Name: הרחבת אדיפוגנזה השראה של אבות אדיפוציטים מ רקמות אדיבוס perivascular מבודדים על ידי מיון מגנטי המופעל תא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: למד שיטה לבידוד תאי אבות אדיפוציטים מרקמת שומן פריווסקולרית באמצעות מיון מגנטי. טכניקה זו מגבירה את התפוקה לעומת FACS ומאפשרת הבנת ביולוגיית אדיפוציטים ומחלות מטבוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המעבדות Contreras ו ווטס וד&quot;ר ויליאם רפאל. ניסויים אלה נתמכו על ידי NHLBI F31 HL128035-01 (רקמות העיכול פרוטוקול תקינה), NHLBI 5R01HL117847-02 ו 2P01HL070687-11A1 (בעלי חיים), ו NHLBI 5R01HL117847-02 (בידוד תאים ותרבות).

כל הנהלים המתוארים במאמר זה פעל לפי הנחיות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן. כל buffers ו medias צריך להיות מוגן מפני האור. 1. הכנת מאגרים, מדיה, ומכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת קרבס רינגר Bicarbonate-buffered פתרון (KRBB): 135 מ&quot;מ כלוריום נתרן, 5 מ&quot;מ כלוריד אשלגן, 1 מ&quot;מ גופרתי מגנזיום, 0.4 מ&quot;מ אשלגן פוספט dibasic, 5.5 מ&quot;מ גלוקוז, 1% אנטיביוטיקה / antimycotic (10,000 יחידות / מ&quot;ל ​​פניצילין, 10,000 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​amphotericin B), ו 10 מ&quot;מ HEPES (pH = 7.4). פתרון זה יציב במשך 3 שבועות כאשר שמר סטרילית ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Collagenase סוג 1 פתרון: 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב KRBB עם 4% בסרום אלבומין בסרום (BSA). פתרון זה צריך להישמר על 37 מעלות צלזיוס והוא יציב במשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון תמוגה תמוגה תמוגה: 154 מ&quot;מ אמוניום כלוריד, 10 מ&quot;ל אשלגן ביקרבונט, ו 0.1 מ&quot;מ EDTA. שמור על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת MCS חסימת חיץ: DMEM / F12 בסיס התקשורת, 10% בסרום שור עוברית (FBS), 5% סרום חמור רגיל, 40 μL / מ&quot;ל ​​F (ab) שבר חמור אנטי עכברוש IgG. שמור על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן MCS מאגר הצפת: פוספט שנאגרו מלוחים (PBS, pH = 7.5), 0.5% BSA, ו 2 מ&quot;מ EDTA. שמור על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש. פתרון דה גז על ידי חימום ל 37 מעלות צלזיוס במיכל זכוכית ולאחר מכן החלת ואקום for15 s. השאר שלא נעשה שימוש במאגר סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חלקיקים כלי דם של סטרומה (SVF): מדידות עורקיות של Dulbecco - DEMECCO: F12, 15% סרום עגל של 15%, אנטיביוטיקה של 1% / אנטיביוטיקה (10,000 יחידות / פניצילין מ&quot;ל, 10,000 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, 25 מיקרוגרם / ML amphotericin B), 44.05 מ&quot;מ סודיום ביקרבונט, 100 מיקרומטר חומצה אסקורבית, ביוטין 33 מיקרומטר, pantothenate מיקרומטר 17, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, ו 20 מ&quot;מ HEPES. שמור סטרילית ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן APC &amp;# 160: מדיה: מדיה בזאלית עם גורמי גדילה נוספים, כולל גורם גדילה באפידרמיס 10 ng / mL), גורם מעכב לויקמיה (10 ng / mL), גורם גדילה של טסיות (BB) (10 ng / mL) ופקטור גדילה בסיסי של fibroblast 5 ng / mL). שמור סטרילית ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן APC אינדוקציה מדיה: APC מדיה עם 10% FBS, 2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אינסולין, 0.5 מ&quot;מ 2-isobutyl-1-methylaxanthine (IBMX), 1 מיקרומטר dexamethasone, ו 200 pM T3 (הורמון בלוטת התריס triiodothyronine). שמור סטרילית ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות. </li></ol> 2. אדיפוציטים אבות בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדה על פי הנחיות מוסדיות. מניחים את החולדה בשכיבה הגב. אישור עומק הרדמה באמצעות אצבע הבוהן ואת אובדן התגובה רפלקס לגירוי זה כואב. הערה: פרוטוקול זה משתמש 10 שבועות חולדות Sprague Dawley ו 70 מ&quot;ג / ק&quot;ג של pentobarbital נמסר באמצעות הזרקה intraperitoneal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קו אנכי wIth מספריים לאורך עצם החזה באזור החזה ואת האזור העברי. גישה חלל הבטן לחשוף את העורק mesenteric מעולה, כלי ההתנגדות mesenteric קטן (mPVAT) ואת אבי העורקים החזי (aPVAT). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את כל החיבורים כדי mesentery ו אבי העורקים ולהסיר כלי מן החי. לבודד PVAT באמצעות מיקרוסקופ לנתח צלחת פטרי מלא KRBB כדי להציג כלי לבודד PVAT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסוי זה, לאסוף גונדאל (GON) אדיפוס לייצג מחסן שאינו PVAT דיפו. מקום רפידות שומן מבודדים על קרח KRBB עם 10 מ&quot;מ HEPES (pH = 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב מכסה המנוע biosafety, להעביר כ 50 מ&quot;ג של רקמה לצינור 1.7 מ&quot;ל עם 1 מ&quot;ל של קולגנאז סוג אני פתרון ו לטחון עם מספריים רקמות (1 - 3 חתיכות מ&quot;מ). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות תקציר על ידי דוגרים על 37 מעלות צלזיוס חממה rotisserie (או חממה עם שייקר מסלולית) עבור 1 ח &#39;. בתוך מכסה המנוע biosafety, ברצף לסנן חומר מתעכל דרך 100 ו - 40<html> מיקרומטר תאים מסננת לתוך צינור 50 מ&quot;ל. צנטריפוגה וכתוצאה מכך תסנין ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 300 × גרם. הערה: כל השלבים בפרוטוקול מכאן קדימה הם להתבצע מכסה המנוע biosafety לשמור תאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את כדוריות supernatant ו resuspend המכילים את התאים SVF ב 1 מ&quot;ל של 1X פתרון כדורית תמוגה תמוגה ולהעביר צינור 1.7 microfuge מ&quot;ל. דגירה תאים 5 דקות ב RT מוגן מפני אור צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב 300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים supernatant ו resuspend תא גלולה שנותר SVF בסל מדיה. איסוף 20 תת מדגם μL לספור תאים חיים עם פתרון כחול Trypan. הערה: מספר תאי SVF שניתן לבודד ישתנה בהתאם לאתר. מספרים ממוצעים של SVF שנקצרו לכל מ&quot;ג של רקמות הם: aPVAT = 5.0 ± 2.0x10 3 , mPVAT = 1.04 ± 0.62x10 4 , GON = 2.4 ± 1.2x10 5 . </li></ol> 3. מגנטי המופעל תא מיון _content &quot;&gt; הערה: בידוד APC מ SVF מבוסס על CD34 ו PDGFRα פני השטח סמנים על ידי ביצוע כל השלבים על 4 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים ספין 5 דקות ב 300 x גרם. יוצקים את supernatant ו resuspend גלולה התא MCS חסימת חיץ ב 1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ​​ו דגירה במשך 20 דקות. הערה: ניתן להפר את התאים המתים של 1 x 10 6 - 2 x 10 8 תאים / מ&quot;ל ​​באופן יעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם μL 5 של FITC- מצומדות עכבר anti-CD34 (1 מיקרוגרם / 1 x 10 6 תאים) במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. תאים ספין 5 דקות ב 300 xg ו 4 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם 4 μL של microbeads נגד FITC ו 96 μL של חיץ MCS (נפח כולל של 100 μL) במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך כדי להפריד CD34 + ו CD34 - תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המפריד המגנטי למעמד והנח את העמודה MultiSort (MS), עם כנפי העמוד הקדמי, לתוך המפריד. מניחים 5 מ&quot;לצינור תחת עמודה MS ב בעל הצינור העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן MS טור על ידי שטיפה עם פתרון הצפת MCS. החל 500 μL של חיץ MCS על גבי העמודה ולתת למאגר לרוץ דרך. מחק קולחים ולשנות צינור איסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען נוגדנים שכותרתו ההשעיה תא על עמודה MS מוכן. איסוף זרימת דרך המכילה תאים ללא תווית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו עמודה MS עם 500 μL של מאגר MCS degassed 3x. איסוף תאים ללא תווית העוברים דרך לשלב עם הזרימה דרך השלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר MS טור מהמפריד המגנטי והנח אותו על צינור איסוף חדש. פיפטה 1 מ&quot;ל של MCS הצפת על עמודה MS. מיד לשטוף את חלק עם תאים שכותרתו מגנטית על ידי בתקיפות, אבל לאט, החלת הבוכנה שסופק עם הטור כדי לא לאפשר גז עודף לתוך העמודה. הערה: מספרי התאים המבודדים ישתנו בהתאם לאתר. מספרים ממוצעים של CD34 + APC מבודדים מאוכלוסיית SVF לכלמ&quot;ג של רקמות הם: aPVAT = 2.6 ± 0.43x10 2 , mPVAT = 9.6 ± 1.4x10 2 , GON = 1.3 ± 0.22x10 3 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים ספין 5 דקות ב 300 × גרם ו 4 ° C. דגירה את החלק CD34 + שנאספו μL 10 של פתרון 1: 200/1 x 10 6 תאים ארנב נגד PDGFRα במשך 30 דקות ב 4 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים שוב 5 דקות ב 300 xg ו 4 ° C. דגירה תאים שכותרתו עם 4 μL של microbeads נגד ארנבת IgG ו 96 μL של חיץ MCS על ידי חזרה על שלבים 3.3 עד 3.7 לבודד. הערה: מספרי התאים המבודדים ישתנו בהתאם לאתר. מספרים ממוצעים של PDGFRα + APC המבודדים מאוכלוסיית CD34 + לכל מ&quot;ג של רקמות הם: APVAT = 2.4 ± 0.64, mPVAT = 8.4 ± 2.4, GON = 10.4 ± 1.9, המהווה 0.5 - 10% מהאוכלוסייה המבודדת בעבר. </li></ol></li></ol> 4. תרבות תאים אדיפוגנזה אינדוקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות SVFו APC ב 6-טוב רקמות תרבות צלחות התקשורת הבסיסית עם החלפת כל 2 ימים. לאחר 3 מעברים סדרתיים, צלחת שחור 96-טוב רקמות תרבות צלחות ב 1x10 2 תאים / גם מבחני התפשטות, אשר מוערכים ב 8, 24, 48, ו 96 שעות, ב 50,000 תאים / גם צלחות 24 גם או 10,000 תאים / גם 48-טוב רקמות תרבות צלחות עבור מבחני אדיפוגנזה, שהם איכותיים וכמותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלמת APC התקשורת הבסיסית עבור 48 שעות לאחר confluency ו לפני אינדוקציה עם חלבון מורפוגני העצם 4 (3.3 nmol / L) כפי שצוין 10 עבור בידול. להשרות תאים לאחר 48 שעות של 100% confluency (יום 0) באמצעות APC אינדוקציה מדיה כדי לדגור את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות, לשנות את התקשורת כדי לשמור על תאים בתקשורת Induction APC ללא יבמ ו dexamethasone, במשך 14 ימים עם שינויים התקשורת כל 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד MCS מאומת על ידי FACS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 50 μL (50,000 תאים) מדגם משנה של הפרדה מגנטיתלעבר התאים ולשטוף עם פתרון FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות תאים resuspend ב 100 μL של פתרון 1: 1000 של חמור נגד ארנב IgG Dylight 405 לתייג את התאים PDGFRα + . דגירה במשך 30 דקות מוגן מפני האור ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תאים resuspend μl 200 של פתרון פורמלדהיד 2% עד זמן לניתוח באמצעות 488 ננומטר (FITC) ו 405 ננומטר (Dylight 405) מסננים על cytometer זרימה. הערה: הצטברות שומנים על ידי תאים בתרבית מוערך כמותית באמצעות assipogenesis lipophilic adipogenesis בקורא microplate מדידה פלואורסצנטי ושימוש preadipocytes כמו כיולים עבור הצטברות השומנים. הצטברות השומנים נמדדת גם מבחינה איכותית על ידי צביעת צבע השומנים והדמיה שבוצעה על מיקרוסקופ הפוך מצויד במצלמה, מה שהופך את אחוז התאים הכולל לעשות או לא מכילים שומנים. כל צלחת הקורא כי הוא מסוגל למדוד הקרינה עם עירור ב 485 ננומטר פליטה ב 572ננומטר מתאים לניתוח כמו גם כל מיקרוסקופ עם מצלמה המסוגלת לכידת תמונות דיגיטליות. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Watts, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemerin+connects+fat+to+arterial+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemerin connects fat to arterial contraction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).</li>
<li>Dodson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+depots+differ+in+cellularity%2C+adipokines+produced%2C+gene+expression%2C+and+cell+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems.</a> Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).</li>
<li>Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+promotes+inflammation+in+periaortic+adipose+tissue+and+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).</li>
<li>Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+isolation+of+primary+adipose+cells+from+mouse+epididymal+fat+pads+induces+inflammatory+mediators+and+down-regulates+adipocyte+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes.</a> J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).</li>
<li>Stacey, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStacey%2C+G+%22in+eLS%22">in eLS</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).</li>
<li>Swim, H. E., Parker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+characteristics+of+human+fibroblasts+propagated+serially%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hyg%22%5BJournal%5D)">Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially.</a> Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).</li>
<li>Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+proliferation+and+differentiation+capacity+of+human+adipocyte+precursor+cells+from+the+omental+and+subcutaneous+adipose+tissue+depot+of+obese+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects.</a> Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).</li>
<li>Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exaggerated+replication+in+culture+of+adipocyte+precursors+from+massively+obese+persons%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons.</a> Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).</li>
<li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).</li>
<li>Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visceral+fat+adipokine+secretion+is+associated+with+systemic+inflammation+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans.</a> Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).</li>
<li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+characteristics+are+retained+in+strains+derived+from+single+human+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes.</a> Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).</li>
<li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li>
<li>Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+adipogenic+potential+of+perivascular+adipose+tissue+adipocyte+progenitors+is+dependent+on+sexual+dimorphism+and+vessel+location%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location.</a> Physiol Rep. 4 (19), (2016).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+adipogenic+niche+for+adipose+tissue+remodeling+and+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration.</a> Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+bipotential+adipocyte+progenitors+recruited+by+beta3-adrenoceptor+activation+and+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding.</a> Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).</li>
<li>Ahrens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+bone+morphogenetic+proteins-2+or+-4+in+murine+mesenchymal+progenitor+C3H10T1%2F2+cells+induces+differentiation+into+distinct+mesenchymal+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages.</a> DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).</li>
<li>Bowers, R. R., Lane, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+bone+morphogenetic+protein-4+in+adipocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development.</a> Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).</li>
<li>Schulz, T. J., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+bone+morphogenetic+proteins+in+adipogenesis+and+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).</li>
<li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+normoxia+enhances+survival+and+proliferation+rate+of+human+adipose+tissue-derived+stromal+cells+without+increasing+the+risk+of+tumourigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis.</a> PLoS One. 10 (1), 0115034(2015).</li>
<li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li>
<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

המוקד המרכזי של הניסוי הנוכחי הוא בידוד, הרחבה, אדיפוגני אינדוקציה של APC מן המחסנים PVAT. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של APC מבוסס על זיהוי של תאים להביע את סמנים פני השטח CD34 ו PDGFRα. אלה חלבונים פני השטח זוהו בעבר על APC עם שיעורי התפשטות גבוהה ואת הפוטנציאל להבדיל adipocytes לבן או חום שונים מחסנים 14 , 15 . על ידי בחירת תאים המבוססים על סמנים ספציפיים אלה, הצלחנו לבודד אוכלוסיות APC דומות ממחסני אדיפוס שונים התוא...

Perivascular רקמת אדיפוס (PVAT), בשל קרבתו לכלי הדם, הוא מרכיב מרכזי paracrine איתות ב תפקוד כלי הדם 1 . הרחבת רקמת השומן תלויה בפנוטיפ של תאי האב-אדפוציטים (APC) , 2 , 3 . בידוד של תאים ברקמות השומן קשה כמו adipocytes העיקרית הם שבירים, ציפה, ואת טווח בגודל. טכניקות בידוד מסוימים יכולים גם לשנות פנוטיפ התא מורפולוגיה על ידי הגדלת סינתזה חלבון דלקתיות וצמצום ביטוי הגן adipogenic 4 , המדגיש את החשיבות של פרוטוקול ששומרת על שלמות התאים. התרבות של תאים ראשוניים subpopulations ספציפיים preadipocyte נותן גישה רדוקציוניסטית ב vivo צמיחה ושומרת המקבילה איפור גנטי התאית 5 , למרות עובד tiאותי עם תאים אלה מוגבלת בשל הידרדרות עם ההזדקנות, או ההזדקנות 6 . Preadipocytes ממחסני השומן השונים, כולל תת מחסן תת-ימורי ו omental, גם להפגין הבדלים התפשטות 7 , אשר מדגיש את החשיבות של איסוף תאים מאתרים אנטומיים ספציפיים. תאים מבשר מן הלא PVAT מחסן לבן מחסן מאופיינים במחקרים קודמים 7 , 8 , 9 , אבל פחות ידוע על פנוטיפים PVT APC. הטכניקות המתוארות כאן מאפשרות ניתוח של אוכלוסיות ספציפיות ומוגדרות של APC, עם השפעה מזערית על המורפולוגיה שלהן, על יכולתן ועל פוטנציאלן להתרבות ולהבדיל. מגנטי המופעל תא תאים (MCS) הוא מקובל ליישומים במורד הזרם, כגון תרבות, כמו חרוזים להתמוסס מבלי לשנות את התא. MCS הוא גם חסכוני, ופעם נוגדן נוגדניםריכוזים תוקנו, הצורך מבחני cytometry זרימה היא מינימלית. מחקרים במבחנה עם מבשרי PVAT יכול גם לתת הצצה של הפוטנציאל כי תאים ראשוניים אלה עשויים להיות.

<table><tbody><tr><td><חזק>חיתוך רקמות</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חיתוך כלים</td><td>בעבודת יד עם תרבית סיליקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>פיירקס</td><td></td><td>7740 זכוכית</td></tr><tr><td>סיליקון אלסטומר</td><td>דאו קורנינג</td><td>סילגארד 170</td><td>ערכת</td></tr><tr><td>תפר משי קלוע</td><td>הרווארד מכשיר</td><td>51-7615</td><td>SP104</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10447254 מיקרוסקופ סטריאומאסטר מקור אור סיבים אופטיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12562-36</td><td></td></tr><tr><td>מספריים ואנאס</td><td>ג'ורג 'טימן & Co</td><td>160-150</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים רסיסים</td><td>ג'ורג' טימן & מספריים לרקמות Co</td><td>160-55</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ג'ורג 'טימן & Co</td><td>105-400</td><td></td></tr><tr><td><חזק>תמיסת KRBB</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>7758-114</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג</td><td>אנטיביוטי/אנטימיקוטי</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HEPES קורנינג</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><<tr><td>עיכול >רקמות חזק</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג 1</td><td>וורת'ינגטון ביוכימי</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין (BSA)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזה של תאי דם אדומים</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td>1X פתרון עבודה</td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק</td><td>2876</td><td>אמבט טלטול הדדי</td></tr><tr><td>ארון בטיחות</td><td>ביולוגית תרמו-פישר סיינטיפיק</td><td>1385</td><td></td></tr><tr><td>חממת רוטיסרי</td><td>דייגר</td><td>EF4894C</td><td></td></tr><tr><td>100 & מיקרו; מסננת תאים m</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td>צהוב</td></tr><tr><td>40 ומיקרו; m מסננת תאים</td><td>תרמו-פישר מדעי</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td> כחול <td>קול-פארמר</td><td>UX-79001-00</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td><חזק>בידוד תאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS ערכת</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-108</td><td></td></tr> <tr><td>(DMEM): F12</td><td>קורנינג בינוני</td><td>90-090</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי בסיס בינוני (FBS)</td><td>קורנינג</td><td>35016CV</td><td>ארה"ב מקורות</td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל</td><td>AbCam</td><td>AB7475</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-7324</td><td>מצומד FITC</td></tr><tr><td>אנטי-PDGFR&alpha;</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>PA5-17623</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-007-003</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) 10X</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>1X פתרון עבודה</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td><תרבית תאים חזקה>חזקה</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO 2 חממת תאים</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק</td><td>51030285</td><td>Heracell 160i&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 48 בארות מטופלות</td> TC <td>קורנינג</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות מטופלות TC,</td><td>קורנינג</td> קיר שחור <td>353376</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>מטופל TC 144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי מטופל TC (FCS)</td><td>קורנינג</td><td>35011CV</td><td>ארה"ב מקורות</td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>50-81-7</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>58-85-5</td><td></td></tr><tr><td>פנטותנט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>137-08-6</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>קורנינג</td><td>61-030</td><td></td></tr><tr><td>חלבון מורפוגני עצם 4 (BMP4)</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-081</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>400-25</td><td></td></tr><tr><td>לוקמיה מעכב</td><td>גורם PeproTech</td><td>250-02</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה שמקורו בטסיות BB</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-740</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>קורנינג</td><td>25-800-CR</td><td>תמיסת ITS</td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28822-58-4</td><td></td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-02-2</td><td></td></tr><tr><td>T3 (Triiodothyronine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6893-023</td><td></td></tr><tr><td>Cell Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyQUANT Proliferation Assay</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>C7026</td><td></td></tr><tr><td>AdipoRed Fluorescence Assay Reagent</td><td>Lonza</td><td>PT-7009</td><td></td></tr><tr><td>שמן אדום O מגיב צבע ליפידים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391</td><td>בתמיסה</td></tr><tr><td>M1000 קורא מיקרופלייט</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital Sight DS-Qil מצלמה</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הרחבת אדיפוגנזה השראה של אבות אדיפוציטים מ רקמות אדיבוס perivascular מבודדים על ידי מיון מגנטי המופעל תא

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

הרחבת רקמת אדיפוס (Perivascular Adipose Tissue) (PVAT), הרגולטור העיקרי של תפקוד כלי הדם באמצעות איתות paracrine, קשורה ישירות להתפתחות יתר לחץ דם במהלך השמנת יתר. היקף היפרטרופיה ו hyperplasia תלוי במיקום dot, מין, ואת סוג של פנויה epipocyte אב (APC) פנוטיפים הנוכחי. טכניקות המשמשות בידוד APC ו preadipocytes ב 10 השנים האחרונות שיפרו באופן דרסטי את הדיוק שבו תאים בודדים ניתן לזהות על בסיס סמנים ספציפיים משטח התא. עם זאת, בידוד של APC ו adipocytes יכול להיות אתגר בשל שבירות של התא, במיוחד אם התא שלם צריך להישמר עבור יישומי תרבות התא. מגנטי המופעל תא מיון ( MCS) מספק שיטה של ​​בידוד מספר גדול יותר של APC קיימא לכל יחידת משקל של רקמת השומן. APC שנקטפו על ידי MCS יכול לשמש פרוטוקולי חוץ גופית כדי להרחיב פרהDipocytes ולהבדיל אותם לתוך אדיפוציטים באמצעות שימוש בגורם גורם הגדילה המאפשר ניתוח של פוטנציאל פורה אדיפוגני שמרו על ידי התאים. ניסוי זה התמקד בתחנות ה- PVAT של אבי העורקים והמזנטרים, אשר ממלאים תפקידים מרכזיים בהתפתחות מחלות לב וכלי דם במהלך ההתפשטות. פרוטוקולים אלה מתארים שיטות לבודד, להרחיב ולהבדיל אוכלוסייה מוגדרת של APC. זה פרוטוקול MCS מאפשר בידוד לשמש בכל ניסוי שבו מיון התא נדרש עם ציוד מינימלי או הכשרה. טכניקות אלה יכולים לסייע ניסויים נוספים כדי לקבוע את הפונקציונליות של אוכלוסיות תאים ספציפיים בהתבסס על נוכחות של סמנים פני השטח התא.

יכולת פרוליפרטיבית של preadipocytes ופוטנציאל אדיפוגני של מבשרי השומן הם מאפיינים מתוחזקים במבחנה 11 . התפשטות חוץ גופית של SVF מבודד APC מ aPVAT, mPVAT, ו GON של חולדות זכר הוערך ב 8, 24, 48, ו 96 שעות לאחר ציפוי באמצעות assay DNA כמותי. לא נמצאו הבדלים באתר בשיעור ההרחבה של SVF, בכל נקודת זמן מלבד APC מ- aPVAT, אשר היה פחות התפשטות של 96 שעות בהשוואה לתאי SVF מאותו אתר ( איור 1</stron...

כאן אנו מדווחים על שיטה לבידוד של אוכלוסיות תאי אב (APC) של אדיפוציטים (APC) מתוך רקמת אדיפוס (Perivascular Adipose Tissue) (PVAT) תוך שימוש במיון תאים מגנטיים המופעל (MCS). שיטה זו מאפשרת בידוד מוגבר של APC לכל גרם של רקמת השומן בהשוואה לפלואורסצנטי המופעל תא מיון (FACS).

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

המטרות הכלליות של פרוטוקולי בידוד וההבדלה הללו הן להשיג תאי אב של אדיפוציטים מרקמות שומן פרי-וסקולריות, ולהשרות את הבדלתם לאדיפוציטים בוגרים. שיטה זו מאפשרת ניתוח של אוכלוסיות ספציפיות ומוגדרות של תאי אב של אדיפוציטים מרקמת שומן פרי-וסקולרית, עם השפעה מינימלית על המורפולוגיה, החיוניות והפוטנציאל שלהם להתרבות ולהבדלה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בידוד מוגבר של תאים מציגי אנטיגן לגרם של רקמת שומן, בהשוואה למיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS).לאחר אישור היעדר תגובה לצביטה בבהונות, בצעו חתך אנכי בקו האמצע לאורך העצם הסטרנום עד לאזור הפרינאום של החולדה, כדי לגשת לחלל הבטן. חשפו את העורק המזנטרי העליון (superior mesenteric artery), את כלי ההתנגדות המזנטריים הקטנים ואת האורטה התורקלית, ונתקו את כל החיבורים למזנטריון ולאורטה. אספו את רקמת השומן הגונדלית והעבירו את פדי השומן המבודדים למכל חדש של בופר Krebs-Ringer bicarbonate, או תמיסת KRBB, המועשרת ב-10 millimolar HEPES.העבירו את כלי הדם לצלוחית פטרי המכילה תמיסת KRBB, והניחו את הצלוחית תחת מיקרוסקופ סטריאו (dissecting microscope). הסירו את הרקמה השומנית הפרי-וסקולרית (perivascular adipose tissue) מכלי ההתנגדות המזנטריים הקטנים ומהאאורטה. בתוך מತಾב בטיחות ביולוגית, העבירו כ-50 milligrams של רקמה לשפופרת של 1.7 milliliter המכילה 1 milliliter של תמיסת collagenase type I, וקצצו את הרקמה לחתיכות של 1 עד 3 millimeter.חשוב לקצוץ את הרקמה השומנית באופן מספיק כדי לאפשר לקולגנאז לחלחל באופן יסודי לרקמה החיבורית. דגרו את המקטעים בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור למשך שעה אחת. לאחר מכן, סננו באופן רציף את החומר שעבר עיכול דרך מסנני תאים נפרדים של 100 ו-40 מיקרון אל תוך מבחנה של 50 mL.אספו את התסנן שהתקבל על ידי סרטיפוגציה, והשעיקו מחדש את המשקע ב-1 milliliter של באפר לליזה של אריתרוציטים. העבירו את תרחיף התאים למבחנה חדשה של Microfuge בנפח 1.7 milliliter לדגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר, תוך הגנה מאור. לאחר מכן, אספו את תאי הפרקיה הווסקולרית הסטרומלית (stromal vascular fraction) באמצעות סרטיפוגציה נוספת והשעיקו מחדש את המשקע במצע בסיסי לפרקיה וסקולרית סטרומלית לצורך ספירה.כדי לבודד את תאי הפרוגניטור של האדיפוציטים באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית, אספו את התאים על ידי סבב צנטריפוגה, ותלו את המשקע בבופר חסימה למיון תאים מופעל מגנטית בריכוז של 1 × 10⁶ תאים למילליליטר להדגרה של 20 דקות ב-4 °C. חיוני שכל שלבי הבידוד יבוצעו ב-4 °C, ולא על קרח. לאחר מכן, הדגירו את התאים עם 5 µL של נוגדן עכבר anti-CD34 מצומד ל-FITC למשך 30 דקות.אסוף את התאים באמצעות סבב צנטריפוגה. לאחר מכן, דגור את התאים עם 4 µL של anti-FITC MicroBeads בתוך 96 µL של בופר למיון תאים בהפעלה מגנטית (magnetic-activated cell sorting buffer) למשך 5 דקות בחושך. בזמן דגור התאים, הנח עמודת מיון רב-שלבית (multi-sort column) בתוך המפריד המגנטי, כאשר מתחת לעמודה מונח מבחנת פסולת בנפח 5 mL.שטפו את העמודה עם 500 µL של בופר למיון תאים בהפעלה מגנטית (magnetic-activated cell sorting buffer), והשליכו את הנוזל שירד ואת צינור הפסולת. לאחר מכן, הניחו צינור חדש תחת העמודה, וטענו את התאים לחלק העליון של העמודה, תוך איסוף התאים השליליים ל-CD34 שאינם מסומנים אל תוך צינור האיסוף החדש. כאשר כל התאים יעברו דרך החלק העליון של העמודה, שטפו את העמודה 3 פעמים עם 500 µL של בופר למיון תאים בהפעלה מגנטית מנוקה מגזים (degassed magnetic-activated cell sorting buffer), והמשיכו לאסוף את התמצית אל תוך צינור האיסוף.לאחר השטיפה האחרונה, העבירו את העמודה לשפופרת איסוף חדשה, והשתמשו בבוכנת העמודה כדי לשטוף 1 milliliter של magnetic-activated cell sorting buffer דרך העמודה אל השפופרת, על מנת לאסוף את התאים החיוביים ל-CD34. אספו את תאי progenitor של אדיפוציטים באמצעות סרטיפוגציה. לאחר מכן, דגרו את הפракציה החיובית ל-CD34 ב-10 microliters של rabbit anti-platelet-derived growth factor receptor alpha למשך 30 דקות.בסיום הדגירה, סבב את התאים שוב בצנטריפוגה, ודגור את המשקע ב-4 µL של anti-rabbit IgG MicroBeads ב-96 µL של magnetic-activated cell sorting buffer לצורך בידוד של תאים חיוביים ל-platelet-derived growth factor receptor alpha באמצעות חרוזי מגנט, כפי שהודגם הרגע. לצורך גידול של תאי אב לאדיפוציטים החיוביים ל-CD34 ול-platelet-derived growth factor receptor alpha, זרע את התאים בלוחות תרבית רקמה של 6 בארות במדיום בסיסי (basal medium), והנח את הלוחות באינקובטור לתרבית תאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר 3 מעברים סדרתיים, זרע את התאים לתוך לוחות תרבית רקמה שחורים של 96 בארות בריכוז של 1×10² תאים לבערה, והערך את השגשוג שלהם בנקודות זמן של 8, 24, 48 ו-96 שעות בריכוז של 5×10⁴ תאים לבערה, בלוחות בדיקה של 24 בארות, בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים לבדיקת שגשוג.כדי להשרות אדיפוגנזה (adipogenesis), כאשר תרבית תאי progenitor של אדיפוציטים מגיעה למצב של התמזגות (confluency), יש להאכיל את התאים במצע בסיסי לתאי progenitor של אדיפוציטים למשך 48 שעות, ולאחר מכן לטפל בתרביות ב-bone morphogenic protein 4 למשך 48 שעות נוספות. ביום השלישי, יש להחליף את המצע במצע השראה לתאי progenitor של אדיפוציטים, ללא IBMX ואקזמתזון, למשך 14 ימים. ניתן להעריך את מידת האדיפוגנזה בתרביות בריכוז של 1 times 10 to the 4th תאים לבאר בפלטות תרבית רקמה של 48 בארות, בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים של בדיקת אדיפוגנזה.למרות ששתי השיטות מדגימות התפלגות וחיות דומות של אוכלוסיות התאים, בידוד באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (magnetic-activated cell sorting) מפיק מספר רב יותר של תאים לתרבית, בהשוואה למיון תאים מופעל פלואורסצנציה (fluorescence-activated cell sorting). בניסוי מייצג זה, נבחנה הפרוליפרציה in vitro של פראקציה וסקולרית סטרומלית ותאי אב לאדיפוציטים שבודדו באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית מאורטה תורסית, מכלי התנגדות מזנטריים קטנים ומרקמת שומן גונדלית של חולדות זכר, בנקודות זמן של 8, 24, 48 ו-96 שעות לאחר הזריעה, באמצעות בדיקת DNA כמותית. לא נצפו הבדלי אתרים בשיעורי ההתרחבות של הפראקציה הוסקולרית הסטרומלית באף אחת מנקודות הזמן, למעט תאי האב לאדיפוציטים מהאורטה התורסית, שהדגימו פרוליפרציה נמוכה יותר עד לשעה ה-96, בהשוואה לתאי הפראקציה הוסקולרית הסטרומלית מאותו אתר.גירוי של תאי אב לאדיפוציטים בשכבה רציפה (confluent) באמצעות bone morphogenic protein 4 למשך 48 שעות משרה דיפרנציאציה של אדיפוציטים, כפי שבא לידי ביטוי בהצטברות מוגברת של ליפידים בטיפות, כפי שהוערך הן על ידי בדיקת ספיגת ליפידים פלואורסצנטית והן על ידי צביעת Oil Red O. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו ב-8 שעות, במידה והיא מבוצעת נכונה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על טמפרטורה של 4 degree Celsius במהלך שלבי הבידוד.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו מבודדים ומבדילים תאי אב של אדיפוציטים.

expansion-adipogenesis-induction-adipocyte-progenitors-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs) המסומנים באופן פלואורסצנטי מרקמת השומן של קשת פריאורטית. לאחר הבידוד, NCADSCs מזוהים, ממוינים באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, ולאחר מכן תרבית על צלחת, קידום התפשטות תאים.

בידוד תאי גזע שמקורם בשומן מרקמת שומן פריאורטית מורין

אנו מציגים את הטכניקות הנדרשות לבידוד מקטע כלי הדם הסטרומלי (SVF) ממאגרי רקמות שומן מפשעתיים (תת עוריים) ופריגונדלים (קרביים) של עכברים כדי להעריך את ביטוי הגנים והפעילות הקולגנוליטית שלהם. שיטה זו כוללת העשרה של תאי גזעשמקורם בשומן גבוה Sca1 (ASCs) באמצעות הפרדת תאים אימונומגנטיים.

הפרדת immunomagnetic של שומן דיפו ספציפי Sca1<sup&gt; גבוה</sup&gt; בתאי גזע שמקורם שומן (ASCs)

הבידול של adipocytes לבן ובייז של רקמת שומן אבות כלי הדם נושא פוטנציאל שיפור חילוף החומרים ההשמנה. נתאר פרוטוקולים של CD34 + CD31 + בידוד תאי אנדותל של שומן אנושי ואת הבאים במבחנה הרחבה, בידול לתוך לבן ובייז adipocytes. הם דנו מספר יישומים במורד הזרם.

בידוד, הרחבה, אינדוקציה Adipogenic CD34 + CD31 + תאי אנדותל של אדם עם פגיעה ו התת-עורית שומן

המטרה של פרוטוקול זה היא לבחון את היכולת של ובתאים נגזר רקמת שומן perivascular האדם להתמיין שושלות תאים מרובים. בידול היה לעומת גזע mesenchymal הנגזרות מח אנושי, אשר ידועה להבדיל לתוך adipocyte, osteocyte ו- chondrocyte שושלות.

בידול קיבולת של האדם-אבי העורקים Perivascular שומן ובתאים

אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד, התרבות, והאינדוקציה האדיגנית של הרכס העצבי (NCADSCs) מתוך רקמת השומן של ה-Wnt-1 יצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים. NCADSCs יכול להיות מקור נגיש בקלות של ADSCs עבור מידול אדיפוגנזה או ליפוגנזה ב מבחנה.

בידוד, תרבות, והשראה של הרכס העצבי המקורי אדיפוז-תאי גזע שמקורם ברקמת אדיפוז

פרוטוקול זה מתאר את הגישה הטכנית לבידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני רקמת שומן לבן תוך בטני (WAT) על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות או הפרדת חרוזים אימונומגנטית.

בידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני שומן תוך-בטניים של מורין

אנו מציגים שיטה פשוטה לבודד תאי אב שומן קיימא מאוד מרפידות שומן אפידיליות עכבר באמצעות מיון תאים המופעלים פלואורסצנטיות.

הכנת תאי אדיפוס אבות מרקמות שומן אפידימליות עכבר

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד החצי-אוטומטי של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת השומן של מורין כדי להשיג קדם-אדיפוציטים ולהשיג התמיינות אדיפוציט במבחנה. שימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז מפחית את השונות הניסיונית ומגביר את יכולת הרבייה.

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות

במאמר זה אנו מתארים את הבידוד, התרבית והאינדוקציה האידיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם בשברי כלי דם סטרומה מרקמת השומן הפריאו-אורטית של עכבר, מה שמאפשר לחקור את תפקוד רקמת השומן הפריווסקולרית ואת הקשר שלה עם תאי כלי הדם.

בידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים שמקורם בשבר כלי דם סטרומה מרקמת שומן פריאורטית של עכבר

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אבות פיברו-אדיפוגניים של שרירי השלד והלב (FAPs) מעכבר קוצני (Acomys) באמצעות דיסוציאציה אנזימטית ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה. FAPs המתקבלים מפרוטוקול זה ניתן להרחיב ביעילות ולהבדיל למיופיברובלסטים ואדיפוציטים.

בידוד, הרחבה והבחנה של אב פיברו-אדיפוגני ממודל העכבר הקוצני

הגודל והשבריריות של אדיפוציטים בוגרים הגבילו את הטכניקות והכלים הזמינים למחקר ולבידוד שלהם. כאן, מתואר פרוטוקול לבידוד של אדיפוציטים עכברים בוגרים, שניתן להתאים בקלות למחסני שומן שונים ולדיאטות עכברים.

בידוד ותרבות של אדיפוציטים עכבריים ראשוניים מעכברים רזים והשמנים

למד שיטה לבידוד תאי אבות אדיפוציטים מרקמת שומן פריווסקולרית באמצעות מיון מגנטי. טכניקה זו מגבירה את התפוקה לעומת FACS ומאפשרת הבנת ביולוגיית אדיפוציטים ומחלות מטבוליות.

הרחבת אדיפוגנזה השראה של אבות אדיפוציטים מ רקמות אדיבוס perivascular מבודדים על ידי מיון מגנטי המופעל תא

גלה סרטונים נוספים