Quadunple Immunostaining של הנורה חוש הריח עבור ויזואליזציה של חוש הריח חושפת אקסון מולקולרית קודי זהות

המטרה הכוללת של שיטת הסמימה האימונוהיסטוכימית זו היא להדמיות של ביטוי משולב של מולקולות מיון אקסונים בקצוות האקסונים של נוירונים חושיים ריחוניים. שיטה זו יכולה לסייע באפיון תהליכי מפתח בתחום ההתפתחות הריחונית, כגון הנחיית אקסונים, יצירת סינפסות והתחדשות של נוירונים חושיים ריחוניים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת למדענים להשוות ולנתח דפוסי ביטוי של מולקולות מיון אקסונים בבצול ריחוני מבלי להוסיף שונות בין חתכים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון ששלב ההטמעה קשה ללמידה, מאחר שהמיקום והזווית של דגימת רקמת הריח בתבנית קשים לתיאור במילים. התחילו עם ראשים של עכברים בני שבוע עד שבועיים שעברו קיבוע באמצעות פרפוזיה תוך-לבבית של 4%paraformaldehyde. הכניסו להב של מספריים למרווח שבין השיניים העליונות לתחתונות, וחתכו באופן אופקי כדי להסיר את עצם הלסת התחתונה.

לאחר מכן, הסר את עודפי הרקמה באמצעות פינצטה ומספריים, כך שיישאר רק רקמת חוש הריח, כולל הפחב ריחוני (olfactory bulb) והאפיתל הריחוני. טבול את רקמת חוש הריח ב-PBS כדי להסיר אוויר מחלל האף, לאחר מכן בצע חיתוך אנכי להסרת החלק האחורי של המוח, והנח את רקמת חוש הריח בתחתית תבנית הטמעה כאשר הקצה החתוך פונה כלפי מטה. מלא את התבנית בתרכובת OCT (optimal cutting temperature compound), ולאחר מכן טבול אותה בחנקן נוזלי.

לאחר שהרקמה וה-OCT קפאו לחלוטין, יש להביא את הרקמה לטמפרטורת שיווי משקל בתוך הקריוסטט ב-20 degrees celsius למשך שעה אחת. כעת יש לבצע חתכים פרא-סגיטליים סדרתיים של הבצל הריחני באמצעות הקריוסטט, ולאסוף אותם על ידי הדבקה על שקופיות זכוכית מצופות MAS. לאחר ההדבקה, יש לייבש את השקופיות באופן מיידי באמצעות מייבש שיער.

התחילו את הצביעה האימונוהיסטוכימית על ידי שטיפת השקופיות המיובשות ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. חסמו אתרי קישור לא ספציפיים על ידי דגירה של השקופיות למשך שעה אחת עם 5% blocking solution בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו לכל שקופית 400 µL של תערובת נוגדנים ראשוניים המדוללים ב-1% blocking solution.

דגרו את השקופיות למשך לילה בטמפרטורת החדר. למחרת, השליכו את תמיסת הנוגדן הראשוני ושטפו את השקופיות עם PBST שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 400 microliters של תערובת של נוגדנים שניוניים ו-PBS לכל שקופית.

יש להגן מאור ולהדגיר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר ההדגירה, יש להשליך את התמיסה ולשטוף שוב את השקופיות שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם עם PBS בטמפרטורת החדר. לבסוף, יש להניח זכוכיות כיסוי על השקופיות על ידי הוספת שתי טיפות של חומר קיבוע לכל שקופית, הנחת זכוכית הכיסוי והסרת בועות אוויר.

השג תמונות פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, תוך שימוש במסנן המתאים לכל פלואורופור. כוונן את זמן החשיפה כדי לקבל אותות פלואורסצנטיים בתמונה ללא רוויה. הגדר את מבנה הגלומרולס על פי אותות אימונופלואורסצנטיים של GLUT2.

השתמש בתוכנת Image J כדי למדוד את עוצמות הצביעה של מולקולות מיון אקסונים בתוך הגלומרולי. תמונה זו מציגה חיתוך פארא-סגיטלי של בצלול הריח מעכבר בן שבועיים, שנצבע בשיטת אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים נגד VGLUT2, כאשר Kirrel2 מוצגת באדום, Semaphorin 7A מוצגת בירוק, ו-OLPC בכחול. התמונה הממוזגת מדגימה כי המולקולות המעורבות במיון אקסונים לצורך הפרדה גלומרולרית מבוטאות בתבנית פסיפס שאינה תלויה במיקום.

כל גלומרולס (glomerulus) מוגדר על ידי אותות פלואורסצנטיים של הסמן הפרה-סינפטי VGLUT2. המבנים הגלומרולריים מוקפים בקווי מקווקו. עוצמות האות של מולקולות מיון אקסונים נמדדו בכל גלומרולס.

כפי שניתן לראות כאן, מולקולות למיון אקסונים מתבטאות באופן דיפרנציאלי בכל גלומרולוס. לדוגמה, בגלומרולוס 3 קיימות רמות גבוהות של OLPC, רמות בינוניות של Semaphorin 7A, ורמות נמוכות יותר של Kirrel2, וניתן לכמת הבדל זה על ידי מדידת עוצמת הצביעה. לעומת זאת, בגלומרולוס 4 קיימות רמות גבוהות של OLPC, ורמות נמוכות יותר של Kirrel2 ו-Semaphorin 7A.

שוב, ניתן לכמת הבדל זה על ידי מדידת עוצמת הצביעה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשמיט את הקיבוע הפוסט-קיבועי ב-PFA ואת הטיפול בתמיסת סוכרוז, המומלצים בדרך כלל. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן למקם יותר גלומרולי בתוך נתח בודד של הבצל הריחי, וכיצד לבצע צביעה אימונוהיסטוכימית באיכות גבוהה עם מספר נוגדנים, שיטה שניתן ליישם גם באזורי מוח אחרים.

אל תשכחו לקוות, שיטה זו תסייע לכם להצליח בניסוייכם העתידיים.