ניתוח של המעבר צומת הפער תלוי מירנה עם מיקרוסקופיה 3D-FRAP

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את ההעברה התלויה בצומת הפער של מיקרו RNA בקרדיומיוציטים חיים. שיטה זו יכולה לעזור לטפל בתפקידו של מיקרו RNA עבור מערכת עסקאות האותות הבין-תאית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לדמיין ולכמת את חילופי צומת הפער של מיקרו RNA בתאי חיים עם רזולוציה מרחבית גבוהה של זמן.

לאחר בידוד קרדיומיוציטים על פי פרוטוקול הטקסט, צלחו את התאים על שש צלחות באר בצפיפות של שלוש פעמים 10 עד התאים החמישיים לסנטימטר מרובע. דגרו על התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת, הוסיפו 0.5 טריפזין לתאים ודגרו על התרביות למשך חמש דקות כדי לנתק את התאים.

השבת את הטריפזין על ידי הוספת מדיום תרבית תאים. לאחר ספירת התאים, צנטריפוגה אותם ב -300 פעמים גרם למשך 10 דקות. לאחר מכן השתמש במאגר אלקטרופורציה כדי להשעות מחדש את התאים בארבע פעמים 10 עד חמישי תאים לכל 100 מיקרוליטר.

לאחר מכן, מערבבים 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים עם מיקרו RNA פלואורסצנטי בצינור ומעמיסים את התערובת לקוביית אלקטרופורציה. לאחר מכן בצע אלקטרופורציה באמצעות תוכנית G009 באלקטרופורטור. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים מחומם מראש והעביר את כל נפח תרחיף התאים לבאר של שקופית תא תחתון מזכוכית ארבע בארות.

תרבית התאים ליום אחד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני. לאחר חימום מראש של חממת המיקרוסקופ והפעלת מערכת הקונפוציה, הכנס את שקופית החדר למחזיק הדגימה של הבמה. השתמש במטרת שמן של 1.4 ננומטר ובאור עירור לייזר של 561 ננומטר, בעוצמת לייזר נמוכה, עם טווח זיהוי של 570 עד 680 ננומטר כדי למצוא את אשכול הקרדיומיוציטים העוברים טרנסוויקט.

לאחר מכן, במנהל ההתקנה, הפעל את כפתורי z-stack, סדרות זמן, הלבנה ואזורים. לאחר מכן, כדי להגדיר את פרמטרי ה- frap, בתפריט מצב הרכישה, הגדר את גודל המסגרת ל- 512 על 512, את שלב הקו לאחד ואת זמן הסריקה לפחות משנייה אחת. בתפריט הערוצים, התאם את הגדרות עוצמת הלייזר, ההיסט והרווח כדי להשיג פלואורסצנטיות מקסימלית מעירור לייזר מינימלי, כדי למנוע רוויה בעוצמה.

לאחר מכן, הגדר את גודל חור הסיכה לשני מיקרומטרים. לאחר מכן, בתפריט האזורים, בחר בכלי הציור roy והשתמש בסמן כדי לסמן את תא היעד, תא ההתייחסות ואזור הרקע. במידת הצורך, בחר מספר תאי יעד להלבנת תמונות.

בתפריט ההלבנה, התאם את הגדרות הלבנת התמונות. לאחר מכן, בתפריט z-stack, הגדר את המגבלות לרכישת z-stack, בהתאם לעובי התאים. התאם את מספר שכבות z ל-12 tp 15, לאחר מכן, התחל את ניסוי ה-frap ורשום את התאוששות הקרינה.

כדי לנתח את הנתונים, צור הקרנה מקסימלית של ערימות ה-z שנרכשו באמצעות תוכנה ספציפית למיקרוסקופ, לחץ על עיבוד, הקרנה בעוצמה מקסימלית, בחר קובץ, החל. לבסוף, העתק את נתוני עוצמת הקרינה בכל נקודות הזמן מהמטרה, הרקע ותא הייחוס, לגיליון אלקטרוני ובצע ניתוח נתונים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. מוצגים כאן, קרדיומיוציטים מבודדים עם דפוס אלפא אקטינין מפוספס טיפוסי ופלאקים גדולים של קונקסין43, לאורך גבולות התא לגבולות התא.

כמה לא-קרדיומיוציטים היו נוכחים בתרבית. כפי שניתן לראות כאן, על ידי ציטומטריית זרימה, הושגה יעילות טרנסבקציה של 45%. בנוסף, מאמר חי-מת, גילה שרוב התאים הפגינו כדאיות גבוהה, וזה חשוב בעת ניתוח תקשורת צומת פערים.

לניתוח frap, תאי יעד נבחרים בתוך אשכול תאים ומולבנים בפוטו עם 100% עוצמת לייזר, מה שמוביל להפחתת הקרינה של מיקרו RNA בתאים שנבחרו. ניתוח כמותי ונורמליזציה של הנתונים הנרכשים, הראו התאוששות ממוצעת של 20%בניסוי זה, siRNA מתווך נוקדאון של connexin43, הוביל להפחתת ביטוי החלבון ולעיכוב תקשורת צומת הפער. התאוששות הקרינה הופחתה ביותר מ-50%, מה שמצביע על כך שהיעילות של העברת miro RNA תלויה מאוד בצימוד צומת הפער בין התאים.

איור זה מציג עיבוד משטח תלת מימדי של ניסוי frap. בהשוואה לתחזיות מקסימליות, ניתן להשתמש ברכישת ערימות z ליצירת שחזורים תלת מימדיים כדי לחקור את הלוקליזציה והניידות של מיקרו RNA בתוך התאים. לאחר השליטה, ניתן לבצע מדידות frap תוך שעתיים-שלוש אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לבחור תאי מטרה שיש להם מספר דומה של תאים שכנים. יתר על כן, יש לבחור את פרמטרי ההלבנה ותנאי רכישת התמונה שלי כדי למנוע השפעות פוטוטוקסיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במיקרוסקופ פראפ, על מנת לכמת ולדמיין את תנועת המיקרו RNA בתוך אשכולות תאים.