שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR
30 בדצמבר 2017
היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים ברקמות דרוזופילה הוא קריטי עבור הלומדים שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח. הנה התיאור של תהליך פשוט לנתח כנפיים הגולמי. אלה כנפיים יכול לשמש כדוגמאות מספר טכניקות (אימונוהיסטוכימיה, PCR assay, וכו ').
המטרה הכוללת של הליך זה היא שיטה מהירה ויעילה לניתוח כנפי גולם של דרוזופילה המתאימה לגילוי חיסוני או מבחני PCR. ההליך המתואר כאן פותח על ידי הדרישה למצוא שיטה מהירה ויעילה להשגת דגימות כנף גולם המתאימות לביצוע בדיקות PCR או פרוטוקולי זיהוי חיסוני. בעזרת מכחול רטוב, הסר בעדינות גולם APF אפס שעות מבקבוקוני התרבות והנח אותם בבקבוקונים חדשים כדי להשלים את תקופת הפיתוח.
לדוגמה, אם משתמשים בגולם שהוא APF של 24 שעות, הוא יישאר בבקבוקון רק 22 שעות. לאחר 22 שעות, העבירו את הגולם לשקופית המיקרוסקופ כשהסרט הדו צדדי מודבק אליו. העברה זו יכולה להיעשות באמצעות מכחול כדי למנוע נזק לגולם.
יש למקם את הגולם בשורה עם דפנות הגב כלפי מעלה והקצוות הצפליים פונים לאותו כיוון. לאחר מכן, החזר את שקופית המיקרוסקופ לטמפרטורה קבועה ואפשר לגולם להשלים את זמן ההתפתחות המתאים. במקרה זה, זה יהיה 24 שעות.
שקופית המיקרוסקופ עם הסרט הדו-צדדי תהיה פלטפורמת דיסקציה חולפת להסרת מארז הגולם. במהלך השעתיים על שקופית המיקרוסקופ, מארז הגולם יתייבש, מה שהופך אותו לשבירת מלקחיים בקלות. השלב הראשון בדיסקציה הוא הוצאת הגולם מהפגר.
לאחר מכן הגולם יועבר למגלשה אחרת עם סרט דו צדדי המודבק אליו. הפגר יישאר מאחור. גולם זה ייתקע כשצד הגחון פונה כלפי מעלה, מונח באמצע הסרט.
לפני ביצוע חיתוך הכנף, יש לכסות את הגולם בתמיסה על פי ההליך באמצעות אימונוהיסטוכימיה. פתרון זה יהיה הדבקה והכנף תשתחרר מהציפורן. בעזרת מלקחיים, הסר בעדינות את האופרקולום ממארז הגולם.
שוברים את המארז בעזרת מלקחיים, יוצרים קו לאורך צד הגולם עד לקצה הזנב שלו. עם התאורה המתאימה, ניתן לדמיין את הצורה הפנימית של הגולם, מה שיוצר חלל ברור ממש מעל ציר כנף הגולם. חלל זה משמש כמדריך לביצוע הפתיחה מבלי לפגוע בגולם.
כאשר התיק נפתח לרוחב, ניתן יהיה להסיר חלקים ממנו, להרים אותם בגבול הפתוח ולשאת אותם לצד הנגדי שם הסרט הדו-צדדי יחזיק אותם. בסוף הדיסקציה, הגולם יהיה כמעט עירום. רק פיסת מארז תכסה את הקצה האחורי.
בעזרת המלקחיים, דחף בעדינות כלפי מטה את שארית המארז. מהלך זה יגדיל את הקצה הפנימי של הגולם, ויאפשר גם לראש וגם לבית החזה להישאר בעמדה מועדפת כדי להידבק למדרגה הבאה. קח שקופית חדשה עם סרט דו צדדי והפוך אותה על הגולם.
לאחר מכן לחץ מעט כדי לגרום לגולם להידבק לסרט ולהחליק בעדינות את המגלשה על מנת להסיר את הגולם משאר המארזים. הפוך את שקופית המיקרוסקופ. הגולם יהיה תקוע בצד הגב בגובה הראש או אזור בית החזה.
לשימוש באימונוהיסטוכימיה, כסו את כל הגולם העירום ב-4% פרפורמלדהיד. לאחר 10 דקות בהדבקה, בעזרת מספריים, בצע חתך קטן באזור הציר של הכנף או בסמוך אליה. אפשר לתוספת להגיע לאפיתל הכנף.
לאחר חמש דקות, קרעו עם מלקחיים מגבולות הציפורן, הרחיבו את החור ואפשרו את שחרור אפיתל הכנף משק הציפורן. לאחר שחרור רקמת הכנף, השאירו אותה בתמיסת הפרפורמלדהיד עד להשלמת 30 דקות של קיבוע. ניתן להשתמש בשיטת הדיסקציה המתוארת בסרטון זה להכנת דגימות באיכות גבוהה של כנפי גולם דרוזופילה משלבי התפתחות שונים עבור סוגים רבים של טכניקות.
ניתן לבצע את הפרוטוקול כדי לנתח גולם אחד או כמה גלמים בו זמנית. זה עוזר להאיץ את ההליך, מה שמקל על הגעה למספר רב של כנפיים מנותחות. כדי להסיר את הגולם העירום מהמארז הפתוח, חשוב שהקצה האחורי יהיה קטן מספיק.
למרות שאפשר להסיר שורה של ארבעה או חמישה גולמים עירומים בו זמנית, זו לא נקודה רלוונטית, היכולת להסיר את אלה שנותרו מחוברים למארז שלהם בשלבים עוקבים באמצעות סרט דו צדדי אחד. זוהי תמונה קונפוקלית של כנף APF הפועלת 24 עד 30 שעות. הצביעה מראה ביטוי של חלבון טלאים, הקולטן הקנוני של הקיפוד, הגרעינים וחוטי האקטין.
תהליך דיסקציה דומה יכול לשמש להשגת דגימות כנף גדולות יותר לבידוד mRNA. ניתן להשתמש ב-mRNA זה לסינתזה של cDNA שניתן להשתמש בו בתגובות PCR. כאן אנו מראים את המוצרים המתקבלים כדי לזהות את הביטוי של טלאים ואקטין.
הפרוטוקול מציע שיטה פשוטה להשגת דגימות כנף גולם השומרות על המורפולוגיה המוכרת של הכנף. מתכשירים אלה ניתן להשיג ערימות של תמונות שניתן להקרין כתמונות דו-ממדיות או תלת-ממדיות כדי לחקור את התפלגות ו/או העשרת החלבונים במהלך התמיינות הכנף. ניתן להשתמש בפרוטוקול דומה לאיסוף דגימת כנף גולם גדולה הנחוצה לסינתזה של cDNA, מולקולה חיונית בתגובות PCR.
הליך זה מספק גישה חלופית ומשלימה לשיטות שכבר פורסמו לדיסקציה של כנפי גולם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה מהירה ויעילה לדיסקציה של כנפי בובנאי של Drosophila, החיוניות לטכניקות שונות כגון זיהוי אימונולוגי ובדיקות PCR. הפרוצדורה נועדה להקל על חקר המיקום של תמלילים וחלבונים במהלך ההתפתחות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- גנטיקה
רקע
- הבנת הלוקליזציה של תמלילי RNA וחלבונים היא קריטית במחקרי התפתחות.
- Drosophila משמשת כמרכיב מודל למחקר גנטי והתפתחותי.
- הכנה יעילה של דגימות נחוצה לקבלת תוצאות ניסיוניות מדויקות.
- אימונו-דטקציה ו-PCR הן טכניקות נפוצות המשמשות במחקר ביולוגי.
מטרת המחקר
- לספק פרוצדורה פשוטה לדיסקציה של כנפי בובות.
- להגביר את היעילות של השגת דגימות לבדיקות PCR וזיהוי אימונולוגי.
- לתמוך במחקר של לוקליזציה של טרנסקריפטים וחלבונים במהלך ההתפתחות של Drosophila.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במכחול רטוב להעברה עדינה של הגלגולים.
- העברה של הגלגולים לזכוכית מיקרוסקופ באמצעות סרט דביק דו-צדדי.
- תזמון ההעברה בהתאם לגיל הגלגול.
- צמצום הנזקים לגלגול במהלך תהליך הנתיחה.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת איסוף של דגימות כנף שלב בובת שלב (pupa) שלמות.
- הדגימות המתקבלות מתאימות למגוון יישומים המשכיים.
- הפרוצדורה מהירה וממזערת את העקה על הדגימות.
- השיטה מקלה על ביצוע מחקרי לוקליזציה מדויקים ב-Drosophila.
מסקנות
- השיטה המתוארת יעילה לניתוח כנפי בובנאות.
- היא תומכת בחקר תהליכי התפתחות ב-Drosophila.
- ניתן להתאים את הטכניקה לצרכים ניסויים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך זה
הכנה יעילה של דגימות כנפי בובות של Drosophila מאפשרת זיהוי מהימן של ביטוי תסריטים (transcripts) וחלבונים, ובכך תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. שיטה זו מספקת תהליך עבודה מהיר וניתן לשחזור להפקת חומר ביולוגי באיכות גבוהה המתאים לבדיקות המשך, ובכך מפחיתה את השונות בסריקה פנוטיפית ובפיתוח בדיקות. באמצעות סטנדרטיזציה של דיסקציית הכנפיים, צוותי מחקר יכולים לשפר את רמת הביטחון החזויה בניתוח מסלולים ולתעדף מטרות בעלות רציונל מכניסטי חזק יותר.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות זיהוי מקומי של חלבונים כגון patched, קולטן hedgehog קנוני, ברקמת כנף בהתפתחות.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לדגימה עקבית לאורך שלבי התפתחות להבהרה של מסלולים ביולוגיים.
- ערך ניבוי: מסייע בהערכת מעורבות המטרה ודפוסי ביטוי הקריטיים לזיהוי מולקולות מובילות ולמיון תיקי פיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר דגימות של כנפי בובניה שלמות המתאימות לבדיקות אימונו-דטקציה ו-PCR, המאפשרות קריאות כמותיות של ביטוי גנים וחלבונים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הכנת הדגימה, ובכך משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה עבור קמפיינים של סריקה בסריקה גבוהה (high-throughput).
- מוכנות לבדיקה: מייצר חומר התואם לניתוח מולקולרי המשכי, התומך בהערכה אמינה של תרכובות בסריקות פנוטיפיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך חקר מורפוגנזה, עם יישום ישיר למידול של מסלולי התפתחות.
- הפחתת סיכונים מכניסטים: מאפשר ויזואליזציה של התפלגות חלבונים והעשרה במהלך דיפרנציאציה, ובכך מספק מידע על רמת הביטחון במטרה.
- הלימה פרה-קלינית: תומך בהערכת סמנים ביולוגיים באמצעות ביטוי שניתן לזיהוי של סמנים כגון actin ו-patched באפיתל הכנף.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרה דרך פיתוח בדיקה ועד להערכה פרה-קלינית, ומספקת טכניקה להכנת דגימות שניתן להשתמש בה שוב למחקרים המבוססים על Drosophila.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לגילוי תקשורת בין תאי ורידים והיווצרות ורידים חוצות במהלך התפתחות הגולם.
- סריקה: מספקת דגימות מוכנות לבדיקה בעלות מורפולוגיה עקבית, ובכך משפרת את האמינות של זיהוי אימונולוגי ותוצאות מבוססות PCR.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה כמותית של רמות תמלילים וחלבונים, ובכך מסייעת בניתוח השוואתי בין תנאים גנטיים או ניסויים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין שלב הגילוי המוקדם לתיקוף פרה-קליני באמצעות מנגנוני התפתחות שמורים הניתנים לצפייה במורפוגנזה של הכנף.
- שימוש חוזר ארגוני: קובעת פרוטוקול דיסקציה סטנדרטי שניתן להחיל על מספר פרויקטים החוקרים גנטיקה התפתחותית של Drosophila.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולים התפתחותיים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של הכנת הדגימות, ובכך תומך בביצועים עקביים של הבדיקה.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go באמצעות אספקת נתונים מהימנים על ביטוי ולוקליזציה של המטרה.
- השפעה על תיק הפיתוח (Portfolio Impact): מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאמי-סיכון באמצעות נתונים מכניסטיים באיכות גבוהה יותר מדגימות שחזוריות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסיסית בטיפול ב-Drosophila ובמיקרוסקופיה.
- מתבסס על כלים סטנדרטיים: מכחול רטוב, פינצטה, תzכיות מיקרוסקופ עם סרט דביק דו-צדדי, ו-4% paraformaldehyde.
- מחייב דיוק בתזמון בהתבסס על שעות לאחר היווצרות הגולם (APF) כדי להתאימו לשלבי ההתפתחות.
- ניתן להתאמה לשלבי התפתחות שונים של הכנף, אך מותאם באופן אופטימלי לגולמות ב-24–30 שעות APF.
- מוגבל על ידי הצורך בניתוח ידני זהיר כדי למנוע נזק לרקמה, אם כי המיומנות משתפרת עם התרגול.
