דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות אתרי אינטגרציה של וקטור רטרו-ויראלי בגנום המארח ולכמת את השכיחות היחסית של אוכלוסיות תאים משובטים שכל אחת מהן חולקת את אותו אתר אינטגרציה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בטיפול גנטי רטרו-ויראלי, כגון איזה חלק של וקטור הגנום המארח השתלב, כיצד תא מהונדס גנטית יתאכלס מחדש לאחר ההשתלה, וכיצד הם שונים מבחינה תפקודית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח רצפי אתרי רטרו-אינטגרציה בדיוק ורגישות גבוהים יותר על ידי ריצוף צומתי DNA של מארח וקטורי במעלה הזרם ובמורד הזרם בו זמנית.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי בטיחותם של וקטורים ותאים מהונדסים גנטית במחקרי ריפוי גנטי, ניתן ליישם אותה גם במחקרי ביולוגיה בסיסיים אחרים כדי לחקור התנהגות תאים בודדים in vivo. השלב הראשון בהליך זה הוא קביעת ריכוז ה-DNA ויחס הספיגה ב-260 ו-280 ננומטר של ה-DNA הגנומי שיש לנתח. לאחר מכן, יש לדלל מיקרוגרם אחד עד שניים של ה-DNA הגנומי של הדגימה לנפח סופי של 170 מיקרוליטר של תמיסת DNA גנומית באמצעות מים נטולי נוקלאז.

הכן תגובת PCR של 200 מיקרוליטר על ידי ערבוב הדברים הבאים בצינור מיקרוצנטריפוגה. 2.5 מיקרוליטר כל אחד של פריימרים ביוטין ספציפיים ל-HIV-1, או סה"כ 10 מיקרוליטר לארבעה פריימרים ספציפיים ל-lentivirus, 20 מיקרוליטר של מאגר DNA פולימראז יציב בחום פי 10, ארבעה מיקרוליטרים של 10 מילי-מולרי dNTPs, שלושה מיקרוליטרים של DNA פולימראז יציב בחום ו-163 מיקרוליטר של DNA גנומי. חלקו את התמיסה באופן שווה לארבעה צינורות PCR ובצעו מחזור הארכה יחיד בתנאי הבא.

94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 56 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו-4 מעלות צלזיוס לאחסון. אסוף את כל ארבע תגובות ה-PCR לצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר. עקוב אחר נוהל היצרן של ערכת טיהור PCR, והסיר עם 50 מיקרוליטר של מאגר פליטה.

התכוננו לעיכול של 100 מיקרוליטר על ידי הוספת הדברים הבאים לצינור מיקרוצנטריפוגה. 50 מיקרוליטר DNA, 10 מיקרוליטר של מאגר 10X A, שני מיקרוליטר של אנזים RSAI ו-38 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באופניים תרמיים למשך שעה.

לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של אנזים CviQI לתגובה ודגירה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כאשר עיכול ה-RSAI וה-CviQI הושלם, המשך מיד עם סיום קהה. הכינו תערובת של 4.5 מיקרוליטר המכילה 2.5 מיקרוליטר של DNA פולימראז I, שבר גדול ו-2 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי dNTPs.

מעבירים 1 מיקרוליטר מהתערובת לדגימת ה-DNA. הנפח הכולל יהיה 102 מיקרוליטר. מערבבים היטב על ידי מערבולת ודוגרים בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך שעה.

המשך מיד עם קשירת חרוזי סטרפטווידין בסיום הדגירה. הכן את חרוזי הסטרפטווידין על ידי מערבולת קצרה של תמיסת החרוזים והעברת 50 מיקרוליטר לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של שני מיליליטר. הסר את הסופרנטנט בעזרת מעמד מגנטי ושטוף את השעועית עם 200 מיקרוליטר תמיסת קשירה.

השעו מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של תמיסת קשירה והניחו את הצינור הרחק מהמעמד המגנטי. העבירו 100 מיקרוליטר מה-DNA של הדגימה ל-100 מיקרוליטר של תמיסת חרוזים מרחפת וערבבו בזהירות על ידי פיפטינג כדי למנוע קצף של התמיסה. דגרו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות על גלגל מסתובב.

השתמש במעמד המגנטי כדי ללכוד את החרוזים ולהשליך את הסופרנטנט. שטפו את החרוזים פעמיים ב -400 מיקרוליטר של תמיסת כביסה ופעמיים ב -400 מיקרוליטר של מאגר ליגאז 1X T4 DNA. השעו מחדש את החרוזים ב-200 מיקרוליטר של מאגר ליגאז 1X T4 DNA והניחו אותו הרחק מהמעמד המגנטי.

יש לבצע קשירת לינקר מיד לאחר קשירת חרוזי הסטרפטווידין. הכן תמיסת תגובת קשירה של 400 מיקרוליטר על ידי ערבוב הדברים הבאים בצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר. 0.5 מיקרוליטר של מקשר ה-DNA, 10 מיקרוליטר של 10X T4 DNA ligase buffer, 20 מיקרוליטר של 5X T4 DNA ligase buffer, 5 מיקרוליטר של T4 DNA ligase, 164.5 מיקרוליטר של מים ללא נוקלאז ו-200 מיקרוליטר של החרוזים התלויים.

הנח את צינור התגובה על גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות. שטפו את החרוזים פעמיים עם תמיסת הכביסה, ופעמיים עם מאגר DNA פולימראז עמיד בחום פי 1. השעו מחדש את החרוזים ב-50 מיקרוליטר של מאגר PCR DNA פולימראז יציב בחום 1X, והניחו אותו הרחק מהמעמד המגנטי.

כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תגובת PCR של 200 מיקרוליטר על ידי הוספת הדברים הבאים לחרוזים התלויים. 10 מיקרוליטר של פריימר אחד של 1 ליטר, 10 מיקרוליטר של פריימר 1R, 20 מיקרוליטר של פריימר Link1, 10 מיקרוליטר של מאגר DNA פולימראז 10X יציב בחום, ארבעה מיקרוליטרים של 10 dNTPs מילימולריים, שמונה מיקרוליטר של DNA פולימראז יציב בחום ו-88 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. יש להכניס את תערובת התגובה לארבעה צינורות PCR ולבצע PCR בתנאי הבא.

94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 25 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 56 מעלות צלזיוס למשך 25 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, והארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. אסוף את כל ארבע תגובות ה-PCR לתוך שפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל. עקוב אחר הנוהל של ערכת טיהור ה-PCR והוציא עם 50 מיקרוליטר של מאגר פליטה.

קבע את ריכוז ה-DNA ואת יחס הספיגה ב-260 ו-280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר גלוי UV. כעת ניתן לאחסן את הדנ"א במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשלב הבא. מכיוון שהנהלים עבור ההגברות הספציפיות לצומת השמאלי והצומת הימני זהים למעט הפריימרים המשמשים ב-PCR, רק הגברת הצומת השמאלי תודגם.

הכן תגובת PCR של 50 מיקרוליטר על ידי ערבוב הדברים הבאים בצינור PCR. חמישה מיקרוליטרים של DNA, חמישה מיקרוליטרים של 10 מיקרו-מולרי 2L-primer, חמישה מיקרוליטרים של 10 מיקרו-מולרי פריימר Link2, 5 מיקרוליטר של 10X מאגר DNA פולימראז יציב בחום, מיקרוליטר אחד של 10 dNTPs מילימולרי, שני מיקרוליטרים של DNA פולימראז יציב בחום ו-27 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. בצע PCR בתנאי הבא.

94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 8 עד 15 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 56 מעלות צלזיוס למשך 25 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, והארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השתמש בערכת טיהור ה-PCR כדי לטהר את ה-DNA ולחסל עם 50 מיקרוליטר של מאגר פליטה. קבע את ריכוז ה-DNA ויחס הספיגה ב-260 ו-280 ננומטר.

השלב האחרון ביצירת ספריות רצף צומת שמאל וימין הוא ניתוח וריאציות אורך ה-PCR Amplicon על ידי ביצוע אלקטרופורזה נימית. תוצאה מייצגת זו מציגה אורכים משתנים של אמפליקונים של PCR באתרי אינטגרציות וקטוריות לנטי-ויראליות עבור צומת מארח וקטור במעלה הזרם ובמורד הזרם. סמן גודל ה-DNA נמצא בנתיב M.

לאחר ריצוף מגברי ה-PCR, ניתוח רצף אתר אינטגרציה חישובית מבוצע באמצעות סקריפט תכנות פנימי. מבחן אתר האינטגרציה הדו-כיווני מייצר גדלים שונים של אמפליקונים PCR עבור צמתים מארחים וקטוריים במעלה הזרם ובמורד הזרם המומחשים על ידי אלקטרופורזה נימית. השוואה של אחוזי אינטגרציה בגנים Alu ו-L1 חוזרים על וקטורים לנטי-ויראליים בתאים המאכלסים מחדש עכברים אנושיים בתוך סיליקו יצרו אירועי אינטגרציה אקראיים גילתה שאתרי אינטגרציה מועשרים משמעותית בגנים.

תדירות הזיהוי היחסית של אינטגרומים וקטוריים חושבו רק באמצעות ספירת הרצף של צמתים של אתרי אינטגרציה המייצרים מגברי PCR קטנים מ-500bp. כ-77% מהווקטורים ניתנים לניתוח כמותי על ידי הגישה הדו-כיוונית. באסטרטגיה לכימות שיבוט אנו מניחים שכל שיבוט בודד חולק את אותו אינטגרום וקטורי.

התדרים היחסיים של הצמתים השמאלי והימני משולבים כדי לייצג את הכמויות היחסיות של אוכלוסיות השיבוטים, או QVI. ערכת צבעים זו מציגה את התדרים היחסיים של 44 שיבוטי QVI בתאים המאכלסים מחדש עכברים אנושיים. בהתבסס על ניתוח אינטגרציה אקראית בסיליקו 10,000, צפויה הערכת יתר של פי 1.25 של תדרי שיבוט בעת שימוש באנזימי מוטיב GTAC, והערכת יתר של 2.56 צפויה בעת שימוש באנזים מוטיב TCGA.

לאחר השליטה, ניתן לחלק טכניקה זו לחלקים ולהשלים אותה תוך יומיים, אם מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי שלבי PCR רגישים ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע זיהום. טכניקה זו סללה את הדרך לבחינת הבטיחות של וקטורים רטרו-ויראליים טיפוליים, ולחקור דפוסי אכלוס מחדש ארוכי טווח של שיבוטי תאי גזע המוטופויאטיים לאחר השתלה בקופי מקוק רזוס.