הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

מטרת הליך זה היא לבודד ולזהות קווי תאי נוקאאוט משובטים שנוצרו על ידי שני סוגים של עריכת גנום בתיווך CRIPSR/Cas9. שיטה אחת מזהה נוקאאוט חלבון הנגרם על ידי חיבור קצה לא הומולוגי ואילו השנייה מזהה הפרעות גנומיות הנוצרות על ידי תיקון מכוון הומולוגיה. שיטה זו שימושית במיוחד בתחום הביולוגיה המולקולרית, שבה יצירת קווי תאים עם הפרעות גנטיות היא כלי חשוב בניתוח תפקוד הגנים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בשיטה מהירה ובעלת תפוקה גבוהה יחסית הניתנת לביצוע בקלות באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית בסיסיות. חיבור קצה לא הומולוגי מציג מחיקות או הוספות קטנות, ומוערך על ידי כתם חיסוני נקודתי, בעוד שתיקון מכוון הומולוגיה מאפשר הפרעות גדולות ומדויקות יותר, ומוערך על ידי PCR מושבה. ניסוי זה משתמש בתאי T-REx-293 שגודלו במדיה DMEM, בתוספת 10% FBS ב-37 מעלות צלזיוס, ו-5% פחמן דו חמצני.

לפני הטרנסבקציה, צלחו את התאים על שש צלחות באר וכללו באר לבקרה לא מועברת. גדל את התאים לכ-70% מפגש. העבר את התאים עם 2.5 מיקרוגרם של פלסמיד כולל באמצעות פרוטוקול טרנסבקציה מסחרי.

לצורך טרנסבקציה של תאים ללא בחירה, השתמש ב -2.5 מיקרוגרם של פלסמיד Cas9-sgRNA. להעברה של תאים עם בחירה, השתמש ב-0.75 מיקרוגרם של Cas9-sgRNA1, 0.75 מיקרוגרם של Cas9-sgRNA2 ומיקרוגרם אחד של תבנית רקומבינציה הומולוגית. דגרו על התאים הטרנסבקטיים והבקרה הלא מועברת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 48 שעות.

עבור תאים שעברו טרנסווקציה עם ברירה, התחל את בחירת התרופה על ידי טיפול בתאים בתרופה המתאימה, שהיא ניאומיצין במקרה זה. החזירו את צלחת שש הבארות לחממה. התבונן בתאים המטופלים פעם ביום כדי לבדוק את שיעורי המוות של התאים, עד שכל התאים בביקורת הלא מועברת מתים.

כדי לבודד אוכלוסיות משובטות, יש לגדל תחילה את התאים למפגש של 100% בבאר המקורית לאחר הבחירה. לאחר מכן, בצע דילולים סדרתיים של התאים וספור את התאים. מכיוון שייצור נכון של מושבות חד-שבטיות הוא המפתח להשגת נוקאאוט מלא, יש להקפיד על קביעת הדילול הנכון לתאי ישיבה בצפיפות הרצויה.

לאחר קביעת הדילול הנכון, הושיבו את התאים בצלחות של 96 בארות בצפיפות של 0.33 תאים לבאר. ישיבה של שלוש צלחות 96=באר היא נקודת התחלה טובה כדי להבטיח בידוד של יותר משיבוט נכון אחד. במשך תקופה של שבועיים עד ארבעה שבועות, התבונן במושבות עד שהמושבות נראות לעין.

תמונות מייצגות אלה מציגות מושבות בשלבי צמיחה שונים. תא בודד בישיבה, תאים ביום החמישי ומושבה מבוססת היטב ביום העשירי. בעזרת קצה פיפטה סטרילי, בחר מושבות גלויות בזהירות ובדייקנות, והתיישב מחדש בבארות חדשות כדי לעודד צמיחה חד-שכבתית.

המשך לגדל את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. מועמדים לנוקאאוט ללא בחירה נבדקים על ידי נקודה אימונו-בלוט כדי להעריך את תוצר החלבון בצורה בעלת תפוקה גבוהה. לאחר גידול שיבוטים בודדים למפגש של 50 עד 100%, עקור את שכבת התאים החד-שכבתית על ידי פיפטינג בתוך הבאר.

יש לשים 90 מיקרוליטר מהנפח הכולל של 100 מיקרוליטר מכל באר לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי. למטרות סרטון זה, רק שתי דוגמאות יעובדו. סובב ב-6,000 סל"ד למשך חמש דקות, הסר את המדיה והשתמש במשטח התא ב-10 מיקרוליטר של מאגר טעינה 1X SDS.

הוסף 90 מיקרוליטר של מדיה חדשה לשאר התאים בבאר, והחזיר את הצלחת לחממה כדי להמשיך להפיץ את התאים. פיפטה מיקרוליטר אחד של ליזאט תאים על קרום ניטרוצלולוזה יבש ליצירת נקודה. כתם כל דגימה פעמיים על שני ממברנות נפרדות, וצור שני דפוסים זהים של דגימות.

חסום את הממברנות בחלב של 5% ב- TBST בטמפרטורת החדר, עם נדנדה, למשך שעה. לאחר שעה, יש לספוג את הממברנות בנוגדנים ראשוניים בדילול הנוגדנים הראשוני המומלץ, ו-TBST בתוספת 5% חלב. על ממברנה אחת השתמש בנוגדנים העיקריים כנגד חלבון המטרה, ELAVL1 בניסוי זה.

על הממברנה השנייה, השתמש בנוגדנים העיקריים לחלבון בקרה שאינו צפוי להשתנות, משתמשים כאן ב-PUM2. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה. הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית מכל כתם, הוסף TBST ודגר למשך חמש דקות.

באופן זה, שטפו את הכתמים שלוש פעמים עם TBST. לאחר מכן, הוסף לכל ממברנה את הנוגדן המשני המצומד המתאים ל-HRP, וכתם בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר שעה יש לשטוף את הממברנות שלוש פעמים עם TBST למשך חמש דקות בכל פעם.

מרחו תמיסת מצע כימילומינסנט על הכתמים, בהתאם להוראות היצרן, ודמו את הממברנות המוכתמות על מצלמת כימילומינסנציה דיגיטלית. לבסוף, כמת את עוצמות הנקודות עבור חלבוני המטרה והבקרה באמצעות התוכנה המתאימה, ונתח את התוצאות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מועמדים עם סמן ההתנגדות הניתן לבחירה נבדקים על ידי PCR מושבה.

התחל הליך זה על ידי שכפול מושבות בודדות בצלחת חדשה של 96 בארות, וגידולם למפגש של 100% להכנת ליזטים של תאים. הסר את המדיה מקבוצה אחת של השיבוטים, השהה מחדש את התאים מכל באר ב-30 מיקרוליטר של מאגר מיצוי מערכת הכנת DNA מסחרית, והעביר לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר. מחממים את התמיסה ל 96 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואז מניחים להתקרר לטמפרטורת החדר.

הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר ייצוב לכל צינור מיקרוצנטריפוגה וערבב היטב. כדי לזהות קווים מוטנטיים מסוג בר ומונואללי או ביאללי על ידי PCR מושבה, תכנן שתי קבוצות נפרדות של פריימרים PCR כדי להגביר אזורים סביב זרועות ההומולוגיה על סמך שילוב מוצלח או לא מוצלח של קלטת ההתנגדות. מכל צד, השתמש בפריימר משותף שמחסל מחוץ לזרוע ההומולוגיה.

כדי לבדוק את האלל מסוג הבר, השתמש בפריימר המשותף עם הפריימר הזוגי המתאים המשלים את הרצף האנדוגני המשתרע על אזור ההומולוגיה. כדי לבדוק את המוטציה הרצויה, השתמש בפריימר המשותף עם פריימר זוגי נוסף, משלים לקלטת ההתנגדות שהוכנה. עבור כל דגימה שתיבדק, הכינו תערובת תגובה המכילה את הדברים הבאים, 0.5 מיקרוליטר ליזאט תאים, 1.25 מיקרוליטר מאגר 10X KOD, 0.75 מיקרוליטר מגנזיום גופרתי 25 מילימולרי, 1.25 מיקרוליטר של שני dNTPs מילימולרי, 0.375 מיקרוליטר פריימר קדמי, 0.375 מיקרוליטר פריימר הפוך, 0.25 מיקרוליטר פולימראז KOD ו-7.75 מיקרוליטר מים.

בצע PCR בתנאים הבאים, 95 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, ולאחר מכן 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, טמפרטורת התכה של פריימר למשך 10 שניות ו-70 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות ל-KB. לאחר מכן, דמיין את מוצרי ה-PCR על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. עריכת גנום באמצעות חיבור קצה לא הומולוגי בוצעה כדי ליצור קווי נוקאאוט של ELAVL1 ואחריהם אימונובלוט נקודתי, חיפוש אחר ELAVL1 ו-PUM2. שיבוטים שהפגינו אות בקרה מועט סומנו ב-X, ולא נכללו בניתוח נוסף.

שיבוטים עם אותות ELAVL1 נמוכים נבדקו עוד על ידי כתם מערבי. מועמדים שאושרו מסומנים בירוק, ומועמדים פסולים מסומנים באפור. גרף זה מציג את היחסים בין ELAVL1 לאות חלבון בקרה בסדר עולה.

ברוב המקרים, אוכלוסיות משובטות עם אות ELAVL1 היחסי הנמוך ביותר זוהו נכון כנוק-אאוט. מועמדים שנוצרו על ידי שיטת התיקון המכוונת ההומולוגיה נבדקו על ידי PCR של המושבה, ומוצרי ה-PCR הודגמו על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. מוצגות תוצאות לדוגמה המשתמשות בפריימרים המשתרעים על צומת האינטגרציה במעלה הזרם באמצעות פריימרים פנימיים אנדוגניים ונוקאאוט בתוך פריימרים.

פריימרים אומתו לראשונה הן בתאי הורה והן בתאים נבחרים בתפזורת. תוצאות מ-24 שיבוטים מועמדים בודדים מוצגות יחד עם דפי הרצועה הצפויים עבור שיבוטי מחיקה מסוג פראי, נוקאאוט ומונואלליים. החצים השחורים מציינים את מוצרי ההגברה הנכונים, כוכבים מציינים שיבוטי נוקאאוט ביאללים.

הקווים המוטנטיים הדו-אלליים אומתו עוד יותר על ידי הכתם המערבי. צירוף קצה לא הומולוגי משתמש בחיתוך Cas9 יחיד ובהקרנה בלתי תלויה בבחירה, ולכן דורש מעט הכנה מראש, וסינון של שיבוטי נוקאאוט על ידי כתמי נקודות יכול לקבוע במהירות אם דור נוקאאוט הצליח. סקר מבוסס PCR מזהה במדויק מועמדים נכונים עם הפרעות גנומיות גדולות שנוצרו על ידי תיקון מכוון הומולוגיה.

טכניקות אלו מאפשרות לחוקרים בביולוגיה מולקולרית לזהות בקלות וביעילות נוקאאוטים, מה שמאפשר להם לחקור תהליכים תאיים נורמליים או לא מתפקדים באמצעות קווי תאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולזהות קווי תאי נוקאאוט משובטים שנוצרו על ידי עריכת גנום בתיווך CRISPR/Cas9.