מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד ואת culturing נוירונים גרגר מוחי העכבר הראשי (CGNs) מן הגורים בת 6-7 יום, התמרה חושית יעילה של CGNs להפסד ורווח של תפקוד לימודי, דגמי NMDA-induced excitotoxicity עצביים, מוות של תאים נמוך-אשלגן-induced נזק לדנ א, לחץ חימצוני באמצעות המודל באותה תרבות.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר אוכלוסיות טהורות בריאות של נוירונים גרגירים במוח הקטן ולבצע בהם מניפולציה גנטית ולדגמן מנגנונים שונים של פגיעה עצבית בתרבית ראשונית במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפגיעה העצבית. אנו משתמשים בפרוטוקול זה כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של פגיעות עצביות בעקבות נזק מוחי חריף ומחלות נוירו-גנרטיביות.

היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שאנו יכולים למדל מנגנונים שונים של מוות תאים כגון אקסיטוטוקסיות, מתח חמצוני, נזק ל-DNA ואירוע התפתחותי באמצעות מערכת התרבית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי פגיעה עצבית, ניתן להשתמש בה גם עם נוירונים במוח הקטן של חולדה כדי לחקור פעילות עצבית ומורפוגנזה בתגובה לגורמי גדילה ואירועי לוואי. כדי לחלץ את מוחו של עכבר בן שישה עד שבעה ימים, השתמשו בזוג מלקחיים כדי לתפוס ראש, ובעזרת מספריים מיקרו-דיסקציה, חתכו את העור מלפנים לכיוון הראש.

דחוף את העור לאחור כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר מכן, חודרים לגולגולת עם קצה המספריים וחותכים קדימה ולרוחב. הקפידו לא לפגוע במוח הקטן, ולהקל על זיהוי והסרה של קרומי המוח, ואז השתמשו במלקחיים כדי לקלף את הגולגולת ולחשוף את המוח.

בעזרת זוג מלקחיים או מרית, הקניטו בעדינות את המוח לתמיסת דיסקציה קרירה. כדי לבודד את המוח הקטן, הניחו את המוח בתמיסת הדיסקציה בתוספת מגנזיום גופרתי ושמרו את התמיסה ואת המוח על קרח. תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, הסר את קרומי המוח באמצעות מלקחיים עדינים, ולאחר מכן נתח את המוח הקטן מהמוח בתמיסת דיסקציה בתוספת מגנזיום גופרתי.

זה עוזר בקילוף קרומי המוח הנותרים ומאפשר לעבור בין שכבות כדי לנקות את קפלי המוח הקטן. נוכחות קרומי המוח גורמת לתרבית עצבית לגרום לתאים לא בריאים ובסופו של דבר למוות של תאים. ככזה, חשוב להקפיד על הסרה מוחלטת של קרומי המוח לפני שתמשיך בתרבות.

לאחר מכן, סובב את המוח הקטן לצד הגחון שלו והבטיח את הסרת מקלעת הכורואיד. לאחר מכן, משוך את המוח הקטן לכלי בגודל 35 מילימטר המכיל מיליליטר אחד של תמיסת דיסקציה בתוספת מגנזיום גופרתי. קוצצים את הרקמות לחתיכות קטנות ומעבירים אותן לצינור של 50 מיליליטר המכיל 30 מיליליטר של תמיסת דיסקציה מגנזיום גופרתי.

בשלב זה, צנטריפוגה את צינור ה-15 מיליליטר המכיל את רקמת המוח הקצוצה למשך חמש דקות ב-644 פעמים גרם, וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט והוסף 10 מיליליטר תמיסת דיסקציה טריפסין. לאחר מכן נענע את השולחן במהירות גבוהה למשך 15 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

הוסף שני מיליליטר של תמיסת מעכב טריפסין אחד לשפופרת ונדנד בעדינות במשך שתי דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור למשך חמש דקות בטמפרטורה של 644 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, הסר את הסופרנטנט, והוסף שני מיליליטר של תמיסת מעכבי טריפסין שתיים לפני העברתו לשפופרת של 15 מיליליטר.

לאחר מכן יש לשלש את הרקמה בצינור של 15 מיליליטר עד שהתמיסה הופכת עכורה. תן לזה להתייצב במשך חמש דקות. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט השקוף והעביר אותו לצינור חדש המכיל מיליליטר אחד של תמיסת דיסקציה בתוספת סידן כלוריד.

הוסף עוד שני מיליליטר של תמיסת מעכב טריפסין שתיים לתחתית הצינור המכיל את הגלולה. שלשו אותו שוב ותנו לו להתייצב במשך חמש דקות. הסירו את הסופרנטנט והוסיפו אותו לשפופרת המכילה סופרנטנט מהשלב הקודם.

חזור על תהליך זה עד שרוב הרקמה מתנתקת מכנית. הוסף 0.3 מיליליטר של תמיסת דיסקציה בתוספת סידן כלוריד לאוסף הסופרנטנטים עבור כל מיליליטר של סופרנטנט. מערבבים את תכולת הצינור ואז צנטריפוגה למשך חמש דקות ב 644 פעמים G בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט. מוסיפים 10 מיליליטר מדיה טרייה לגלולה ומערבבים. לאחר מכן ספרו את התאים החיים ודללו אותם לריכוז של 1.5 כפול 10 לששת התאים למיליליטר.

צלחת את התאים על לוחות הפולי D-ליזין שהוכנו בעבר. עבור ארבע צלחות באר, צלחת 0.5 מילימטר של הדגימה נותנת 7.5 כפול 10 לתאים החמישיים לבאר. עבור מנות של 35 מילימטר, צלחת ארבעה מיליליטר מהדגימה, נותנת שש פעמים 10 לתאים השישיים לצלחת.

עבור תלושי כיסוי, צלחת 0.5 מיליליטר נותנת 7.5 כפול 10 לתאים החמישיים לבאר. לאחר 24 שעות, הוסף AraC לצלחות כדי להפחית את זיהום הגליה. אם יש לשמור על התאים במשך שבעה עד שמונה ימים, חזור על טיפול זה ביום השלישי ושמור על התרביות באינקובטור של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

עבור התרביות שנשמרות יותר מחמישה ימים, האכילו את התרבית בגלוקוז כל יומיים החל מהיום החמישי. כדי לגרום לאקסיטוטוקסיות עצבית עם NMDA, לאחר שבעה ימים במבחנה, טפל בתאי העצב של גרגירי המוח הקטן עם 100 NMDA מיקרומולרי ו-10 גליצין מיקרומולרי למשך שעה. לאחר מכן, החלף את המדיום במדיום מותנה מהתרבויות המקבילות ללא טיפול.

ריכוז זה גורם למוות של 50% תאים 24 שעות לאחר הטיפול. עבור מוות תאים המושרה על ידי ROS, טפל בתאי העצב במי חמצן בטמפרטורה של 75 עד 100 מיקרומולר למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, העבירו אותו למדיה המותנית מתרבויות מקבילות.

בשל חוסר היציבות של מי חמצן, יש לייעל את הריכוז לרמה הגורמת למוות תאים בין 50 ל-70% לאחר 24 שעות. ריכוז זה בדרך כלל בין 75 ל -100 מיקרומולר. כדי לגרום למוות תאים על ידי נזק ל-DNA, טפל בתאי העצב של גרגירי המוח הקטן עם 10 קמפטולצין מיקרו-מולרי כדי לגרום למוות של יותר מ-50% תאים תוך 24 שעות.

עבור אפופטוזיס עצבי המושרה על ידי אשלגן נמוך בנוירונים של גרגירי מוח קטן, שנה את המדיה המכילה אשלגן 25 מילימולרית למדיום אשלגן נמוך עם אשלגן של חמישה מילימולר לאחר שבעה ימים במבחנה. נוירונים הומרו עם lentivirus ל-RFP ב-MOI של שלושה בזמן הציפוי. תוקן והוכתם בשבעה ימים במבחנה.

הוכח כי הלוקליזציה המשותפת של אות RFP MAP2 והוכסט מדגימה נוירונים בריאים המומרים במלואם על ידי לנטי-וירוסים. התמונות המוצגות כאן מייצגות ניתוחי בדיקה של מתים חיים של נוירונים הנגועים ב-MOI שונה של אדנו-וירוס למדידת רעילות. נוירונים של גרגירי המוח הקטן הנגועים באדנווירוס המבטאים LacZ ב-MOI בין 25 ל-50 מאפשרים יעילות מקסימלית תוך שמירה על רעילות מינימלית.

הבדל של פחות מ-1% בהישרדות התאים בהשוואה לביקורת נראה בעת הדבקה ב-MOI זה. נתונים אלה מראים את צביעת הוכסט של נוירוני גרגיר המוח הקטן ונוירוני גרגירי המוח הקטן שטופלו ב-NMDA כדי לגרום למוות תאי. שימו לב להיווצרות גרעינים פיקנוטיים עם טיפול NMDA.

זוהי אינדיקציה למוות תאי וניתן לראות אותה בכ-50% מהתרבית 24 שעות לאחר הטיפול ב-100 מיקרו-מולרי NMDA ו-10 מיקרו-מולרי גליצין. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים וחצי עם שישה קפיצות עכבר, אם מבוצעת כראוי. בעת ביצוע טכניקה זו, חשוב להשתמש בטכניקה אספטית ובמכשירים כירורגיים משורשרים כנדרש על מנת למזער את הסיכון לזיהום תרבית.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור התפתחות עצבית ופגיעה עצבית בתאי עצב ראשוניים של עכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לתרבית נוירונים גרגירים במוח הקטן, לתפעל אותם גנטית באמצעות וירוסים ולגרום למנגנונים שונים של פגיעה עצבית. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונופלואורסצנציה או בדיקות כדאיות תאים כדי לענות על שאלות כמו האם גן מעניין משפר את הישרדות התאים בתגובה לאקסיטוטוקסיות, מתח חמצוני או נזק ל-DNA.