מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

המטרה הכוללת של מתודולוגיית תיוג זו היא למדוד אנדוציטוזיס שלפוחית סינפטית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח כגון פיזור שלפוחיות אנדוציטיות שנוצרו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הרזולוציה במהלך ההדמיה והדמיה של שינויים על ידי בחינת המבנה השלם של התא.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהם לא מצליחים להסיר בועות אוויר זעירות בזמן הכנת האפוקסי או לייבש את הדגימה במהלך שטיפות האתנול. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו צלחת שש בארות מצופה פולי-די-ליזין על ידי מריחת 1.5 מיליליטר של תמיסת פולי-די-ליזין סטרילית מסוננת של 0.01% על כל באר למשך שעה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטפו אותה שלוש פעמים במים מעוקרים. לאחר מכן, הכינו תמיסת גירוי אשלגן גבוהה עם פרוקסידאז צנון סוסים והתאימו את התמיסה ל-pH 7.4 עם חמש נתרן הידרוקסיד מולארי.

לאחר מכן, עורר את תרבית הנוירונים בהיפוקמפוס על ידי הוספת 1.5 מיליליטר של תמיסת גירוי אשלגן גבוהה לכל באר בטמפרטורת החדר למשך 90 שניות. בשלב זה, הכינו מאגר נתרן קקודילאט 0.1 מולארי ב-pH 7.4. תקן את התאים עם 4% גלוטרלדהיד במאגר נתרן קקודילאט 0.1 מולרי למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטוף את התאים שלוש פעמים עם מאגר נתרן קקודילאט 0.1 מולרי בכל פעם למשך שבע דקות.

לאחר מכן, הכינו תמיסת DAB וסננו אותה עם פילטר של 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, מרחו 1.5 מיליליטר של תמיסת DAB על התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שטפו את התאים שלוש פעמים עם מאגר נתרן קקודילאט 0.1 מולארי בכל פעם למשך שבע דקות. לאחר הקיבוע, דגרו את הנוירונים עם 1.5 מיליליטר של 1% אוסמיום טטרוקסיד במאגר נתרן קקודילאט 0.1 מולרי למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, שטפו את הנוירונים שלוש פעמים עם 1.5 מיליליטר של 0.1 מולארי נתרן קקודילאט בכל פעם למשך שבע דקות. לאחר מכן, הכינו 0.1 מאגר נתרן אצטט מולארי עם נתרן אצטט וחומצה אצטית קרחונים. שטפו את התאים שלוש פעמים עם 1.5 מיליליטר של 0.1 מאגר אצטט מולארי בכל פעם למשך שבע דקות.

לאחר מכן, דגרו את התאים עם 1.5 מיליליטר של 1% אורניל אצטט במאגר אצטט מולארי של 0.1 למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס, ואז שטפו את התאים שלוש פעמים עם 1.5 מיליליטר של 0.1 מאגר אצטט מולארי למשך שבע דקות בכל פעם. במכסה אדים, ייבשו את התרבית העצבית עם שטיפות בודדות של 1.5 מיליליטר עם 50%70% ו-90% אתנול למשך שבע דקות כל שטיפה, ולאחר מכן שלוש שטיפות עם 1.5 מיליליטר של 100% אתנול למשך שבע דקות בכל פעם. לאחר מכן, צור את שרף האפוקסי וערבב היטב ואחסן אותו בוואקום כדי להסיר בועות אוויר.

הסתנן לדגימה על ידי החלפת האתנול בשרף אפוקסי 50% באתנול על שייקר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן 70% שרף אפוקסי באתנול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר. החלף את תמיסת שרף האפוקסי בשרף אפוקסי 100% ודגירה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס. בצע שתי החלפות של שרף אפוקסי טרי 100%, כל החלפה מודגרת למשך שעה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן מוסיפים שרף אפוקסי טרי של 100% ומניחים לו להתקשות ב-50 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולאחר מכן ב-60 מעלות צלזיוס למשך למעלה מ-36 שעות. לאחר מכן, הסר כל דגימה מהצלחת מרובת הבארות בעזרת מסור יד של מקדח. בעזרת מיקרוסקופ אור הפוך, בחר את אזורי העניין שיש בהם ריכוזים צפופים של תאים, ואז חתוך את הבלוקים של קובייה של ארבעה על חמישה על שמונה מילימטרים לצורך חתך.

לאחר מכן, יש לצבוע את החלקים על ידי טבילה עם אורניל אצטט מימי 1% למשך 15 דקות ולאחר מכן ציטראט עופרת מימי 3% למשך חמש דקות כדי לשפר את הניגודיות של הדגימות. במחקר זה בוצעה מיקרוסקופ אלקטרונים בתא עצב מתורבת והשלפוחיות המצופות קלתרין נבדקו בהשוואה לדגימות הביקורת שהודגרו עם חמישה מיליגרם למיליליטר HRP למשך 90 שניות בהיעדר גירוי. הבורות המצופים בקלתרין נצפו בהסתברות של 0.05 לבוטון בהיעדר גירוי.

בתמונות אלה, גירוי עם אנדוזום בתפזורת המושרה על ידי אשלגן גבוה וספיגת שלפוחיות סינפטיות זוהו על ידי תיוג HRP. שלפוחיות סינפטיות הוגדרו כשלפוחיות בקוטר של פחות מ-50 ננומטר ואנדוזומים בתפזורת הוגדרו כבעלי קוטר מעל 80 ננומטר או עם שטח חתך של יותר משלפוחית של יותר מ-80 ננומטר. ספיגת אנדוזום בתפזורת הופחתה על ידי התאוששות עם מי מלח רגילים.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 8-1/2 שעות עם שלושה ימים נוספים כדי להקשיח את האפוקסי אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון תיוג אימונוגולד על מנת לענות על שאלות נוספות כמו חלוקת חלבון מטרה בנקודות שונות בהתאוששות הגירוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לייצב ולהכתים דגימות כהכנה להדמיה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים.