Name: מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: למד מידול מוות עצביים ונזק תאי בנוירונים גרגר מוח הקטן של עכברים. פרוטוקול זה מאפשר בידוד וגידול תרביות ראשוניות לחקר מנגנוני פציעה עצבית ומחלות ניווניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה ומענקים המכון הקנדי של בריאות המחקר איי-איי

פרוטוקול זה מבוסס על שינויים של הליכים שהיו שתוארה לעיל 18 , 24 , 25 , 26 , 27. פרוטוקול זה אושרה על ידי הוועדה אכפת לי חיה ב אוניברסיטת מקגיל.
 1. הכנה ניסיוני הערה: הפתרונות הבאים מניות ניתן להכין, נשמר עד שימוש.
<ol><li>פתרון דיסקציה <ol><li>התמוססות 3.62 g של נתרן כלורי (NaCl), 0.2 גרם אשלגן כלורי (אשלגן), g 0.069 של סודיום פוספט (NaH 2 PO 4 &#8729; H 2 O), ו- g 1.306 של D-(+)-גלוקוז ב 500 מ ל מזוקקים H 2 O. לאחר מכן להוסיף מ"ל מאגר HEPES, µL 450 בפתרון פנול אדום ולאחר 20 מ של BSA שבר V הפתרון. התאם ל pH 7.4 באמצעות N 1 נתרן הידרוקסידי (NaOH).</li>
		<li>Sterilize עם מסנן מיקרומטר 0.22, חנות ב 4 º C. פתרון זה יישאר יציב למשך עד שבוע עד עשרה ימים.</li>
	</ol></li> <li>טריפסין <ol><li>להכין פתרון מניות בריכוז של 25 גרם/ליטר של טריפסין ב- 0.9% נתרן כלורי. לאחסן את הפתרון ב-20 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>מעכבי טריפסין <ol><li>להכין מלאי עם ריכוז של 10 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 1 גר' עוף ביצה לבן מעכבי טריפסין ב- 100 מ של 1 מ מ HCl. חנות פתרון זה ב-20 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>DNase <ol><li>להמיס 100 מ ג של DNase 1 ב 10 מ"ל מים סטריליים כדי לייצר מלאי 10 מ"ג/מ"ל. לאחסן את הפתרון ב-20 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>MgSO 4 <ol><li>להוסיף 6.02 גר' מגנזיום גופרתי (MgSO 4) 50 מ של מים מזוקקים (H 2 O) כדי ליצור מניה 1 מ'. לאחסן את הפתרון ב-4 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>CaCl 2 <ol><li>לפזר 0.735 גר' סידן כלורי (CaCl 2 &#8729; 2 H 2 O) ב- 50 מ של מזוקקים H 2 O כדי ריכוז מניות של 100 מ מ. לאחסן פתרון ב-4 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>אשלגן כלורי <ol><li>g 3.7275 התמוססות של אשלגן כלורי ב- 50 מ של מזוקקים H 2 O כדי ריכוז מניות של 1 מ' חנות פתרון ב-4 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>D-(+)-גלוקוז <ol><li>לפזר 1.802 גר' D-(+)-גלוקוז ב 50 מ של מזוקקים H 2 O כדי ריכוז מניות של 100 מ מ. לאחסן פתרון ב-4 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>תא תרבות המדיה <ol><li>להכין תא תרבות המדיה כדלקמן: 5 מ של חום לא פעיל דיאליזה סרום שור עוברית, µL 500 של 200 מ מגלוטמין, 100 µL של 50 מ"ג/מ"ל Gentamycin ו- 1 מ"ל של 1.0 M אשלגן כלורי צריך להתווסף 45 מ ל מסנן של עיקור הנשר &#39; s מינימלי הכרחי התקשורת (E-מ) כי השלים עם 1.125 g/L D-גלוקוז להפקת 50 מ של גרגר אסטרוציטומה נוירון תרבות המדיה. לאחסן מדיה ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>ציטוזין Beta-D-Arabino Furanoside <ol><li>לפזר 48 מ ג של ציטוזין furanoside beta-D-arabino ב- 10 מ"ל של צמיחה מדיה ריכוז מניות של 20 מ מ. לאחסן פתרון ב-20 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>פולי-D-ליזין <ol><li>כדי ליצור מבחן פוליגרף 2 מ"ג/מ"ל מניות D-ליזין, להוסיף 10 מ של סטרילי H 2 O 20 מ ג של פולי D-ליזין. מניות פוליפוני D-ליזין צריך להיות מאוחסן ב- 80 ° C ב- 100 µL aliquots.</li>
	</ol></li> <li>הערה: הפתרונות הבאים צריך להיות מוכן לפני ניתוח, נשמר ב 4 ° C עד שימוש.</li>
	<li>MgSO-4 פתרון דיסקציה Supplemented <ol><li>µL להוסיף 300 של MgSO מניות 4 כדי 250 מ של פתרון לנתיחה.</li>
	</ol></li> <li>טריפסין לנתיחה פתרון <ol><li>µL להוסיף 100 מניות טריפסין, µL 12 MgSO מניות 4 עד 10 מ"ל של פתרון לנתיחה.</li>
	</ol></li> <li>1 פתרון מעכבי טריפסין <ol><li>164 להוסיף µL של מעכבי טריפסין מניות, µL 250 של מניות DNase 1 12 µL של MgSO מניות 4 עד 10 מ"ל של פתרון לנתיחה.</li>
	</ol></li> <li>2 פתרון מעכבי טריפסין <ol><li>1040 להוסיף µL של מעכבי טריפסין מניות, µL 750 מניות DNase 1 µL 12 מניות MgSO4 עד 10 מ"ל של פתרון לנתיחה.</li>
	</ol></li> <li>CaCl 2 בתוספת לנתיחה פתרון <ol><li>להוסיף 10 µL של CaCl מניות 2 ו 25 µL של MgSO מניות 4 עד 10 מ"ל של פתרון לנתיחה.</li>
	</ol></li> <li>מנות תרבות מצופה D-ליזין פוליפוני <ol><li>כדי מעיל תרבות מנות לדלל µL 100 מניות צביעה D-ליזין ב 40 מיליליטר סטרילי H 2 O. 35 מ מ כעת תרבות מנות, להוסיף 2 מיליליטר מדולל פוליפוני פתרון D-ליזין. עבור 4 צלחות. ובכן, להוסיף µL 300 של פולי מדולל D-ליזין מכל קידוח.</li>
		<li>תן המצב D-ליזין פוליפוני לשעה לפני כ רפה בעברית ושטיפת אחד טוב עם 4 מ"ל או 600 µL (עבור 35 מ מ תרבות מנות או 4 טוב צלחות, בהתאמה) של סטרילי H 2 O. אז תשאף את H 2 O. ותני את האוויר מנות בעבור ה' 1</li>
	</ol></li></ol> 2. המוח החילוץ, בידוד של המח <ol><li>Decapitate 6-7 ביום pup העכבר הישן באמצעות מספריים עריפת ראש. לבצע ניתוח המוח בשכונה תרביות רקמה סטרילי.</li>
	<li>כדי להסיר את המוח, תופסים את הראש באמצעות זוג מלקחיים, לחתוך העור כלפי החלק הפנימי. של הראש באמצעות מספריים microdissection כפי שמתואר באיור 1. ואז לחתוך עצם הגולגולת בעזרת זוג מספריים חדשים כדי למזער את הסיכון של זיהום. הסר את הגולגולת המכסים את המוח באמצעות מלקחיים, להקניט המוח באמצעות מלקחיים או מרית.
	<ol><li>לפי הצורך, לחתוך דרך עצב הראייה כדי להקל על הסרת המוח כולו.</li>
	</ol></li> <li>למקם את המוח הפתרון לנתיחה אשר השלים עם MgSO 4. לשמור את הפתרון ואת המוח על קרח</li>
	<li>הבאות המוח להסרת, תחת מיקרוסקופ לנתיחה, לנתח את המוח הקטן מהמוח תוך עדיין בפתרון דיסקציה של MgSO 4 בתוספת, להסיר את קרומי המוח באמצעות מלקחיים משובחים. המוח הקטן על הצד הגחון שלו ולפנות להבטיח הסרה של מקלעת דמית העין.</li>
	<li>מאגר של cerebella לתוך תבשיל 35 מ מ המכיל ~ 1 מ"ל של MgSO 4 בתוספת לנתיחה פתרון.</li>
	<li>קוצצים את הרקמה לחתיכות קטנות ולהעביר לתוך צינור 50 מ ל המכיל 30 מ של MgSO 4 buffered לנתיחה פתרון.</li>
</ol> 3. העכבר אסטרוציטומה גרגר נוירון בידוד, Culturing <ol><li>Centrifuge הצינור 50 מ ל המכיל הרקמה המוחית קצוצים עבור 5 דקות-644 x g ו- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע והוסף 10 מ"ל של טריפסין לנתיחה פתרון. . אז תלחצו את הצינור במהירות גבוהה למשך 15 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להוסיף 10 מ"ל של פתרון מעכבי טריפסין 1 שפופרת, רוק בעדינות על 2 דק.</li>
	<li>Centrifuge הצינור עבור 5 דקות-644 x g ו- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע והוסף 2 מיליליטר פתרון מעכבי טריפסין 2 ולאחר מכן העברת צינור 15 מ"ל.</li>
	<li>Triturate הרקמה בצינור 15 מ"ל עד הפתרון נעשית עכורה. אז תן להסתפק 5 דק</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע ברור ולהעביר את תגובת שיקוע צינור חדש המכיל 1 מ"ל של CaCl 2 בתוספת לנתיחה פתרון.</li>
	<li>להוסיף עוד מ של פתרון מעכבי טריפסין 2 לתחתית הצינור המכיל בגדר מהשלב 3.6. Triturate שוב ולתת מסתפק 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע והוסף אותו אל הצינור המכיל את תגובת שיקוע מהשלב 3.7 (זה שידור חוזר של צעדים 3.6-3.7). חזור על תהליך זה עד רוב הרקמה מכנית חלופה מועדפת-</li>
	<li>הוסף mL 0.3 CaCl 2 בתוספת לנתיחה פתרון לאוסף supernatant עבור כל גרם של תגובת שיקוע.</li>
	<li>לערבב את תכולת השפופרת, צנטריפוגה ואז במשך 5 דקות ב- g x 644...</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע, להוסיף 10 מ של מדיה טריים בגדר ומערבבים.</li>
	<li>התאים עשויים להיות ואז נספרים, מדולל על ריכוז של 1.5 x 10 6 תאים למ"ל. אנא שימו לב כי באופן כללי 10 מיליון תאים צפויים מהמוח כל גזור, תלויים trypsinization את היעילות של ניתוח. צלחת תאים על צלחות שבוצעה בעבר פוליפוני D-ליזין. עבור לוחות 4-ובכן, צלחת 0.5 mL, נותן 7.5 x 10 5 תאים לכל טוב. עבור מנות 35 מ מ, צלחת 4 מ"ל, נותן 6 x 10 6 תאים לכל צלחת-</li>
	<li>לאחר 24 h, להוסיף ציטוזין-β-arabino furanoside (AraC) הלוחות כדי לצמצם זיהום גליה. µL 0.5 מ מ 20 AraC נדרש עבור כל גרם של מדיה. תוספת של AraC אינו דורש שינוי מדיה. אם תאים תישמר במשך 7-8 ימים, לחזור על טיפול זה ביום 3-</li>
	<li>לשמור על תרבויות חממה 2 CO 5% ב 37 מעלות צלזיוס, להאכיל עם 100 µL של גלוקוז 100 מ מ נוספו התרבות עבור כל 2 מ"ל של מדיה כל יומיים חמישה ימים. שינוי בתקשורת מלאה אינה נדרשת.</li>
</ol> 4. אריזה lentivirus, טיהור, טיטור הערה: הפרוטוקול עבור אריזה, ריכוז, טיהור טיטור של lentivirus בעבר תיאר בפירוט ללא השימוש של ערכת 28, כולל שיטות אלטרנטיביות עבור טיטור, כגון cytometry זרימה 29. כאן אנו מציגים בקצרה את פרוטוקול המשמש במעבדה שלנו לייצור lentivirus ללמוד הפגיעה העצבית באמצעות פתרון טיהור וירוס מהירה וערכת טיטור lentiviral qPCR.
<ol><li>Hek293T צלחת תאים במנות תרבות 10 ס מ עם Dulbecco &#39; s ששינה הנשר &#39; s מינימלי הכרחי בינוני (DMEM) בתוספת 10% FBS. להשגת כייל נוגדנים גבוה ויראלי, לגדול לפחות 5 צלחות Hek293T תאים עבור כל תרביות תאים. ודא כי ביום של תרביות תאים תאים הם 70% confluent. לשנות מדיה שלוש שעות לפני תרביות תאים.</li>
	<li>עבור כל תרביות תאים, להכין שני צינורות. צינור 1 להוסיף 1.5 mL MEM מופחת סרום ומדיה µL 41 של ריאגנט תרביות תאים, מערבבים היטב. צינור 2, הוסף 1.5 מ של סרום MEM-מופחתת מדיה ו 6 µg של העברת פלסמיד, µg 6 של וקטור pCMV-dR8.2 (אריזה פלסמיד), µg 3 pCMV-VSV-G וקטור (מעטפה פלסמיד) 35 µL של ריאגנט enhancer p3000 (מסופק עם lipofectamine). לערבב היטב, וצינורות לשלב 1 ו- 2, מערבולת, תקופת דגירה של 15 דקות</li>
	<li>להסיר 50% של המדיה Hek293T צלחות ולהוסיף מתחמי DNA-השומנים לתאים. תקופת דגירה של 6-אייץ ' ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. להסיר את המדיה, להחליף 5 מ של DMEM טריים, דגירה בין לילה.</li>
	<li>פוסט-תקנים h-24, לאסוף מנה ראשונה של תגובת שיקוע ויראלי כל צלחת. למנוע מהתקשורת ויראלי ב 4 ° C, הוסף 5 מ של מדיה חדשה לתוך כל צלחת של תאים Hek293T. דגירה בין לילה.</li>
	<li>48 שעות לאחר תרביות תאים, לאסוף את הקבוצה השנייה של תגובת שיקוע ויראלי, ולשלב אותו עם הקבוצה הראשונה, צנטריפוגה תגובת שיקוע נגיפי המשולב 10 דקות ב 600 x g...</li>
	<li>לסנן את תגובת שיקוע דרך מסנן עם גודל הנקבוביות מיקרומטר 45.</li>
	<li>לטהר את הנגיף באמצעות פתרון טיהור וירוס מהירה. עבור כל 45 מ של תגובת שיקוע ויראלי, הוסף 5 מ של איגוד lentiviral פתרון, מיקס צנטריפוגה 10 דקות ב &#62; 5,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע בזהירות כדי לא להפריע בגדר.</li>
	<li>להוסיף 20-40 µL בינוני, מחדש להשעות את גלולה. Aliquot וחנות ב-80 מעלות צלזיוס</li>
	<li>כדי להשיג את כייל נוגדנים lentiviral, ערכת טיטור lentiviral qPCR משמש. למהול 2 µL של וירוס מטוהרים ב µL 500 ל- PBS. להוסיף 2 µL של הנגיף מדולל 18 µL וירוס פירוק מאגר (המסופק בערכה).</li>
	<li>סט 3 שונים התגובות q-RT-PCR ב triplicates, לתייג אותם כמו שליטה lysate, חיובי ויראלי 1 (STD1), בקרה חיובית 2 (STD2). עבור כל תגובה להוסיף, µL 12.5 של x 2 qPCR MasterMix, µL 2.5 מהם נגיפי lysate או STD1 (המסופק בערכה) או STD2 (המסופק בערכה), µL 10 של ריאגנט-mix (המסופק בערכה) ב- 0.2 מ"ל המבחנות.</li>
	<li>להגדיר את תוכנית ה-PCR כדלקמן: 20 דקות ב 42 ° C עבור שעתוק במהופך, 10 דקות ב 95 ° C להפעלת האנזים, 40 מחזורי 15 s ב 95 ° C עבור דנטורציה ו- 1 דקות ב- 60 ° C עבור חישול/סיומת.</li>
	<li>לחשב את כייל ויראלי באמצעות נוסחה זו: 
	כייל של נגיפי lysate = 5 x 10 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1). 
	אקס = ערך Ct הממוצע של המדגם לא ידוע, Ct1 = ערך הממוצע של STD1, Ct2 = ערך הממוצע של STD2. 
	הערה: CGNs יכול להיות הטוב ביותר transduced עם lentiviruses או נגועים adenoviruses בהתאם למצב של פגיעה נחקר. תוספת של lentiviruses ב MOI של 2-3 תא תרבות פתרון בזמנו של ציפוי משמש ללמוד NMDA המושרה איתות ביום 7 של התרבות. התוצאה היא יותר מ 80% התמרה חושית, ראוי להמשיך עם ניתוח הביוכימי של הנוירונים הללו ( איור 2). תוספת של adenoviruses ביום 5 של תרבות (בגיל MOI 50) ולימוד NMDA המושרה איתות-יום 7-8 משמש טכניקות אחרות כגון הדמיה. טיפול זה מתבטא פחות מ 10% זיהום של נוירונים, שהופך אותו אידיאלי עבור הדמיה ולוקליזציה שיתוף של חלבונים. Adenoviruses ניתן בזמנו של ציפוי ללמוד מוות תאי DNA נזק הנגרם על-ידי תוספת של camptothecin-יום 2-3 או סטרס חמצוני על ידי תוספת של חמצן. נוכחותם של חלבונים קרינה פלואורסצנטית (GFP, RFP, CFP או YFP) מתויג אל הגן עניין יכול לשמש כדי להעריך את אחוז התמרה חושית, רעילות פוטנציאלית. עם למשרד הפנים מומלץ, אנו רואים רעילות מינימלית המרבי התמרה חושית ( איור 3).</li>
</ol> 5. מידול הפגיעה העצבית <ol><li>לזירוז NMDA המושרה excitotoxicity עצביים, לאחר 7 ימים במבחנה, לטפל CGNs עם 100 מיקרומטר NMDA ו- 10 מיקרומטר גליצין עבור ה 1 החלף כל המדיום בינוני ממוזגים מתרבויות מקבילים ללא טיפול. זה ריכוז תוצאות ב- 50% מוות תאי-24 שעות לאחר הטיפול ( איור 3C). פיצול מיטוכונדריאלי מתבטא ב- 6-8 שעות לאחר הטיפול (ראה Jahani-Asl. et al. 26 , 27).</li> <li>כדי לגרום מוות תאי ROS-induced (סטרס חמצוני), מתייחסים נוירוns עם 75-100 מיקרומטר מימן על-חמצני (H 2 O 2), המתג ממוזגים מדיה מתרבויות מקבילים בעקבות חשיפה 5 דקות H-2-O-2. הערה, עקב חוסר היציבות של 2 O H 2, למטב את הריכוז לרמה שגורם מוות של תאים 50-70% בתרבות לאחר 24 שעות של טיפול-</li>
	<li>לזירוז DNA נזק מוות תאי המושרה, לטפל CGNs עם 10 מיקרומטר camptothecin. ריכוז זה גורם יותר מאשר מוות של תאים 50% ב- 24 ח' פיצול מיטוכונדריאלי ומתרחשת איתות מוות מוקדם 2-3 h לאחר תוספת של camptothecin בריכוז זה (ראה Jahani-Asl. et al. 18)</li> <li>לזירוז נמוך + K המושרה עצביים אפופטוזיס CGNs, לשנות את המדיה המכילה 25 מ מ K + למדיה אשלגן נמוכה עם 5 מ מ K + לאחר 7 ימים במבחנה.</li></ol>

<ol><li>Goldowitz, D., Hamre, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+and+molecules+that+make+a+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The cells and molecules that make a cerebellum.</a> Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).</li>
<li>Contestabile, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+granule+cells+as+a+model+to+study+mechanisms+of+neuronal+apoptosis+or+survival+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro.</a> Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).</li>
<li>Bilimoria, P. M., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultures+of+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cultures of cerebellar granule neurons.</a> CSH Protoc. , (2008).</li>
<li>Kramer, D., Minichiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+of+primary+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell culture of primary cerebellar granule cells.</a> Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).</li>
<li>Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+neurobiology+of+neuronal+development%3A+the+cerebellar+granule+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell.</a> Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).</li>
<li>Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neural+patterning+and+specification+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum.</a> Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).</li>
<li>Evans, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+signalling+in+cerebellar+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptic signalling in cerebellar plasticity.</a> Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).</li>
<li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors%3A+mechanisms+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).</li>
<li>Arundine, M., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+calcium-dependent+neurodegeneration+in+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity.</a> Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).</li>
<li>Szydlowska, K., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2C+ischemia+and+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium, ischemia and excitotoxicity.</a> Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).</li>
<li>Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+joining+forces+to+thwart+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: joining forces to thwart cell death.</a> Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).</li>
<li>Rego, A. C., Oliveira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+reactive+oxygen+species+in+excitotoxicity+and+apoptosis%3A+implications+for+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).</li>
<li>Wei, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proapoptotic+BAX+and+BAK%3A+a+requisite+gateway+to+mitochondrial+dysfunction+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death.</a> Science. 292 (5517), 727-730 (2001).</li>
<li>Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+ischemic+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of ischemic brain damage.</a> Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).</li>
<li>Coyle, J. T., Puttfarcken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+glutamate%2C+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders.</a> Science. 262 (5134), 689-695 (1993).</li>
<li>Cole, K., Perez-Polo, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+trauma+model%3A+in+search+of+Thanatos%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal trauma model: in search of Thanatos.</a> Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).</li>
<li>Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+in+the+regulation+of+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death.</a> Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).</li>
<li>Jahani-Asl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+protects+cerebellar+granule+neurons+against+injury-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death.</a> J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).</li>
<li>Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+depolarization+in+the+survival+and+differentiation+of+cerebellar+granule+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture.</a> J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).</li>
<li>Miller, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+deletion+further+orders+the+cell+death+pathway+in+cerebellar+granule+cells+and+suggests+a+caspase-independent+pathway+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death.</a> J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).</li>
<li>Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+cerebellar+granule+neurons+undergoing+apoptosis+by+potassium%2Fserum+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation.</a> Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).</li>
<li>Piccioli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nuclear+factor-kappaB+activation+induces+apoptosis+in+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells.</a> J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).</li>
<li>D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+apoptosis+in+cerebellar+granule+neurons+by+low+potassium%3A+inhibition+of+death+by+insulin-like+growth+factor+I+and+cAMP%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).</li>
<li>Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).</li>
<li>Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maintenance+and+identification+of+mouse+cerebellar+granule+cells+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture.</a> Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).</li>
<li>Jahani-Asl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK5+phosphorylates+DRP1+and+drives+mitochondrial+defects+in+NMDA-induced+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death.</a> Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).</li>
<li>Jahani-Asl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+inner+membrane+GTPase%2C+optic+atrophy+1+%28Opa1%29%2C+restores+mitochondrial+morphology+and+promotes+neuronal+survival+following+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity.</a> J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. (32), (2009).</li>
<li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li>
<li>Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+cerebellar+granule+neurons+in+vitro+and+in+vivo+to+study+neuronal+morphology+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן אנו מספקים שיטה פשוטה culturing של נוירונים גרגר אסטרוציטומה העכבר הראשי (CGNs), הפסד ורווח של תפקוד לימודי, מידול מנגנונים שונים של מוות של תאים. מספר גורמים משפיעים על הפארמצבטית את התוצאות באמצעות הליך זה דורש ניטור קרוב. אלה כוללים את הטוהר של תרבות כולל חיסול של תאי גליה בתרבות, המפגש של התרבות, ושמירה על תאים בריאים. היכרות עם השתנות של גורמים אלה יכולים הטיה התוצאות ואתגר את הפארמצבטית. להלן נתאר כיצד למזער את הגורמים להשפיע לרעה על התוצאות.
כדי לחסל תאי גליה מתרבות CGNs ולהקים אוכל...

גרגר אסטרוציטומה נוירונים (CGNs) מאופיינים היטב בתרבות, שמשו כמודל יעיל ללמוד מוות עצביים ו פיתוח 1,2,3,4,5, 6. הביטוי מוקדם של N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) קולטנים CGN תרבויות במבחנה גורם להם מודל אטרקטיבי ללמוד NMDA-induced איתות. ההפעלה של רצפטורים אלו עם NMDA בשיתוף עם ממברנה דפולריזציה משמשת למדל גירוי פיזיולוגי פעילות. עצבית, אפשרה למחקר לתוך מנגנוני הפלסטיות הסינפטית 7,8. להפך, גירוי יתר של רצפטורים אלו על ידי ליגנד NMDA יכול לשמש לדגם excitotoxicity, מנגנון מרכזי של אובדן עצביים חריפה נזק מוחי, ניווניות מחלות 9. מנגנון אחד אינדוקציה של excitotoxicity היא דרך ATP רעב עם חמצן מופחתת, כפי ראו בפציעה חריפה עצביים. התוצאה היא ממברנה דפולריזציה, רמות גבוהות של גלוטמט לשחרר את הסינפסה. Overstimulation הבאים של קולטן NMDA על ידי תוצאות מוגברות גלוטמט מופרז Ca2 + זרם דרך רצפטורים אלו, אשר בתורו מפעיל כמה מסלולים כולל Ca2 +-להפעיל פרוטאזות, phospholipases, ו endonucleases, וכתוצאה מכך השפלה בלתי מבוקרת של רכיבים קריטיים הסלולר, מוות של תאים. בנוסף, גבוהה תאיים Ca2 + מוביל הדור של רדיקלים חופשיים של חמצן, נזק מיטוכונדריאלי 10,11.
בעוד הרוב המכריע של אובדן עצביים בעקבות NMDA-induced excitotoxicity עצביים בשל זרם סידן והוא באקס/באק עצמאית, מנגנונים אחרים של מוות של תאים לא ייכללו מודל זה. המראה של שניהם עם נמק, מוות כמו מוות של תאים עקב excitotoxicity נובע חלקית הדור של מינים חמצן תגובתי (ROS) ו- DNA נזק שנגרם על ידי גבוהה תאיים Ca2 רמות 12. נזק לדנ א תוצאות במוות עצביים באמצעות מנגנונים אפופטוטיים להיפגע, להיות בקורלציה עם ההיכר של מוות של תאים אפופטוטיים להיפגע, כגון הופעת גושים כרומטין וגופים אפופטוטיים להיפגע. אינדוקציה של אפופטוזיס מתווך דרך השחרור של ציטוכרום c של המיטוכונדריה, הוכח להיות תלויים באקס/באק oligomerization 13. Oligomerization באקס/באק מקדם נקבובית היווצרות ממברנה מיטוכונדריאלי החיצוני, וכתוצאה מכך ציטוכרום c לשחרר את ההפעלה של הרגולטורים פרו-אפופטוטיים להיפגע כפי שניתן לראות עם פציעה קלה איסכמי 14.
דור של ROS היא נושא משמעותי במוח עקב אנדוגני רמות נמוכות של נוגדי חמצון, יחד עם הדרישה חמצן גדול עצביים מתפקדים 15. כאשר נחשף אירוע איסכמי, סינתאז תחמוצת החנקן הוא upregulated, בייצור ניטריק אוקסיד והגברת מינים חמצן תגובתי 14. ריכוז מוגבר של רדיקלים של חמצן יכול לגרום נזק לדנ א ולגרום בעקיפין אנרגיה הרעבה. רמות גבוהות של מעברי כפול גדילי הדנ א הם לתקן על ידי הפעלת poly ADP-ריבוז פולימראז 1 (PARP-1), חלבון כרומטין מכורך האיקריוטים אחראי ותזרז את ההעברה של ADP-ריבוז יחידות מ- NAD+, תהליך חלק בלתי נפרד ה-DNA תיקון 16. עם זאת, עם נזק מופרז עקב סטרס חמצוני, עלולים PARP-1 הפעלת אנרגיה רעב עקב הניקוז המוגבר ב- NAD+, מצע הדרושים לייצור ATP באמצעות זרחון חמצוני. בסופו של דבר, סטרס חמצוני יפעילו אפופטוזיס באופן תלותי באקס/באק שמוביל מיטוכונדריאלי ציטוכרום c שחרור, הוכח לגרום נערכו מיטוכונדריאלי CGNs 17.
בסופו של דבר, שינויים בריכוז של אשלגן כלורי (אשלגן) בתרבויות CGN ניתן ליצור מודל דפולריזציה/אשלגן נמוכה מתווכת אפופטוזיס 18,19,20. כאשר הם נחשפים לרמות נמוכות של K+, CGNs עוברים שינויים פיזיולוגיים ברורים, וכתוצאה מכך הנחות של נשימה מיטוכונדריאלי והן גליקוליזה, לייחס הסלולר ירד הביקוש 21, וכן הפחתת רמות של גרעיני גורם-κB (NFκB) אשר מסדיר פעילויות כולל דלקת, הסינאפסית 22. המודל הזה הוא עניין מיוחד לצורך המחקר של מוות תאי במהלך ההתפתחות העצבית. הסביבה K+ נמוך באופן הדוק יותר דומה בתנאים פיזיולוגיים, וגורם ההיכר של מוות של תאים במהלך ההתפתחות העצבית 23.
לסיכום, CGNs מספקות מודל ארוכת שנים לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של מוות עצביים והתנוונות. להלן כללי התנהגות יאפשר בידוד, culturing של CGNs, ביטוי או דיכוי של שביל גנטי מסוים באמצעות וירוסים, אינדוקציה של המוות עצביים באמצעות מנגנונים שונים המייצגים הפגיעה העצבית והתנוונות.

<table><tbody><tr><td>ערכת טיטרציה לנטיוויטרלית qPCR&nbsp;</td><td>ABM</td><td>#LV900</td><td></td></tr><tr><td>פתרון מהיר לטיהור וירוסים&nbsp;</td><td>ABM</td><td>#LV999</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2</td><td>Addgene</td><td>#8455</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-VS.VG</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>#15230162</td><td></td></tr><tr><td>200 מ"מ L-גלוטמין&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>#25030081</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחות תרבות Nunc</td><td>Gibco</td><td>#174913</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR Green Master</td><td>Mix Life Technologies</td><td>#A25742</td><td></td></tr><tr><td>BSA V Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A-8412</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &bull; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#C-7902&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Camptothecin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#C-9911</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין חלבון ביצת עוף&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>#10109878001</td><td></td></tr><tr><td>ציטוזין בטא-D-ארבינו פוראנוזיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>#C-1768</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>#G-7528</td><td></td></tr><tr><td>DNase1&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Eagle-minimal</td><td>Essential Medium Sigma Aldrich</td><td>#M-2279</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G-5417</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי שעבר דיאליזה מומת בחום&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>#F-0392</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פס&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ</td><td>'#H-0887</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>סיגמא אולדריץ</td><td>'#216763</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ג/מ"ל גנטמיצין&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>#G-1397</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>#M-2643</td><td></td></tr><tr><td>N-מתיל-D-חומצה אספרטית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>#M-3262</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פנול אדומה&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>#P-0290</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#T-4549</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>p3000 מגיב משפר</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת בינוני</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr>#CABDH9258 <tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr>#CABDH9286 <tr><td>NaH2PO4H2O&nbsp;</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr>#CABDH9298 <tr><td>פולי די-ליזין&nbsp;</td><td>VWR</td> <td>#89134-858</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>#319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Wisent</td><td>#080-450</td><td></td></tr></tbody></table>

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

גרגר אסטרוציטומה נוירונים (CGNs) הם מודל עצביים נפוץ, ויוצרים אוכלוסיה הומוגנית שופע המוח הקטן. לאור שלהם אחרי לידה, שפע ופיתוח נגישות, CGNs הם מודל אידיאלי ללמוד תהליכים עצביים, כולל פיתוח עצביים, הגירה העצבית של גירוי פיזיולוגי פעילות. עצבית. בנוסף, תרבויות CGN לספק מודל מצוין ללימוד מצבים שונים של מוות של תאים כולל excitotoxicity ואפופטוזיס. בתוך שבוע בתרבות, CGNs מבטאים קולטנים N-מתיל-D-אספרטט (NMDA), קולטן ספציפי ionotropic גלוטמט עם פונקציות קריטיות רבות של מחלה ובריאות עצביים. התוספת של ריכוזים נמוכים של NMDA בשיתוף עם ממברנה דפולריזציה לתרבויות CGN ראשי מכרסם שימש לדגם גירוי פיזיולוגי פעילות. עצבית בעוד התוספת של ריכוזים גבוהים של NMDA יכול להיות מועסק לדגמן excitotoxic הפגיעה העצבית. . הנה, מתוארים שיטה של בידוד, culturing של CGNs בן יום 6 גורים, כמו גם מניפולציה גנטית של CGNs על ידי adenoviruses ו lentiviruses. אנו גם נוכח פרוטוקולים ממוטבת כיצד לעורר NMDA-induced excitotoxicity, נמוך-אשלגן-induced אפופטוזיס, סטרס חמצוני, נזק לדנ א בעקבות התמרה חושית של נוירונים אלה.

עם ניתוח זהיר, המוח ללא פגע להסירה עם נזק מינימלי כפי שניתן לראות באיור 1 א'-ב'. מאמץ יש לנקוט כדי למזער את הנזק במוח במהלך ההסרה, במיוחד נזק במוח הקטן. פגיעה המוח הקטן הופך קשה יותר וזיהוי הסרה מלאה של קרומי המוח, מגבירה את הסבירות של זיהום של התרבות עצביים. ברגע הוסרו קרומי המוח, המוח הקטן יכול להיות גזור מן הרקמה הנותרת כפי שניתן לראות באיור 1C ו מוכן דיסוציאציה.
<p class="jove_content" fo:keep-together.wi...

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד ואת culturing נוירונים גרגר מוחי העכבר הראשי (CGNs) מן הגורים בת 6-7 יום, התמרה חושית יעילה של CGNs להפסד ורווח של תפקוד לימודי, דגמי NMDA-induced excitotoxicity עצביים, מוות של תאים נמוך-אשלגן-induced נזק לדנ א, לחץ חימצוני באמצעות המודל באותה תרבות.

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק אוכלוסיות טהורות ובריאות של נוירונים גרנולריים מהמוח הקטן (cerebellar granule neurons), לבצע בהן מניפולציות גנטיות ולדגמן מנגנונים שונים של פגיעה נוירונלית בתרבית ראשונית in vitro. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפגיעה הנוירונלית. אנו משתמשים בפרוטוקול זה כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס פגיעות עצביות בעקבות נזק מוחי חריף ומחלות נוירו-דגנרטיביות.היתרון המרכזי של פרוטוקול זה הוא שבאמצעות מערכת תרבית זו נוכל למדל מנגנוני מוות תאיים שונים, כגון אקסיטוטוקסיסיות (excitotoxicity), עקה חמצונית, נזק ל-DNA ואירועים התפתחותיים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי פגיעה עצבית, ניתן להשתמש בה גם עם נוירונים מהמוח הקטן של חולדה כדי לחקור פעילות נוירונלית ומורפוגנזה בתגובה לגורמי גדילה ולאירועים צדדיים. כדי להוציא את המוח של עכבר בן שישה עד שבעה ימים, השתמשו בפינצטה כדי לאחוז בראש, ובמספרי מיקרו-דיסקציה, גזרו את העור קדימה לכיוון הראש.דחפו את העור לאחור כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר מכן, חדרו לגולגולת בעזרת קצה המספריים וגזרו קדימה (anteriorly) ובצורה צדית (laterally). תוך הקפדה על מניעת נזק לדגיש (cerebellum) וכדי להקל על זיהוי והסרה של קרומי המוח (meninges), השתמשו בפינצטה כדי לקלף את הגולגולת ולחשוף את המוח.בעזרת פינצטה או שפתולה (spatula), הוצא בעדינות את המוח אל תוך תמיסת ניתוח קרה. כדי לבודד את המוח הקטן (cerebellum), הנח את המוח בתמיסת ניתוח המועשרת במגנזיום סולפט ושמור את התמיסה ואת המוח על קרח. תחת מיקרוסקופ ניתוח, הסר את הקרומים (meninges) באמצעות פינצטה עדינה, ולאחר מכן בודד את המוח הקטן מהמוח בתמיסת ניתוח המועשרת במגנזיום סולפט.פעולה זו מסייעת בהסרת שאריות הקרומים (meninges) ומאפשרת חדירה בין השכבות כדי לנקות את קפלי המוח הקטן (cerebellar folds). נוכחות של קרומים בתרבית נוירונלית מובילה לתאים לא בריאים ולמוות תאי בסופו של דבר. לפיכך, חשוב להבטיח הסרה מלאה של הקרומים לפני המעבר לשלב התרבית.לאחר מכן, הפכו את המוחיכון לצדו הגחוני (ventral) וודאו כי הפלקסוס הכורואידי (choroid plexus) הוסר. לאחר מכן, העבירו את המוחיכונים לכלי קיבול בנפח 35 מילימטר המכיל מיליליטר אחד של תמיסת דיסקציה מועשרת במגנזיום סולפט. קצצו את הרקמות לחלקים קטנים והעבירו אותן לפרוט רכז בנפח 50 מיליליטר המכיל 30 מיליליטר של תמיסת דיסקציה עם בופר של מגנזיום סולפט.בשלב זה, סבבו במערך צנטריפוגה את המבחנה בנפח 15 מיליליטר המכילה את רקמת המוח הקצוצה למשך חמש דקות ב-644 ×g ובטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, הסירו את העילוי והוסיפו 10 מיליליטר של תמיסת טריפסין לדיסקציה. לאחר מכן, נערו את המבחנה על שולחן רעידה במהירות גבוהה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 °C.הוסיפו שני מיליליטרים של תמיסת מעכב טריפסין 1 למבחנה ונערו בעדינות במשך שתי דקות. לאחר מכן, סבבו את המבחנה בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-644 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, הסירו את העילאי, והוסיפו שני מיליליטרים של תמיסת מעכב טריפסין 2 לפני ההעברה למבחנה של 15 מיליליטר.לאחר מכן, דפקו (triturate) את הרקמה בתוך המבחנה בנפח 15 מיליליטר עד שהתמיסה תהפוך לעכורה. הניחו לה לשקוע במשך חמש דקות. לאחר מכן, הסירו את העלייה (supernatant) הצלולה והעבירו אותה למבחנה חדשה המכילה 1 מיליליטר של תמיסת דיסקציה מועשרת בcalcium chloride.הוסיפו שני מיליליטרים נוספים של תמיסת מעכב טריפסין 2 לתחתית המבחנה המכילה את המשקע. בצעו טריטורציה (ערבוב על ידי שאיבה) פעם נוספת והמתינו חמש דקות לשקיעה. הסירו את הנוזל העליון והוסיפו אותו למבחנה המכילה את הנוזל העליון מהשלב הקודם.חזור על תהליך זה עד שרוב הרקמה תעבור דיסוציאציה מכנית. הוסף למבחנה לאיסוף העל-נוזל (supernatant) 0.3 מיליליטר של תמיסת דיסקציה מועשרת בסידן כלוריד עבור כל מיליליטר של על-נוזל. ערבב את תכולת המבחנה ולאחר מכן סבב במערך צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-644 ×g בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הסר את הנוזל העליון. הוסף 10 milliliters של מצע טרי למשקע וערבב. לאחר מכן ספור את התאים החיים ודלל אותם לריכוז של 1.5 times 10 to the six תאים ל-milliliter.פרוס את התאים על פלטות הפולי-D-ליזין שהוכנו מראש. עבור פלטות בעלות ארבעה בארות, פרוס 0.5 millimiters מהדגימה, כך שיהיו 7.5 times 10 to the fifth תאים לכל בארה. עבור צלחונות בקוטר 35 millimeter, פרוס ארבעה milliliters מהדגימה, כך שיהיו six times 10 to the sixth תאים לכל צלחון.עבור לוחות כיסוי, פזרו 0.5 מיליליטר המכילים 7.5 × 10⁵ תאים לבאר. לאחר 24 שעות, הוסיפו AraC לצלחות כדי להפחית זיהום גליאלי. אם התאים אמורים להישמר למשך שבעה עד שמונה ימים, חזרו על טיפול זה ביום השלישי ושמרו את התרביות באינקובטור עם 5% CO2 בטמפרטורה של 37 °C.עבור תרביות שנשמרות למשך יותר מחמישה ימים, יש להזין את התרבית בגלוקוז מדי יומיים החל מהיום החמישי. כדי להשרות רעילות עصبית (excitotoxicity) באמצעות NMDA, לאחר שבעה ימים in vitro, יש לטפל בתאי הגרנול של המוחד 작은 (cerebellar granule neurons) בריכוז של 100 micromolar NMDA ו-10 micromolar glycine למשך שעה אחת. לאחר מכן, יש להחליף את המצע במצע מותנה (conditioned medium) מהתרביות המקבילות שלא קיבלו טיפול.ריכוז זה גורם למות של 50% מהתאים 24 שעות לאחר הטיפול. עבור מוות תאי המונחה על ידי ROS, יש לטפל בנוירונים במימן פרוקסיד בריכוז של 75 עד 100 micromolar למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, יש להחליף את המצע למצע מותנה מתרביות מקבילות.בשל חוסר היציבות של מימן פרוקסיד, יש לאפטימיזציה את הריכוז לרמה המשרה בין 50% ל-70% מוות תאי לאחר 24 שעות. ריכוז זה הוא בדרך כלל בין 75 ל-100 micromolar. כדי להשרות מוות תאי באמצעות נזק ל-DNA, יש לטפל בנורונו של גרניולות בשבכית (cerebellar granule neurons) ב-10 micromolar של camptothecin כדי להשרות יותר מ-50% מוות תאי בתוך 24 שעות.עבור השראת אפו פטוזה נוירונלית על ידי ריכוז נמוך של אשלגן בנוירונים גרנולריים של המוח הקטן, יש להחליף את המצע המכיל 25 millimolar אשלגן למצע עם ריכוז נמוך של חמישה millimolar אשלגן לאחר שבעה ימים in vitro. הנוירונים עברו טרנסדוקציה עם לנטי-וירוס עבור RFP ב-MOI של שלושה בזמן הזריעה. התאים קובעו ונצבעו לאחר שבעה ימים in vitro.הלוקליזציה המשותפת (co-localization) של אות RFP, MAP2 ו-Hoechst מוצגת כדי להדגים נוירונים בריאים שעברו טרנסדוקציה מלאה על ידי לנטי-וירוסים. התמונות המוצגות כאן מייצגות ניתוחים של בדיקת חיים-מוות (live-dead assay) של נוירונים שהודבקו ב-MOI שונה של אדנו-וירוס כדי למדוד רעילות. הדבקת נוירוני גרנולות של המוח הדגיא (Cerebellar granule neurons) באדנו-וירוס המבטא LacZ ב-MOI שבין 25 ל-50 מאפשרת יעילות מקסימלית תוך שמירה על רעילות מינימלית.נראה הבדל של פחות מ-1% בהישרדות התאים בהשוואה לביקורת כאשר מדביקים בריכוז MOI זה. איורים אלו מראים את צביעת ה-Hoechst של נוירוני גרנולות של הדגירי (cerebellar granule neurons) בביקורת ושל נוירוני גרנולות של הדגירי שטופלו ב-NMDA כדי להשרות מוות תאי. שימו לב להיווצרות של גרעינים פיקנוטיים (pyknotic nuclei) בעקבות הטיפול ב-NMDA.זוהי אינדיקציה למות תאים, שניתן לראות בכ-50% מהתרבית 24 שעות לאחר טיפול עם 100 micromolar NMDA ו-10 micromolar glycine. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים וחצי עם שישה דגימות עכברים, אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע טכניקה זו, חשוב להשתמש בשיטות עבודה אספטיות ובמכשור כירורגי סטרילי כנדרש, על מנת למזער את הסיכון לזיהום התרבית.לאחר פיתחו, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי העצבים ללמוד על התפתחות נוירונלית ופגיעה נוירונלית בנוירונים ראשוניים של עכבר. לאחר צפייה בסרטון זה, תוכלו לבצע תרבית של נוירונים גרנולריים מהמוח הקטן, לבצע עבורם מניפולציה גנטית באמצעות וירוסים ולהשרות מנגנונים שונים של פגיעה עצבית. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אימונופלורסצנציה או בדיקות חיוניות תאים, כדי לענות על שאלות כגון האם גן מסוים משפר את הישרדות התאים בתגובה לאקסיטוטוקסיות, למעקה חמצוני או לנזק ל-DNA.

modeling-neuronal-death-degeneration-mouse-primary-cerebellar-granule

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מציגים שיטה לבודד cerebellar תרבות גרגר עצב ובתאים ונוירונים גרגיר cerebellar מהעכבר לאחר הלידה.

בידוד תרבות שלאחר הלידה cerebellar עכבר גרגיר Neuron ובתאים ונוירונים

סרטון זה מדגים את הטכניקה לבידוד וטיפוח נוירונים ראשוניים של גרגרי המוח הקטן בעכבר. תאים מטופלים עם antimetabolite לחסל תאי גליה מתרבים ולייצר תרבות טהורה של נוירונים גרגיר cerebellar.

בידוד ותרבית של נוירונים גרגיריים צרבלריים ראשוניים של עכבר

סרטון זה מדגים את יצירתו של מודל פגיעה עצבית בנוירונים ראשוניים של גרגרי המוח הקטן בעכברים. הוא מתאר את השלבים המעורבים בגרימת פגיעה עצבית באמצעות NMDA, אגוניסט קולטן נוירוטרנסמיטר מעורר, וגליצין, אגוניסט משותף. NMDA וגליצין נקשרים לקולטנים עצביים ספציפיים, גורמים לגירוי יתר שלהם וכתוצאה מכך זרם סידן תוך תאי מסיבי, מה שמוביל לנזק לתאי עצב ולמוות.

מידול פגיעה עצבית בתאי עצב גרגיריים צרבלריים ראשוניים בעכבר

סרטון זה מתאר את היצירה של מודל פגיעה עצבית באמצעות מיני חמצן תגובתי (ROS) בנוירונים גרגיריים צרבלריים ראשוניים של עכברים. הוא מפרט את התהליך של גרימת עקה חמצונית על ידי הוספת ריכוזים גבוהים של מי חמצן. חשיפה ל-ROS גורמת לשברים בגדילי הדנ"א ולחוסר יציבות גנומית. בנוסף, חמצון חלבונים תאיים פוגע בתפקודם, בעוד חמצון שומנים פוגע בשלמות הממברנה. מפל זה מוביל לשחרור ציטוכרום c והפעלת קספז, וכתוצאה מכך אפופטוזיס עצבי.

מידול מוות עצבי של חמצן תגובתי בתאי עצב של גרגרי המוח הקטן בעכבר

מקור: ChanU., et al., שימוש באלקטרופורציה שלאחר הלידה in vivo כדי לחקור את המורפולוגיה של נוירוני גרגיר המוח הקטן והתפתחות סינפסות. J. Vis. Exp. (2021).סרטון זה מדגים את הניתוח של התפתחות נוירונים של גרגירי המוח הקטן על ידי הדמיית פרוסות רקמת מוח קבועות מראש מעכברים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי, לכידת תמונות z-stack ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, ומדידת פרמטרים מבניים כולל אורך נויריט, היווצרות טפרים דנדריטיים, שטח פנים ונפח לחקר סינפטוגנזה.

הדמיית הסינפטוגנזה של נוירונים גרגירי המוח הקטן בשלבי התפתחות שונים

המורפוגנזה ונדידת נוירונים הן אירועים מכריעים שבבסיס התפתחות מוח תקין. כאן אנו מתארים שיטות לתמרן גנטי נוירונים בתרבית המוח הקטן גרגיר והמוח קטן מתפתח להערכה של מורפולוגיה ומאפייני נדידה של תאי עצב.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

השכבה החיצונית של המוח הקטנה הגרגר היא האתר של ההגברה המעבר הגדולה ביותר במוח המתפתח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול למקד שינוי גנטי לשכבה זו בשיאו של שגשוג באמצעות vivo electroporation והתרבות של פרוסות המוח הקטן לשעבר מעובר חומוס עוברי יום 14.

אקס תרבות Vivo של פרוסות המוח הקטן אפרוח וממוקד מרחבית Electroporation של מבשרי תא גרגיר

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד במדויק הכדאיות העצבית באמצעות fluorescein diacetate (FDA) ו Propidium Iodide (PI) מכתים פעמיים בתרבית נוירונים גרגר cerebellar, התרבות העצבית הראשית המשמשת במודל חוץ גופית בתחום מדעי המוח ומחקר neuropharmacology.

הערכת הכדאיות העצבית באמצעות פלואורסצין Diacetate-Propidium יודיד מכתים פעמיים Cerebellar גרגר Neuron תרבות

ניהול ניסויים בלתי מתורבת כדי לשקף את התנאים הvivo ככל האפשר, אינו משימה קלה. השימוש בתרביות תאים ראשונית הוא צעד חשוב להבנת הביולוגיה התאית באורגניזם שלם. הפרוטוקול שסופקו מתאר כיצד לצמוח בהצלחה תרבות עובריים העכבר מתחלקים נוירונים.

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

כאן אנו מתארים שיטה לדמיין סינפטוגנזה של נוירונים גרגיריים במוח הקטן של העכבר במהלך הזמן של התפתחות המוח לאחר הלידה, כאשר תאים אלה משכללים את המבנים הסינפטיים שלהם ויוצרים סינפסות כדי לשלב את עצמם במעגל המוח הכולל.

שימוש באלקטרופורציה לאחר הלידה של In Vivo לחקר מורפולוגיה של נוירון גרגיר המוח הקטן והתפתחות סינפסה

למד מידול מוות עצביים ונזק תאי בנוירונים גרגר מוח הקטן של עכברים. פרוטוקול זה מאפשר בידוד וגידול תרביות ראשוניות לחקר מנגנוני פציעה עצבית ומחלות ניווניות.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

גלה סרטונים נוספים