15,000X) כדי לקבוע את לוקליזציה, צורה וגודל של חיידקים לשימוש נוסף (ראה סעיף 4.6). </li></ol> 4. Whitefly Bacteriome Dissection וטיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μL של פתרון 1x PBS על שקופית מיקרוסקופ. בחר כמה 3 rd או 4 th נימפות מן העלים כותנה לטבול אותם לתוך הפתרון PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מחטים אנטומולוגיים בסדר תחת stereomicroscope ולמשוך את הבקטריומים מתוך הגוף פרפר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך בעדינות חור בצד אחד של נימפה, ולחץ מעט על השניבצד לתת את הבקטריומים החוצה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר microloader 20 μL (עם לחתוך את קצה מוביל כדי לענות על גודל bacteriome) על פיפטה 0.5-10 μL. לחלץ את החיידק הפרט מתוך הפתרון PBS לתוך microloader. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את bacteriome לחסל את הזיהום של רקמות רקמות אחרות על ידי pipetting את הבקטריום לתוך הפתרון PBS ולחלץ את הבקטריום. חזור שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד פיפטה הבקטריום שטף לתוך צינור צנטריפוגה המכיל 60 μL של פתרון PBS 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק לסנן את bacteriome התאספו באמצעות 5 קרום מסנן מיקרומטר (נקבע על ידי גדלים של חיידקים וגרעין של bacteriocyte ב whitefly). חזור על מספר פעמים כדי להעביר את הנוזל המעורב דרך קרום המסנן ביסודיות. הערה: כדי להשיג תוצאה טובה יותר של הגברה ורצף, להרכיב מעל 100 bacteriomes. רטוב קרום המסנן הראשון באמצעות פתרון 1x PBS כדי להפחית את אובדן החיידקיםמחייב את הממברנה. </li></ol> 5. הגברה של הגנום Endosymbiont <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את תסנין (בעיקר המכיל endosymbionts של פרפר) באמצעות ערכת הגברה DNA על ידי פרוטוקול מומלץ עם שינוי כלשהו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הפרוטוקול המומלץ של הגברה של DNA גנומי מן הדם או תאים ולהכין D2 חיץ לניסוי הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ישירות 1.5 μL של תסנין (ראה סעיף 4.6) לצינור צנטריפוגה, ואחריו μL 1.5 של D2 הצפת ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על הקרח במשך 10 דקות ולהוסיף 1.5 μL של פתרון להפסיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μL של חיץ התגובה 1 μL של פולימראז DNA לערבב בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור את התערובת על 30 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות, ואחריו 3 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע PCR ישירות על סינון מוגבר (לדלל את הדגימות מוגבר במידת הצורך) באמצעות פריימרים ספציפיים המיועדים bacטריה כדי לאשר את מינים חיידקים (ראה סעיף 2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התנהגות PCR כדי לאשר אם יש זיהום של הגנום המארח באמצעות גרגר לבן בטן אקטין ו EF1 primers על פי השיטה שפורסמה בעבר 21 (מתכון ה- PCR מתואר בסעיף 1.4). </li></ol> 6. Endosymbiont Metagenome רצף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא סינון מוגבר ספקטרופוטומטר ו fluorometer (על פי הוראות היצרן) לפני רצף לבדוק את איכות דגימות ואם הדגימות לעמוד בקריטריונים של רצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא המוגבר לרצף הגנום בהתאם להוראות היצרן. </li></ol>

<ol><li>Buchner, P. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jobm.19670070219/abstract">Endosymbiosis of animals with plant microorganisms.</a> J. Basic Microbiol. 7 (2), Interscience. New York. (1967).</li>
<li>Sloan, D. B., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosymbiotic+bacteria+as+a+source+of+carotenoids+in+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Letters%22%5BJournal%5D)">Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies.</a> Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).</li>
<li>Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+pipientis%3A+microbial+manipulator+of+arthropod+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction.</a> Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).</li>
<li>Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1744-7917.2010.01396.x/abstract">Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype.</a> Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).</li>
<li>Hansen, A. K., Degnan, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+expression+of+conserved+small+RNAs+in+small+symbiont+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes.</a> ISME J. 8, 2490-2502 (2014).</li>
<li>Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+evolution+of+heritable+bacterial+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).</li>
<li>Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+endocellular+bacterial+symbiont+of+aphids+Buchnera+sp.+APS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS.</a> Nature. 407, 81-86 (2000).</li>
<li>Nikoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+origin+of+insect-Wolbachia+nutritional+mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Evolutionary origin of insect-Wolbachia nutritional mutualism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (28), 10257-10262 (2014).</li>
<li>Sloan, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+histories+of+horizontal+gene+transfer+facilitated+extreme+reduction+of+endosymbiont+genomes+in+sap-feeding+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects.</a> Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).</li>
<li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+the+rice+pest+brown+planthopper+and+its+endosymbionts+reveal+complex+complementary+contributions+for+host+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation.</a> Genome Biol. 15 (12), 521(2014).</li>
<li>Campbell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+expansion+via+lineage+splitting+and+genomereduction+in+the+cicada+endosymbiont+Hodgkinia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).</li>
<li>Wilson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+insight+into+the+amino+acid+relations+of+the+pea+aphid%2C+Acyrthosiphon+pisum%2C+with+its+symbiotic+bacterium+Buchnera+aphidicola%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola.</a> Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).</li>
<li>Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+conservation+and+functional+constraint+on+intergenic+spacers+in+reduced+genomes+of+the+obligate+symbiont+Buchnera%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera.</a> PLoS Genet. 7 (9), e1002252(2011).</li>
<li>Nakabachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+160-kilobase+genome+of+the+bacterial+endosymbiont+Carsonella%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella.</a> Science. 314 (5797), 267(2006).</li>
<li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bemisia+tabaci%3A+a+statement+of+species+status%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).</li>
<li>Himler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+a+bacterial+symbiont+in+an+invasive+whitefly+is+driven+by+fitness+benefits+and+female+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias.</a> Science. 332 (6026), 254-256 (2011).</li>
<li>Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+secondary+endosymbionts+among+different+putative+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).</li>
<li>Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+newly+discovered+symbiont+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).</li>
<li>Kliot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridizations+%28FISH%29+for+the+localization+of+viruses+and+endosymbiotic+bacteria+in+plant+and+insect+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues.</a> J. Vis. Exp. (84), e51030(2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Rao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+reduction+and+potential+metabolic+complementation+of+the+dual+endosymbionts+in+the+whitefly+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci.</a> BMC Genomics. 16 (1), 226(2015).</li>
<li>Thao, L. L., Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+relationships+of+primary+prokaryotic+endosymbionts+of+whiteflies+and+their+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).</li>
<li>Zhu, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+and+comparison+of+the+Rickettsia+genomes+from+the+whitefly+Bemisia+tabaci+Middle+East+Asia+Minor+I%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I.</a> Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).</li>
<li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+localization+of+a+Rickettsia+sp.+in+Bemisia+tabaci+%28HomopteraAleyrodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae).</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).</li>
<li>Zhang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+temporal+changes+of+primary+and+secondary+bacterial+symbionts+and+whitefly+host+fitness+following+antibiotic+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments.</a> Sci. Rep. 5, 15898(2015).</li>
<li>Shan, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+changes+of+symbiont+density+and+host+fitness+after+rifampicin+treatment+in+a+whitefly+of+the+Bemisia+tabaci+species+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex.</a> Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).</li>
<li>Zchori-Fein, E., Brown, J. K. <a target="_blank" href="http://www.bioone.org/doi/abs/10.1603/0013-8746(2002)095%5B0711:DOPAWB%5D2.0.CO%3B2">Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).</li>
<li>Thao, M. L., Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+relationships+of+primary+prokaryotic+endosymbionts+of+whiteflies+and+their+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).</li>
<li>Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+the+bacterial+symbiont+Cardinium+in+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods.</a> Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).</li>
<li>O'Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((116S+rRNA+phylogenetic+analysis+of+the+bacterial+endosymbionts+associated+with+cytoplasmic+incompatibility+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).</li>
<li>Nirgianaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+infections+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).</li>
<li>Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chlamydiae+in+whiteflies+and+scale+insects%3A+endosymbionts+%27Candidatus+Fritschea+bemisiae%27+strain+Falk+and+%27Candidatus+Fritschea+eriococci%27+strain+Elm%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Syst.+Evol.+Micr%22%5BJournal%5D)">Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts 'Candidatus Fritschea bemisiae' strain Falk and 'Candidatus Fritschea eriococci' strain Elm.</a> Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מכיוון שלא ניתן לגדל את האנדוסימביונטים בתוך זבובים לבנים במבחנה, דיסקציה והרכבה של בקטריוציטים היא דרך יעילה להשיג מספיק חומר גנטי של אנדוסימביונטים. לפני הנתיחה, יש לאשר במפורש את מיני הזבוב הלבן והאנדוסימביונטים המעורבים. הזבוב הלבן B. tabaci הוא קומפלקס מינים עם יותר מ-35 מינים שאינם ניתנים להבחנה מורפולוגית ומינים קריפטיים שונים עשויים להכיל אנדוסימביונטים שונים. Portiera מוחזק באופן אחיד כסימביונט מחייב22, וסימביונטים משניים משתנים בין המינים, אפילו הזבוב הלבן<sup ...

חיידקים המרכיבים מערכת יחסים סימביוטית אינטימית עם המארחים היחסיים נפוצים אצל פרוקי רגליים. את endosymbionts הוכחו כדי להשפיע על היבטים של המארחים, כגון מטבוליזם תזונה, רבייה, תגובות ללחץ סביבתי 2 , 3 , 4 וכו &#39; , כמעט בכל שלב התפתחותי 5 . עם זאת, המנגנון העומד בבסיס הארגונים עדיין אינו ידוע. גנומיקה היא בעלת חשיבות עליונה כאשר לומדים את הפונקציות הפוטנציאליות ואת תפקידים של חיידקים. חלק מהמידע הבסיסי, כלומר המעמד הטקסונומי, הגנים הפונקציונליים, מסלולי חילוף החומרים, מערכות ההפרשה, ניתן להסיק מרצפי הגנום, אשר שופכים אורות על התפקידים הפוטנציאליים של סימביונטות בסימביוזה. עם התפתחות של רצף תפוקה גבוהה, מספר עצום של גנומים חיידקים כבר רצף wIth פונקציות מגוונות גילה 6 . Endosymbionts הם בעלי חשיבות חיונית ב hemipterans, כגון כנימות 7 , פשפשים 8 , פסיילים 9 , Planthoppers חום 10 ו cicadas 11 . לדוגמה, בוכנרה ב כנימות, כמו סימביונט חובה, הוכח להיות מעורב חומצות אמינו חיוניות biosynthesis, יחד עם הגנים של הגנום aphid 12 . יתר על כן, תקנה תעתיק של Buchnera נחשף גם 13 . בפסילים, קרסונלה הוא רצף מדורגת הגנום החיידקי הקטן ביותר שנמצא אי פעם 14 . כל אלה סימני ההיכר של endosymbionts מבוססים ו להסיק את רצפי הגנום. בגלל אלה endosymbionts לא יכול להיות מתורבת במבחנה , מספר גישות הוחלו לבודד חיידקים נאותים עבור seqהעלאה. ב כנימות, endosymbionts מופקים באמצעות צנטריפוגה וסינון, ונתונה ניתוח גנומי נוסף transcriptomic 5 . ב planthoppers חום, endosymbionts הם רצף יחד עם גנום חרק כולו 10 . Whitefly B. Tabaci הוא קומפלקס מינים המכיל יותר מ -35 מינים שאינם ניתנים לזיהוי מבחינה מורפולוגית (מינים סתומים), בהם שני מינים פולשניים פלשו לכל רחבי העולם וגרמו לפגיעה עצומה בייצור החקלאי. של הערה, endosymbionts בתוך מינים tabaci B. הראו חשיבות בפיתוח מזיקים 16 . עד כה, שמונה endosymbionts זוהו ב whitefly, כולל symbiont חובה, Candidatus Portiera alerodididum, ושבע סימביונטות משניות המילטונלה , Rickettsia , ארסנופונוס , קרדיניום , &lt;<html> Em&gt; וולבכיה, פריטשה והמיפטריפילוס הגדירו 17 , 18 . שלא כמו ההמיפטרנים שתוארו קודם לכן, הטפטף הלבן הוא חרק זעיר באורך של 1 מ&quot;מ בלבד. רוב endosymbionts מוגבלים bacteriocytes 19 (תאים מיוחדים המכילים symbionts, אשר טופס נוסף bacteriome ב B. tabaci ). בנוסף, אלה endosymbionts לא יכול להיות מתורבת במבחנה . הדרך היחידה להשיג endosymbionts מ B. tabaci היא לנתח את bacteriome החוצה. עם זאת, יש קושי של דיסקציה. ראשית, החיידק השברירי תמיד מקשר עם רקמות אחרות של הפרפר, שקשה להפריד ביניהם. שנית, הגודל הזעיר של הפרפר מגביל את הבידוד של בקטריום מספיק. שלישית, endosymbionts מקבץ בבקטריום, מה שהופך אותו מסובך מאוד לרכוש מינים בודדים של חיידק. התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; כאן, אנו מדווחים פרוטוקול פשוט וזול לבודד endosymbionts whitefly עבור רצף metagenome הבאים. באמצעות דיסקציה, טיהור והגברה, ניתן להשיג DNA מתאים ל- endosymbiont וניתן לאשר את מינים של חיידקים. פרוטוקול המתואר ניתן להשתמש באופן דומה אחרים פרוקי רגליים.

<table><tbody><tr><td>Taq DNA פולימראז</td><td>Takara</td><td>R001A</td><td>כולל rTaq, 10&times; ערכת מיצוי DNA ג'ל מאגר ו-dNTP</td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>מערכת ריצוף דגימות DNA</td><td>ABI</td><td>ABI-3730XL</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים שידור</td><td>היטאצ'י</td><td>H-7650 TEM</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; L microloader</td><td>Eppendorf</td><td>F2771951</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מסנן</td><td>Millipore</td><td>SX0001300</td><td></td></tr><tr><td>מסנן קרום</td><td>Millipore</td><td>SMWP001300</td><td>5.0 &mu; m SMWP</td></tr><tr><td>REPLI-g UltraFast Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>150033</td><td>ערכת תימור DNA</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>קיוביט פלואורומטר</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>רצף גנום</td><td>Illumina</td><td>Hiseq 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטות להפקת endosymbionts מן whitefly<em&gt; bemisia tabaci</em

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

חיידקים בקטריאליים יוצרים קשר אינטימי עם המארחים שלהם ומעניקים יתרונות למארח ברוב המקרים. מידע גנומי הוא קריטי ללמוד את הפונקציות ואת האבולוציה של חיידקים חיידקים המארח שלהם. כמו רוב symbionts לא יכול להיות מתורבת במבחנה , שיטות לבודד כמות נאותה של חיידקים עבור רצף הגנום חשובים מאוד. ב bemisia bamisia tabaci , מספר endosymbionts זוהו ו צפויים להיות בעל חשיבות בפיתוח ורבייה של מזיקים דרך גישות רבות. עם זאת, המנגנון המסייע לאסוציאציות נותר בלתי מוכר במידה רבה. המכשול נובע באופן חלקי מהעובדה כי endosymbionts ב whitefly, בעיקר מאופק בבקטריוציטים, קשה להפריד בין התאים המארח. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול צעד אחר צעד לזיהוי, מיצוי וטיהור של endosymbionts מ whitefly B. tabaci בעיקר על ידי dissectiב ו סינון. דגימות Endosymbiont שהוכנו על ידי שיטה זו, אם כי עדיין תערובת של מינים שונים endosymbiont, מתאימים רצף הגנום הבאים וניתוח של תפקידים אפשריים של endosymbionts ב Tabaci. שיטה זו עשויה לשמש גם לבידוד endosymbionts מ חרקים אחרים.

המזרח התיכון אסיה 1 מינור 1 (MEAM1) מינים של B. Tabaci מורכבים נלקח כדוגמה כאן לתיאור. כותנה לגידול whiteflies וכמה שלבים התפתחותיים של whiteflies מוצגים באיור 1 כולל צמח כותנה, זבוב לבן ו 1 st, 2 nd ו 4 n נימפות ניר של whitefly (3 rd instar נימפה נראה דומה נימפה 4 אינסטאר ). זה היה ברור כי 4 נימפה instar גדול יותר 1 ו 2 נימפות אינסטאר השני ( איו...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד endosymbionts מ tabaci בימייה פרפר באמצעות נתיחה וסינון. לאחר הגברה, דגימות DNA מתאימים לרצף הבאים ולימוד של הדדיות בין endosymbionts ו whitefly.

שיטות להפקת endosymbionts מן Whitefly<em&gt; Bemisia Tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להפיק אנדוסימביונטים מחרקים זעירים לצורך ניסויים נוספים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנקודות מבט של אנטומולוגיה ומקרוביולוגיה, מכיוון שרוב האנדוסימביונטים אינם ניתנים לתרבית in vitro. שיטות המאפשרות לבודד כמויות מספיקות של חיידקים לצורך ניסויים המשכיים הן חשובות מאוד.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לבודד בנוחות אנדוסימביונטים חיידקיים של זבובים לבנים. ניתן ליישם זאת גם לצורך בידוד של אנדוסימביונטים מחרקים אחרים, כגון כנימות, קפיצי צמחים ותריפסים. לתחילת הפעולה, אספו פרט בוגר אחד של זבוב לבן והומוגניזרו אותו ב-30 µL של תמיסת ליזיס.דגרו את ההומוגנאט בטמפרטורה של 65 °C למשך שעה אחת, ולאחר מכן ב-100 °C למשך 10 דקות. בעזרת DNA של זבוב לבן ופריימרים עבור mitochondrial cytochrome oxidase 1, הכינו תגובות PCR בנפח של 25 µL באמצעות הרכיבים הבאים.לאחר מכן, הרצו את תגובות ה-PCR באמצעות התוכנית המוצגת כאן. בשלב הבא, השתמשו בערכה להפקת DNA מג'ל בהתאם לפרוטוקול המומלץ כדי לנקות את תוצר ה-PCR. לאחר מכן, בצעו אנליזת רצף בהתאם לפרוטוקול הכתוב.כדי להגביר גנים ספציפיים של כל אנדוסימביונט בתוך הכנימה הלבנה, בצעו PCR על DNA של הכנימה הלבנה. בהתאם לפרוטוקול שפורסם בעבר, העבירו את הדגימה המוגברת לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ולריצוף כדי לקבוע את מיני החיידקים בתוך הכנימה הלבנה ולזהות את הגן הספציפי של כל חיידק. כדי לנתח ולטהר את הבקטריאום של הכנימה הלבנה, הוסיפו 100 µL של תמיסת 1x PBS על עלית מיקרוסקופ.לאחר מכן, אספו נימפות בגיל השלטה השלישי או הרביעי מעלי כותנה. טבלו אותן ב-PBS. תחת מיקרוסקופ, השתמשו במחטים אנטומולוגיות עדינות כדי לשלוף את הבקטריומים מגוף הכנימה הלבנה.יש לנהוג בזהירות בעת בידוד הבקטריאום (bacteriome) מכיוון שהוא קטן ושביר. חתכו בעדינות חור בצד אחד של הנימפה ולחצו קלות על הצד השני כדי לשחרר את הבקטריאומים. לאחר מכן, התקינו מיקרו-לוודר (microloader) של 20 microliter על פיפט של 0.5 to 10 microliter, ושאבו את הבקטריאום הבודד מתוך ה-PBS אל תוך המיקרו-לוודר.שטפו את הבקטריומה כדי להסיר זיהומים מרקמות אחרות של הקישואן הלבן על ידי העברתו בפיפט לתוך PBS והוצאתו. חזרו על השטיפה שלוש פעמים. חזרה על השטיפה מומלצת מאוד כדי להסיר כמה שיותר זיהומים.העבירו מיד בפיפט את הבקטריאום השטוף למבחנת צנטריפוגה המכילה 60 µL של PBS. סננו את הבקטריאום המורכב באמצעות סינון במזרק דרך ממבנה סינון של 5 µm. חזרו על הסינון מספר פעמים כדי להעביר באופן יסודי את הנוזל המעורב דרך הממברנה.כדי להגביר את התסנין, הכין באפר D2 לשימוש עם הפרוטוקול המומלץ להגברה של DNA גנומי מדם או מתאים עם מספר שינויים. הוסף ישירות 1.5 µL של תסנין לשפופרת צנטריפוגה, ולאחר מכן 1.5 µL של באפר D2. ערבב היטב והדגר את הדגימה על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסף 1.5 µL של תמיסת עצירה.הוסיפו 15 µL של באפר התגובה ו-1 µL של DNA polymerase וערבבו בעדינות. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 30 °C למשך 16 שעות, ולאחר מכן בטמפרטורה של 65 °C למשך שלוש דקות. בצעו PCR ישירות על התסנין המוגבר באמצעות פריימרים ספציפיים שתוכננו עבור חיידקים כדי לאשר את מין החיידק.בצעו גם PCR כדי לאשר אם קיימת זיהום מהגנום של המארח, באמצעות פריימרים לגנים beta-actin ו-EF1 של הזיקית הלבנה, בהתאם לשיטה שפורסמה בעבר. לבסוף, בצעו ריצוף מטגנומי בהתאם לפרוטוקול הכתוב. באיור זה מוצגים כותנה לגידול זיקיות לבנות ומספר שלבי התפתחות של הזיקיות הלבנות.כולל בוגר ונימפות בשלבי גיל ראשון, שני ורביעי. כאן מוצג ניתוח FISH של האנדו-סימביונטים Portiera ו-Hamiltonella בתוך נימפה בשלב גיל רביעי של MEAM1. נצפית חפיפה בין שני סוגי החיידקים ושניהם מוגבלים לבקטריוציטים של הקישואן הלבן.מוצגות כאן תמונות של מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) של האנדוסימביונט Portiera מהזבוב הלבן, המצביעות על כך ש-Portiera עשוי לאבד את דופן התא שלו. לאחר ריצוף וניקוי של נתוני הזיהום מאדפטורים וכפילויות, התקבל הגנום המלא של הסימביונט המחייב Portiera. התוצאה היא גנום מעגלי של 358,232 base pairs.בנוסף, התקבלה טיוטה של הגנום של Hamiltonella שכללה 138 קונטיגים (contigs) שרוכבו ל-89 סקאפולים (scaffolds) על בסיס קשרי קצוות צמדים (paired end relationships). ברגע ששולטים בטכניקה זו, ניתן לבצע אותה תוך 20 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להגן על הדגימות מפני זיהום של חיידקים סביבתיים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניתוחים נוספים כגון ריצוף RA והבקטריאום הכולל (mass bacteriome) על מנת לענות על שאלות נוספות כמו ביטוי גנים ומטבוליזם של אנדוסימביונטים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי האנטומולוגיה והמיקרוביולוגיה לחקור את תפקודם של אנדוסימביונטים בחרקים או בבעלי מפרקים. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לבצע מיצוי של סימביונטים מבקטריאומים של חרקים.יש לזכור כי עבודה עם חלק מהריאגנטים עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

methods-for-extraction-endosymbionts-from-whitefly-bemisia

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טפיל (טפילים) צרעות מהווים שיעור גדול של אויבים טבעיים של חרקים רבים,...

מבוא של צרעות טפיליות<em&gt; תסיסנית</em&gt; ואת התגובה החיסונית Antiparasite

שיפור ההבנה שלנו ואת היכולת שלנו לנהל רבים של הווירוסים המועברים בצמחי חרקים מחייב שימוש בווקטור. שידור חרקים של וירוסי צמחים הוא אינטראקציה tritrophic, ובתור שכזה דורש מניפולציה של חרקים, וירוסים, וצמחים. וקטורים חייבים להיות שגדלו במספרים גדולים ומניפולציות באופן שעל מנת להבטיח שיעור גבוה של העברת צמחים לבדיקה. את היסודות של גידול וטיפול...

וירוסי צמח באמצעות העברת Whiteflies

אנו מתארים כאן הקרינה פשוטה בשיטת הכלאה באתר (FISH) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים ברקמות חרקים וצמחים. פרוטוקול זה יכול להתארך להדמיה של ה-mRNA בהר שלם וחתכים מיקרוסקופיים.

פלואורסצנציה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאות (דגים) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים Endosymbiotic בצמח ורקמות חרקים

לוחות תמותה לאפשר כימות של מקורות ושיעורי התמותה בקרב אוכלוסיות החרקים ולתרום להבנת, חיזוי, מניפולציה הדינמיקה באוכלוסייה של agroecosystems. שיטות ביצוע וניתוח טבלאות עוקבה מבוסס החיים בשדה של חרק עם חיים לא בוגר sessile שלבים מוצגים.

מתודולוגיית פיתוח טבלאות החיים עבור חרקים Sessile בשימוש השדה כנימת עש הטבק, כנימת עש הטבק, כותנה כמו מערכת מודל

Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

הנייר הזה מדווח הפרוטוקול עבור וזמינותו זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק מבוסס על טכנולוגיית בתיווך לופ הגברה איזותרמי (מנורה). הפרוטוקול דורש הכשרה מינימלית מעבדה, לכן, ניתן ליישם באתר בנקודות של ערך היבוא צמח כגון הקנתה ושדות תעופה.

בתיווך לולאה Assay איזותרמי הגברה (מנורה), עבור זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק

אנו מציגים טכניקה פשוטה cytogenetic באמצעות 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי לקבוע את שיעור ההפרייה יחס העיקרי של המזיק פולשני haplodiploid כנימת עש הטבק.

קביעת שיעור הפריה הביצית של כנימת עש הטבק בטכניקה Cytogenetic

אנו מתארים שיטת ה-PCR הכמותית וכמותית ללוקליזציה וכימות של וירוסים ברקמות החרקים. ניתן להשתמש בפרוטוקול האימונוללונציה כדי להתאים חלבונים וקטוריים ומוקטורים. הפרוטוקול PCR כמותי ניתן להאריך כדי לכמת וירוסים בגופים שלמים כנימה וצמחים נגועים בווירוס.

לוקליזציה וקוונפיקציה של וירוסים באגאוטיות ברקמות Whitefly על ידי Immunofluorescence ו-PCR כמותי

כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים: ראשית להפצה, חילוץ, טיהור וכימות כמויות גדולות של חלקיקי נגיף שאינם עטופים בדבורי דבש, כולל שיטה להסרת גלמי דבורת הדבש ושנית לבדיקת ההשפעות של זיהום נגיפי באמצעות בדיקה ביולוגית של כלובים בתפוקה גבוהה הניתנת לחזרה גבוהה.

הכנת אינוקולום מועשר בנגיף לזיהום אוראלי של דבורי דבש (Apis mellifera)

ארבע שיטות שימשו לאיתור וולבצ'יה תוך-תאית, אשר השלימו זו את זו ושיפרו את דיוק הזיהוי של זיהום וולבצ'יה של Aa23 שמקורו ב-Aedes albopictus ו-Aa23-T שנרפאו מזיהום וולבצ'יה מקומי באמצעות אנטיביוטיקה.

זיהוי זן וולבצ'יה wAlbB ב Aedes albopictus קווי תאים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת ארס מ Trichogramma dendrolimi באמצעות מארח מלאכותי שנוצר עם סרט פוליאתילן ותמיסת חומצות אמינו.

הפקת ארס מהצרעה הטפילית Trichogramma dendrolimi באמצעות פונדקאי מלאכותי

למד שיטה לבידוד אנדוסימביונטים מזבובי לבן Bemisia tabaci באמצעות חיתוך וסינון. הפרוטוקול מאפשר בידוד חיידקים לריצוף DNA ומחקרי אנטומולוגיה.

שיטות להפקת endosymbionts מן Whitefly

גלה סרטונים נוספים