Quadunple Immunostaining של הנורה חוש הריח עבור ויזואליזציה של חוש הריח חושפת אקסון מולקולרית קודי זהות
5 ביוני 2017
חוש הריח נוירונים חושיים מבטאים מגוון רחב של מולקולות מיון האקסון להקים מעגלים עצביים נאותים. פרוטוקול זה מתאר שיטת מכתים immunohistochemical לדמיין ביטויים קומבינטוריים של מולקולות מיון האקסון ב טרמיני האקסון של נוירונים חושית חוש הריח.
המטרה הכוללת של שיטת צביעה אימונוהיסטוכימית זו היא לדמיין ביטוי משולב של מולקולות מיון אקסונים בקצה האקסון של נוירונים חושי ריח. שיטה זו יכולה לסייע באפיון תהליכים מרכזיים בתחום התפתחות חוש הריח, כגון הנחיית אקסונים, תצורות סינפסות והתחדשות נוירונים חושיים של חוש הריח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת למדענים להשוות ולנתח את דפוסי הביטוי של מולקולות מיון אקסונים בפקעת הריח מבלי לקיים שונות בין חלקים.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלב ההטמעה, מכיוון שקשה לתאר במילים את המיקום והזווית של דגימת רקמות הריח בתבנית. התחל עם ראשים מעכברים בני שבוע עד שבועיים שתוקנו על ידי זלוף תוך לב של 4% פרפורמלדהיד. הכנס להב מספריים לחלל שבין השיניים העליונות והתחתונות, וחתוך אופקית כדי להסיר את עצם הלסת התחתונה.
לאחר מכן חתוך רקמות עודפות בעזרת מלקחיים ומספריים, כדי לעזוב את רקמת הריח, כולל פקעת הריח ואפיתל הריח. טבלו את רקמת הריח ב-PBS כדי להסיר אוויר בחלל האף, ואז בצעו חתך אנכי כדי להסיר את החלק האחורי של המוח, והניחו את רקמת הריח בתחתית תבנית הטבעה כשהקצה החתוך פונה כלפי מטה. מלאו את התבנית בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית, ולאחר מכן טבלו בחנקן נוזלי.
לאחר שהרקמה וה-OCT קפואים לחלוטין, יש לאזן את הרקמה בקריוסטט ב-20 מעלות צלזיוס למשך שעה. כעת הכינו חלקים פרזגיטליים סדרתיים של נורת הריח עם הקריוסטט, ואספו אותם על ידי הדבקה לשקופיות זכוכית מצופות MAS. לאחר ההדבקה יש לייבש את השקופיות מיד עם מייבש שיער.
התחל צביעה חיסונית על ידי שטיפת השקופיות המיובשות עם PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. חסום אתרי קשירה לא ספציפיים על ידי דגירה של השקופיות למשך שעה עם תמיסת חסימה של 5% בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף 400 מיקרוליטר של קוקטייל של נוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת חסימה של 1% לכל שקופית.
דגרו את המגלשות למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת, השליכו את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטפו את השקופיות עם PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף 400 מיקרוליטר של קוקטייל של נוגדנים משניים ו-PBS לכל שקופית.
יש להגן מפני אור ולדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, השליכו את התמיסה ושטפו שוב את השקופיות שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת עם PBS בטמפרטורת החדר. לבסוף, כיסוי הרכבה מחליק על השקופיות על ידי מריחת שתי טיפות של מדיום הרכבה על כל מגלשה, הנחת החלקת הכיסוי והסרת בועות אוויר.
השג תמונות פלואורסצנטיות עם מיקרוסקופ הקרינה באמצעות המסנן המתאים לכל פלואורופור. התאם את זמן החשיפה כדי לקבל אותות פלורסנט של התמונה ללא רוויה. הגדר את המבנה הגלומרולרי על ידי אותות אימונופלואורסצנטיים של GLUT2.
השתמש בתמונה J כדי למדוד את עוצמות הצביעה של מולקולות מיון אקסונים בתוך גלומרולים. תמונה זו מציגה קטע של פקעת ריח פרה-סאגיטלית מעכבר בן שבועיים עם נוגדנים נגד VGLUT2, Kirrel2 מוצג באדום, Semaphorin 7A מוצג בירוק ו-OLPC בכחול. התמונה הממוזגת מדגימה כי מולקולות מיון האקסונים המעורבות בהפרדה גלומרולרית באות לידי ביטוי בתבנית פסיפס בלתי תלויה במיקום.
כל גלומרולוס מוגדר על ידי אותות פלואורסצנטיים של הסמן הפרה-סינפטי VGLUT2. המבנים הגלומרולרים מוקפים בקווים מקווקוים. עוצמות האותות של מולקולות מיון אקסונים נמדדו בכל גלומרולוס.
כפי שניתן לראות כאן, מולקולות מיון אקסונים מתבטאות באופן דיפרנציאלי בכל גלומרולוס. לדוגמה, לגלומרולוס 3 יש רמות גבוהות של OLPC, רמות ביניים של סמפורין 7A ורמות נמוכות יותר של Kirrel2, וניתן לכמת את ההבדל הזה על ידי מדידת עוצמת הצביעה. ואילו לגלומרולוס 4 יש רמות גבוהות של OLPC, ורמות נמוכות יותר של Kirrel2 ו-Semaphorin 7A.
שוב, ניתן לכמת את ההבדל הזה על ידי מדידת עוצמת הצביעה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשמיט קיבוע לאחר עם PFA, וטיפול בתמיסת סוכרוז, המומלצים בדרך כלל. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד למקם יותר גלומרולי על החלק של פקעת הריח היחידה, וכיצד לבצע צביעה חיסונית באיכות גבוהה עם נוגדנים מרובים, שאפשר ליישם על אזורים אחרים במוח.
אל תשכחו לקוות, שיטה זו תעזור לכם להצליח בניסויים העתידיים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
פרוטוקול זה מתאר שיטת צביעה אימונוהיסטוכימית לדמיית הביטוי של מולקולות מיון אקסונים בקצוות האקסונים של נוירונים חושיים ריחיים. טכניקה זו חיונית להבנת תהליכי התפתחות חוש הריח כגון הכוונת אקסונים והיווצרות סינפסות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירו-מדע
- התפתחות חוש הריח
- אימונו-היסטוכימיה
רקע
- נוירונים חושיים ריחיים ממלאים תפקיד מרכזי בחוש הריח.
- מולקולות מיון אקסונים חיוניות להקמת מעגל עצבי נכון.
- הבנת דפוסי הביטוי שלהן יכולה לספק תובנות לגבי תפקודי מערכת הריח.
- דמיית ביטויים אלו יכולה לסייע בחקר תהליכי התחדשות בנוירונים חושיים ריחיים.
מטרת המחקר
- לדמות את הביטוי המשולב של מולקולות מיון אקסונים.
- לאפיין תהליכים מרכזיים בהתפתחות החוש הריח.
- לאפשר השוואה של דפוסי ביטוי בבולב הריח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקת צביעה אימונו-היסטוכימית.
- שימוש בראשי עכברים בגיל שבוע עד שבועיים.
- החדרה תוך-לבבית עם פרפורמלדהיד 4% לצורך קיבוע.
- הטמעה וחתך של דגימות רקמת חוש הריח.
תוצאות עיקריות
- דמייה מוצלחת של ביטויי מולקולות מיון אקסונים.
- הוכח היכולת לנתח דפוסי ביטוי ללא שונות בין חתכים.
- סיפק שיטה ברורה להטמעת רקמות חוש הריח.
- הדגיש את החשיבות של הדגמות ויזואליות ללמידת הטכניקה.
מסקנות
- השיטה האימונו-היסטוכימית יעילה לחקר נוירונים חושיים ריחיים.
- הבנת מולקולות מיון אקסונים יכולה לשפר את הידע אודות התפתחות מערכת הריח.
- טכניקה זו יכולה להוות כלי חשוב למחקר עתידי בתחום התחדשות החוש הריח.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables precise molecular mapping of axon-sorting molecules in the olfactory bulb, supporting target validation in neurodevelopmental research. By allowing quantitative comparison of protein expression patterns across glomeruli without section-to-section variability, it enhances predictive confidence in mechanistic studies of neural circuit formation. The approach provides a scalable, reproducible platform for de-risking hypotheses related to axon guidance and synaptic specificity in preclinical discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of molecular identity codes at axon termini to clarify target engagement mechanisms in olfactory sensory neuron development.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating axon-sorting molecule expression with glomerular organization patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing standardized immunostaining protocols for multiplex protein detection.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent glomerular definition using VGLUT2 as a presynaptic marker.
- Strategic Value: Highlights screening readiness via quantitative intensity measurements that enable reliable comparison of molecular expression across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking axon-sorting molecule codes to neural circuit formation processes applicable to neurodegenerative models.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal analysis of axonal regeneration and reinnervation patterns.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing molecular resolution of axon guidance mechanisms critical for neurotherapeutic development.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing of OR-specific axon guidance through combinatorial molecular code visualization at axon termini.
- Screening: Describes assay readiness through standardized section collection and immunostaining that minimizes technical variation across samples.
- Analytics: Highlights quantitative readouts from ImageJ-based intensity measurements that enable statistical comparison of axon-sorting molecule expression across glomeruli.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling analysis of olfactory regeneration processes relevant to injury models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for multiplex protein profiling in other brain regions beyond the olfactory system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct visualization of molecular determinants of axonal segregation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability achieved via consistent tissue embedding and sectioning protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neural pathway models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative biomarker-like readouts of axon-sorting molecule co-expression patterns.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in immunohistochemistry, cryosectioning, and fluorescent microscopy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including cryostat, fluorescence microscope, and image analysis software.
- Cross-team standardization requirements for antibody validation and staining protocol consistency.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for tissues with different embedding properties.
- Practical limitations include the technical challenge of tissue orientation in embedding molds, which requires hands-on training to master.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
5:42
Conclusion
4:26
Results: Quantification of Axon-sorting Molecules in the Olfactory Bulb
1:11
Preparation of Parasagittal Olfactory Bulb Sections
2:33
Day 1: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:07
Day 2: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:56
The Use of Fluorescence Intensity Measurements
