Name: שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: למד שיטה מהירה ויעילה לניתוח כנפי גולמי Drosophila לצורך אימונודטקציה או PCR. הפרוטוקול מאפשר איסוף דגימות איכותיות לחקר לוקליזציה של תעתיקים וחלבונים בהתפתחות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות CSIC על התמיכה הכלכלית שגבה את הפרויקט, מריאנה פינטור Di לסיוע טכני שלה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית; כדי חוסה Báez לאונרדו עבור תיקונים כתב היד שלו; כדי לוצ'יאנו קוראה על מסירותו ליצירתו של הוידאו; כדי Rosano נטליה שהשאלת את הקול שלה עבור הווידאו ואת מרכז מניות דרוזופילה בלומינגטון למתן את המניות השתמשו במחקר זה. Apa1 נגד monoclonal-Ptc שפותחה על ידי איזבל גררו שהושג מ התפתחותי מחקרים ליפידים הבנק (DSHB) תחת חסותה של NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, במחלקה למדעי הביולוגיה, איווה סיטי, IA 52242.

יום 1
1. איסוף של culturing הגלמים.
<ol>
	<li>להסיר את 0 h לאחר היווצרות puparium (APF) או prepupae באמצעות מברשת רטובה של בקבוקונים בתרבית ומניחים בקבוקונים חדשים כמעט להשלים תקופת פיתוח (ראה 2.1 ו- 2.2). 
	הערה: צריך להיות מתוחזק אוכלוסיה בריאה של זבובים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים culturing. לאחר שלושה או ארבעה ימים שבהם הביצים מוטלות, ניתן להסיר את המבוגרים בקבוקונים. כדי לאפשר את התפתחות אופטימלית של האנשים. הם נשמרים בטמפרטורה קבועה עד הזחלים לחלל השלישי ליזום להתגלמות. המעבר זחל הגולמי מסומן על ידי היווצרות prepupa נחשב את 0 h APF. Prepupa הוא זחל לבנים משותק הכולל של המלבן, צורה עם בולטות קדמית spiracles עגולה.</li>
</ol>
יום 2
2. העברה, ניתוח של קיבוע.
<ol>
	<li>להעביר את הגלמים (2 h לפני הזמן פיתוח הוא להשלים) באמצעות מברשת צבע, עד השקופית מיקרוסקופ עם סרט הדבקה דו-צדדי דבקה זה. מקם את הגלמים כדי ליצור שורה עם מעלה הגבי צדדים cephalic מסתיים פונות לאותו הכיוון.</li>
	<li>לחזור לשקופית מיקרוסקופ טמפרטורה קבועה ולאפשר הגלמים להשלים את הזמן המתאים התפתחותית (כלומר 24-30 h APF). 
	הערה: השקופית מיקרוסקופ עם קלטת דו-צדדית יהיה פלטפורמה חלוף ניתוח כדי להסיר את המקרה הגולמי (ראו להלן). זמן לשגות בשקופית מיקרוסקופ (מחוץ המבחנה) עוזר לייבש את התיק הגולמי עושה את. זה בקלות שבירים עם מלקחיים.</li>
	<li>הסר את operculum המקרה הגולמי באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>לפענח את המקרה עם מלקחיים (כפי שמוצג בסרטון) ביצוע קו לאורך הצד של הגולם הסוף סימטרית. זה אפשרי לזהות את הצורה פנימי של הגולם שהופך ניכר רווח מעל הציר של האגף הגולמי ההארה מתאימות. שטח זה משמש מדריך כדי לבצע את הפתיחה ללא פגיעה הגולם.</li>
	<li>הסרת חלקים של המקרה, לאסוף אותם ליד הגבול נפתח ולהסתובב איתם לצד הנגדי שבו הקלטת דו-צדדית יחזיק אותם. בסוף הקרע הגלמים יהיה כמעט "עירום", שרק חתיכה קטנה של התיק לסקר את הקצה האחורי. הערה: מטרת להשאיר כמות קטנה של התיק סימטרית בקצה העליון נועד להבטיח שחרור חלק מהתיק אותן לשקופית עם קלטת דו-צדדית. ההיגיון העומד מאחורי פעולה זו היא כי אם תסיר מדי של התיק אתה מאוד להסתכן בפגיעה הגולם. לעומת זאת אם תסיר מעט מדי, הגולם לא בקלות יבוא חינם של התיק.</li>
	<li>לדחוף למטה (עם מלקחיים) השארית של התיק. תנועה זו מעלה בקצה הקדמי של הגולם, ומאפשר גם בראש וגם החזה להישאר בעמדה מועדף לדבוק וכדי להעביר בשלב שלאחר מכן.</li>
	<li>קח שקופית חדשה עם סרט הדבקה דו-צדדי, היפוך זה גולם או שורה הגלמים. אנו ממליצים על ביצוע גישה זו על ידי התבוננות תנועות בסיועם stereomicroscope כדי למנוע שבירה של הגלמים.</li>
	<li>הקש מעט כדי להפוך את הגלמים לדבוק הקלטת, בעדינות והחלק את השקופית כדי להסיר את הגלמים משאר המקרים. היפוך השקופית למיקרוסקופ: הגלמים יהיה תקוע בצד הגבי ברמה של הראש שלהם / אזור בית החזה.</li>
	<li>מכסה כל הגלמים עירום עם 4% paraformaldehyde, לחכות 10 דקות. מניסיוננו, זו מאובדן זמן עם מקבע מסייע לשינוי מרקם של הקוטיקולה הפיכתה המשרד, פחות דביק, קל לטפל. 
	הערה: כדי לבצע את החילוץ חומצה ריבונוקלאית (RNA), paraformaldehyde תחליף עבור באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עשה עם RNase ללא מים ולהסיר את הכנפיים הגולמי עושה חתך (בעזרת מספריים) ליד נקודת הציר של כל גפה. באמצעות מלקחיים, להעביר את הכנף הגולמי צינור microcentrifuge עם 1 מ"ל של ריאגנט guanidinium thiocyanate ופנול. לאחר איסוף סך של 50-80 כנפיים, לאחסן את הצינור microcentrifuge ב-80 מעלות צלזיוס עד ביצוע ה RNA החילוץ10,11.</li>
	<li>עושים חתך קטן על האזור ציר של הזרוע או בקרבתה. לאפשר את מקבע להגיע האפיתל כנף. באמצעות פיפטה (p200) מיושרות מקבע מעל הכנף. בעת שטיפה החלף מזוהמים שמלמדות עם חדש. לאחר שטיפה, ממשיך האגף לשבועיים למשך 5 דקות. 
	הערה: למרות התמרון הזה עוזר לסלק את רוב רקמת מזהמים, כמה hemocytes, טיפות השמן יכול להישאר לכודים בין הרבדים אפיתל הגבי ו הגחון של האגף (ראה איור 1 א').</li>
	<li>דמעה עם מלקחיים מגבול לציפורן (כפי שמוצג בסרטון) מרחיבה את החור ועל הפעלת על שחרורו של האפיתל כנף מן הקרום לציפורן. ברגע הרקמה כנף הוא שוחרר, השאירו זה הפתרון paraformaldehyde להשלמת 30 דקות של קיבעון.</li>
	<li>להעביר את הכנפיים קבוע אחד נקוו 4 צלחת פלסטיק מלאים PBST (טריטון X-100 0.05%). חנות בן לילה ב 4 º C.</li>
</ol>
יום 3
3. ראשי נוגדן הדגירה.
<ol>
	<li>Permeabilize הרקמה המקננת הכנפיים הגולמי ב- PBST (טריטון X-100 0.2%) למשך 15 דקות באמצעות פלטפורמה נדנדה כדי להקל על תנועה בינונית נוזלי עדין. 
	הערה: עד הרכבה הדגימות, השלבים צריכה להתבצע באמצעות פלטפורמה נדנדה.</li>
	<li>לחסום את הדגימות באמצעות PBSTA (BSA 3%, טריטון X-100 0.1%) לשעה.</li>
	<li>להשתמש המאגר אותו לדלל נוגדן ראשוני (העכבר אנטי-Ptc, בטחונות) של דגירה הכנפיים הגולמי בן לילה ב 4 º C.</li>
</ol>
יום 4
4. משני נוגדן הדגירה.
<ol>
	<li>שטיפת דגימות דקות 4 x 10 כל אחד עם PBST (טריטון X-100 0.05%)</li>
	<li>דגירה עם נוגדנים משניים (למשל, העכבר אנטי מצומדת כדי fluorochrome) מדולל על הריכוז המתאים ב- PBSTA (BSA 3%, טריטון X-100 0.1%) בטמפרטורת החדר בחושך, כבר שעתיים. 
	הערה: אם זה מתאים, השתמש 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) ו/או phalloidin כדי counterstain את הרקמה. הוסף רגשים אלו עם הנוגדן משני לוקח בחשבון את אורך הגל של פליטה של fluorochromes כדי למנוע את החפיפה של אותות.</li>
	<li>שטיפת דגימות דקות 4 x 10 כל אחד עם PBST (טריטון X-100 0.05%)</li>
</ol>
5. הרכבה
<ol>
	<li>להכין מדגם שקופית על-ידי הצבת נקודות 4 של לק שקוף על השקופית מיקרוסקופ כאילו היו הקודקודים של ריבוע.</li></ol>הם יהיו הנקודות שבו ינוח coverslips, המסייע למנוע ריסוק הרקמה.
	<li>מקום 30 µL של הרכבה מדיה (גליצרול/טריס-HCl 80 אחוז) במרכז הכיכר של הנקודות עשה עם לק מבלי לגעת באחת הפינות (נקודות). לוקחים פיפטה עם טיפ החתוכה צהוב, לטעון כמה כלי תקשורת הרכבה, ואז מצייר באגפים הגולמי במספר.</li>
	<li>העברה כנפיים הגולמי הנקודה של הרכבה מדיה בשקופית מיקרוסקופ. בעזרת טיפ, התפשטה התקשורת הרכבה, להטביע את הכנפיים הגולמי כדי למנוע מהם צף. המורפולוגיה של הרקמה יישמרו אם הכנפיים יישאר שטוח הזכוכית המכסה ממוקם על. לפני הצבת הזכוכית המכסה, הסר את בועות האוויר.</li>
	<li>הנמך את coverslip על גבי הדגימות מנסה למנוע את הדור של בועות אוויר. תנועה זו יכול להיעשות בעזרת מלקחיים.</li>

<ol><li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limb+morphogenesis%3A+connections+between+patterning+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li>
<li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wing+disc+development+in+the+fly%3A+the+early+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li>
<li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li>
<li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li>
<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing%3A+initiation+of+wing+vein+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li>
<li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing%3A+The+development+of+the+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li>
<li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li>
<li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li>
<li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61(2009).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה של דיסקציה המתואר בסרטון זה יכול לשמש כדי להכין דוגמאות באיכות גבוהה דרוזופילה כנפיים הגולמי של שלבי ההתפתחות השונים עבור סוגים רבים של טכניקות (למשל, immunofluorescence, cDNA סינתזה כדי מבחני ה-PCR, גופית ווינג פיתוח). במונחים של שיטה זו מעורב המדען השתמשו 24-30 h APF. עם זאת צריך להיות שום מכשול בתוך הפעולות החיוניות דיסקציה של גולם צעיר או מבוגר. שינויים ייתכן שיש לבצע כדי להכיל גולם שלב קטן יותר.
הפרוטוקול יכול להתבצע לנתח גולם אחד או מספר הגלמים באותו זמן...

דרוזופילה כנפיים מפותחים של הדיסקים דמותי כנף. הבראשיתי של הדיסקים האלה כנף הם לשים בצד במהלך התפתחות עובריים כקבוצות קטנות של תאים דמותי 20-30 invaginate של האפיתל מתחלקים. בעוד הזחל הולך וגדל השלב לחלל, מיטוזה מתרחש בתאים דמותי במועדים האופיינית ספציפיים, העלאת המספרים שלה (כ 50000 תאים) ויוצרים את הכנף דיסק1,2,3, 4. כמו התאים להתרבות, הם אופנה אפיתל צינורי, וכתוצאה מכך ספירלה קומפקטי מתקפל עצמית. במהלך להתגלמות, טלסקופים האפיתל דיסק מחוץ לאגף טופס דו שכבתי, הורידים האורך להתחיל בתור לקונות ביניהם, אשר מתרחשת פעמיים במהלך כנף התפתחותית5,6.
הסידור של ורידים תמיד יש תבנית זהה; היכולת לזהות בקלות כל שינוי בתוך היווצרות הורידים הופך מוטציות גלוי מאוד (למשל חסרים או מיותרים וורידים, שינוי עמדות וריד, וכו '). מעניין, הווריאציות פנוטיפ בדרך כלל הראיות של מוטציות מוכרות או רומן רכיבים של איתות המסלולים הרלוונטיים לפיתוח כנף. אחד המסלולים זה ממלא תפקיד בקביעת המיקום ושמירה על הווריד וטריטוריות intervein הוא קיפוד (Hh) מסלול6,7,8.
בהתחשב בחשיבות של האגף הגולמי כמערכת מודל, חשוב יהיה להשיג דגימות באיכות טובה לעבוד עם. בעבר, מדענים שפרסמו פרוטוקולים לנתח דרוזופילה כנפיים לא העניק מדריך המתאים כדי להשיג דגימות עביד. ללא ההדרכה של חוקר אחד לא יכול בבירור להמחיש את התהליך. בגישות חלופיות אלה ויבתר הגולם לחלק שני, הפרדת האגף מן הרקמה שמסביב, שטפתי שוב ושוב לפנות את הפסולת. סוג זה של הגישה תביעות לעזוב את האגף חינם של מזהם אבל עקב התנסות קודמת התהליך הוא איטי יותר, ויש סיכוי גבוה יותר להתפשר על המבנה של בכנפיים השבריריות9.
ההליך המתואר כאן פותחה על ידי הדרישה למצוא שיטה מהירה ויעילה להשיג דגימות כנף הגולמי מתאימים לזהות חלבונים ספציפיים או התמלילים באמצעות פרוטוקולים immunodetection או מבחני (PCR) תגובת שרשרת של פולימראז. כדי להמחיש זאת, ביטוי של לוקליזציה של Patched (Ptc או הקולטן הקנוני של הנתיב Hh) מזוהה בדגימות כנף הגולמי, מתן פרוטוקול הכולל את הפרטים הרלוונטיים כדי לבצע בהצלחה את השלם נוהל.

<table><tbody><tr><td>סטריאומיקרוסקופ עם תאורת אור קרירה</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ1000 פלטפורמת נדנדה</td><td>ביומטריה (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>StarFrost</td><td>8037/1</td><td></td></tr><tr><td>משקפי כיסוי (24 x 32 מ"מ)</td><td>Deltalab</td><td>D102432</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>Lawton</td><td>63-1400</td><td></td></tr><tr><td>כלי פלסטיק רב בארות</td><td>תרמו </td><td>144444</td><td></td>מדעי</tr><tr><td>p100 או p200 פיפטה</td><td>Finnpipette (Labsystems)</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ביו בייסיק בע"מ.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>מלינקרודט</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>טריס</td><td>אמרסקו</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>טריזול ריאגנט</td><td>אמביון</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DEPC מים מטופלים</td><td>MO. BIO</td><td>17011-200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 עזים נגד עכבר IgG (H+L), 2 מ"ג/מ"ל (דילול עבודה 1/800)</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td></td></tr><tr><td>מונוקלונלי אנטי-PTC (Apa-1) 54 &mu; g/mL (דילול עבודה 1/100)</td><td>בנק היברידומה למחקרים התפתחותיים (DSHB)</td><td></td><td>מאת איזבל ג'ררו מ-DSHB בחסות ה-NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, המחלקה למדעי הביולוגיה, איווה סיטי, IA 52242.&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI, 1 מ"ג/מ"ל (דילול עבודה 1/5000)</td><td>Invitrogen</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin מצומד ל-Alexa 488, 300 U/1.5 מ"ל מתנול (דילול עבודה 1/600)</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Canton S (מלאי זבוב)</td><td>מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים immunodetections או מבחני ה-pcr

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

אגף פיתוח melanogaster דרוזופילה הוא מודל אידיאלי ללמוד מורפוגנזה ברמת רקמות. תוספות אלה לפתח מתוך קבוצה של תאים בשם אגף דיסקים דמותי נוצר במהלך התפתחות. הזחל הדיסקים דמותי צומחים, להגדיל את מספר התאים ויוצרים מבנים אפיתל monolayered. בתוך התיק הגולמי הדיסקים דמותי באד החוצה ומקפלים לתוך bilayers לאורך קו זה הופך לשולי העתידי של האגף. במהלך תהליך זה, מקורם הורידים primodia האורך וריד תאים הגבי ו הגחון פוטנציאליים של משטחי הכנף. במהלך השלב הגולמי הפסים של וריד תאים של כל שטח תקשורת על מנת ליצור צינורות חזק; במקביל, קרוס-הורידים מתחילים היווצרותם.
עם העזרה של סמנים מולקולריים המתאים, זה אפשרי לזהות את המרכיבים המרכזיים להלחין את האגף במהלך התפתחותו. מסיבה זו, היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים במבנה זה חיוני ללמוד שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח של האגף.
ההליך המתואר כאן מתמקדת על מניפולציה כנפיים הגולמי, מתן הנחיות מפורטות כיצד לנתח את האגף במהלך השלב הגולמי. . הקרע של רקמות הגולמי קשה יותר לביצוע מאשר מקביליהם הזחלים לחלל השלישי. זו הסיבה מדוע גישה זו פותחה, כדי לקבל דוגמאות איכותי מהיר ויעיל. פרטים לגבי אופן immunostain ו הר דגימות אלה כנף, כדי לאפשר את הפריט החזותי של חלבונים או מרכיבי התא, ניתנים בפרוטוקול. עם המומחיות הקטנה אפשרי לאסוף 8-10 כנפיים הגולמי באיכות גבוהה תוך זמן קצר.

הפרוטוקול מציע שיטה פשוטה עבור קבלת דגימות כנף הגולמי לשמור המורפולוגיה מוכר של האגף. מן ההכנות הללו זה ניתן לקבל ערימות של תמונות יכול להיות מוקרן דו-ממדיים או תלת-ממד, לחקור הפצה ו/או ההעשרה של חלבונים במהלך הבידול של האגף. (ראה ההערה ב- 2.9) פרוטוקול דומה ניתן לאסוף גדול כנף הגולמי המדגם (50-80 מעורבים wings הגולמי) הדרושים כדי לסנתז חומצה deoxyribonucleic משלימים (cDNA), התבנית המשמשת ב- PCR תגובות.
<img alt="Figure 1" class...

היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים ברקמות דרוזופילה הוא קריטי עבור הלומדים שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח. הנה התיאור של תהליך פשוט לנתח כנפיים הגולמי. אלה כנפיים יכול לשמש כדוגמאות מספר טכניקות (אימונוהיסטוכימיה, PCR assay, וכו ').

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לספק שיטה מהירה ויעילה להפרדת כנפי בובנאות של Drosophila המתאימה לבדיקות אימונו-דטקציה או לבדיקות PCR. הפרוצדורה המתוארת כאן פותחה מתוך הצורך למצוא שיטה מהירה ויעילה להשגת דגימות של כנפי בובנאות המתאימות לביצוע פרוטוקולי אימונו-דטקציה או בדיקות PCR. בעזרת מכחול רטוב, הוציאו בעדינות בובנאות בשעה 0 APF מבקבוקי התרבית והעבירו אותן לבקבוקים חדשים להשלמת תקופת הפיתוח.לדוגמה, אם משתמשים בבובנאי שנמצא 24 שעות APF, יש להשאירו בתוך המבחנה למשך 22 שעות בלבד. לאחר 22 שעות, העבירו את הבובנאי לזכוכית של מיקרוסקופ שעליה מודבק סרט דביק דו-צדדי. ניתן לבצע את ההעברה באמצעות מכחול כדי למנוע פגיעה בבובנאי.יש למקם את הגולם כך שיגבשו שורה, כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה והקצוות הצפליים פונים לאותו כיוון. לאחר מכן, יש להחזיר את תגית המיקרוסקופ לטמפרטורה קבועה ולאפשר לגולם להשלים את זמן הפיתוח המתאים. במקרה זה, מדובר ב-24 שעות.שקופית המיקרוסקופ עם הסרט הדו-צדדי תשמש כפלטפורמת נתיחה זמנית להסרת מעטפת הגולם. במהלך השעתיים על שקופית המיקרוסקופ, מעטפת הגולם תתייבש, דבר שיהפוך אותה לקלה לשבירה באמצעות פינצטה. השלב הראשון בנתיחה הוא הוצאת הגולם מהגופה.לאחר מכן, תועבר הבבואה לעגלה אחרת שעליה הודבק סרט דביק דו-צדדי. הגויה תישאר מאחור. בבואה זו תודבק כאשר הצד הוונטרלי פונה כלפי מעלה, במרכז הסרט הדביק.לפני ביצוע חיתוך הכנף, יש לכסות את הבשמים בתמיסה בהתאם לנוהל העובד בשיטת immunohistochemistry. תמיסה זו תשמש כחומר מקבע והכנף תשוחרר מהקיטיקולה. בעזרת פינצטה, הסר בעדינות את המכסה (operculum) ממעטפת הבשמים.שברו את המעטפת באמצעות פינצטה, תוך יצירת חתך לאורך צדו של הבוביס עד לקצהו הזנבי. באמצעות תאורה מתאימה, ניתן להמחיש את המבנה הפנימי של הבוביס, המראה חלל ברור ממש מעל ציר הכנף של הבוביס. חלל זה משמש כמדריך לביצוע הפתיחה מבלי לגרום נזק לבוביס.כאשר הנרתיק נפתח הצידה, ניתן יהיה להסיר חלקים ממנו, להרים אותם מהשפה הפתוחה ולהעבירם לצד הנגדי, שם סרט ההדבקה הדו-צדדי יחזיק אותם. בסיום הנתיחה, הגולם יהיה כמעט עירום. רק חלק מהנרתיק יכסה את הקצה האחורי.בעזרת הפינצטה, לחץ בעדינות למטה את שאר המעטפת. פעולה זו תגביה את הקצה הפנימי של הגולם, מה שיאפשר לראש ולחזה להישאר במיקום מועדף להדבקה בשלב הבא. קח זכוכית כיסוי חדשה עם סרט דביק דו-צדדי והנח אותההפוכה על הגולם.לאחר מכן, לחצו קלות כדי לגרום לגולם להידבק לסרט, והחליקו בעדינות את תגית הזכוכית כדי להפריד את הגולם משאר המעטפות. הפכו את תגית הזכוכית. הגולם יהיה דבוק לצד הגבי (dorsal) בגובה אזור הראש או החזה.לצורך אימונוהיסטוכימיה, כסו את גוף הגלגול העירום כולו ב-4% paraformaldehyde. לאחר 10 דקות במקבע, בצעו בעזרת מספריים חתך קטן באזור הציר של הכנף או בסמיכות אליו. אפשרו למקבע להגיע לאפיתל הכנף.לאחר חמש דקות, קרעו בעזרת פינצטה מקצוות הקוטיקולה, הרחיבו את החור ואפשרו את שחרור אפיתל הכנף משק הקוטיקולה. ברגע שרקמת הכנף השתחררה, השאירו אותה בתמיסת הפרהורמאלדהיד עד להשלמת 30 דקות של קיבוע. את שיטת הדיסקציה המתוארת בסרטון זה ניתן להשתמש בה כדי להכין דגימות באיכות גבוהה של כנפי בובות של Drosophila משלבי התפתחות שונים עבור סוגים רבים של טכניקות.ניתן לבצע את הפרוטוקול כדי לנצח גלולה אחת או מספר גלולות בו-זמנית. דבר זה מסייע להאיץ את ההליך, ומקל על השגת מספר גדול של כנפיים מנוצחות. כדי להוציא את הגלולה העירומה מהנרתיק הפתוח, חשוב שקצה הפינצטה יהיה קטן מספיק.למרות שניתן להסיר שורה של ארבעה או חמישה גלגולים עירומים בו-זמנית, אין לכך רלוונטיות, שכן ניתן להסיר את אלו שנותרו מודבקים למעטפה שלהם בשלבים עוקבים באמצעות סרט דבק דו-צדדי אחד. זוהי תמונת קונפוקלית של כנף בטווח של 24 עד 30 שעות APF. הצביעה מראה את הביטוי של חלבון patched, הרצפטור הקנוני של hedgehog, את הגרעינים ואת סיבי האקטין.ניתן להשתמש בתהליך נתיחה דומה כדי להשיג דגימות כנף גדולות יותר לצורך בידוד mRNA. ניתן להשתמש ב-mRNA זה כדי לסנתז cDNA, שניתן להשתמש בו בתגובות PCR. כאן אנו מציגים את התוצרים שהתקבלו כדי לזהות את הביטוי של patched ו-actin.הפרוטוקול מציע שיטה פשוטה להשגת דגימות של כנפי בובנאות השומרות על המורפולוגיה המוכרת של הכנף. מתוך הכנות אלו ניתן להפיק ערימות של תמונות שניתן להקרינן כתמונות דו-ממדיות (2D) או תלת-ממדיות (3D) כדי לבחון את ההפצה ו/או את העשירה של חלבונים במהלך התמיינות הכנף. ניתן להשתמש בפרוטוקול דומה כדי לאסוף דגימה גדולה של כנף בובנאות הדרושה לסנתזה של cDNA, מולקולה חיונית לתגובות PCR.הליך זה מספק גישה חלופית ומשלימה לשיטות שכבר פורסמו לביצוע דיסקציה של כנפי בובה.

a-rapid-efficient-method-to-dissect-pupal-wings-drosophila-suitable

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

שיטה immunostain ולדמיין איברים chordotonal ב זחלים וגלמים...

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

שרירי התעופה של דרוזופילה משמשים כמערכת מודל להתפתחות שרירים ופיזיולוגיה. סרטון זה מתאר את שרירי התעופה של מבוגרים ומדגיש פרוטוקול לניתוח שרירי טיסה עקיפים מתפתחים המתאימים לריצוף RNA מגלמים.

דרוזופילה דיסקציה מאוחרת של שריר התעופה העקיפה של הגלמים (IFM): שיטה לאיסוף רקמות בתפוקה גבוהה

השחלה דרוזופילה הוא מערכת דגם מעולה ללימוד פיתוח גומחת תאי גזע. על פי שיטות ניקוד השחלות זחל ומבוגרים פורסמו, השחלה הגולמי והניתוחים דורשות טכניקות שונות זה לא פורסמו בפירוט. כאן אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול לנתח, מכתים של הרכבה השחלות הגולמי.

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

פרוטוקולים עבור היערכות תקופות הגולמי ומדידה של אגף פיגמנטציה של דרוזופילה guttifera מתוארים. האחסון הזמני, כימות של פיגמנטציה לספק בסיס מוצק לימוד מנגנוני התפתחותית של תכונות למבוגרים ולאפשר השוואה interspecific של תכונה הפיתוח.

שיטות מדידה של אגף פיגמנטציה של דרוזופילה guttifera ותקופות הגולמי הזמני

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב ומנתחים לפתח חוש הריח רקמות ממינים דרוזופילה . הרקמה ביתור מאוחר יותר ניתן להשתמש עבור ניתוחים מולקולריים, כגון כמותיים RT-PCR (הפוך תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית) או RNA רצף (RNAseq), כמו גם ניתוחים ויוו כגון אימונוהיסטוכימיה או בחיי עיר הכלאה.

הכנת לפתח רקמות היקפיים חוש הריח עבור מולקולרית וניתוח Immunohistochemical ב דרוזופילה

מאמר זה מציג שיטה כירורגית ניקוד דרוזופילה הרשתיות הגולמי יחד עם פרוטוקולים עיבוד רקמה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA-חילוץ.

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

דרוזוהילה שריר הטיסה הוא מודל רב-עוצמה לחקר רגולציה משלימה, שחבור חלופיים, חילוף חומרים ומכניאולוגיה. אנו מציגים פרוטוקול לניתוח שריר הטיסה המסומן באמצעות פלורסנט מן הגלמים החיים כדי ליצור דגימות מועשר מאוד אידיאלי עבור פרוטאומוניקס וברצף עמוק. דגימות אלה יכולות להציע תובנות מכניסטיות חשובות להיבטים מגוונים של פיתוח שרירים.

חיתוך של דרוזופילה מלאנוסטר שרירי הטיסה לגישות omics

הפרוטוקול הנוכחי מפרט את ההכנה וההדמיה של רקמה קבועה של נוטום דרוזופילה פופאל. זה יכול לשמש עבור רקמה שלמה או פצועה, ואת הארכיטקטורה המקורית של הרקמה נשמרת. ההליכים לניתוח, תיקון וצביעה מתוארים כולם במאמר זה.

ניתוח, תיקון והדמיה של ה-Drosophila Pupal Notum

דרוזופילה היא מודל רב עוצמה להבנת מנגנונים בסיסיים של מיוגנזה. פרוטוקול זה לדיסקציה והכנה של חצאי בית החזה מאפשר ניתוח מיקרוסקופיה של שרירי תעופה עקיפים הן משלב הגולם והן משלב הבוגר. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה קונפוקלית של מורפולוגיה תאית, לוקליזציה של חלבונים, מבנה שרירים והיבטים רבים אחרים של מיוגנזה.

דיסקציה של שרירי טיסה עקיפים של Drosophila melanogaster לגישות מיקרוסקופיות

מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל לפירוק דיסק דמיוני וצביעת נוגדנים, שהוא חסכוני עם מגיבים ומקל על טיפול בדיסקים דמיוניים במספרים קטנים.

כריתה בקנה מידה קטן וצביעת נוגדנים של דיסקים דמיוניים באנטנות העיניים והכנף מ-Drosophila melanogaster

למד שיטה מהירה ויעילה לניתוח כנפי גולמי Drosophila לצורך אימונודטקציה או PCR. הפרוטוקול מאפשר איסוף דגימות איכותיות לחקר לוקליזציה של תעתיקים וחלבונים בהתפתחות.

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

גלה סרטונים נוספים