Name: הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: למד שתי שיטות CRISPR/Cas9 ליצירת קווי תאים knockout בתאי יונקים, באמצעות שחבור לא הומולוגי ותיקון מכוון הומולוגיה. השיטות מאפשרות סינון יעיל של קלונים ללא פונקציית גן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים היו רוצים להודות Gissell Sanchez, מייגן לי, וג &#39;ייסון Estep לסיוע ניסיוני, וייפנג גו ו Xuemei חן על שיתוף ריאגנטים.

<ol><li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).</li>
<li>Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+restriction+enzymes%3A+zinc+finger+fusions+to+Fok+I+cleavage+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).</li>
<li>Bibikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+homologous+recombination+through+targeted+cleavage+by+chimeric+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases.</a> Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).</li>
<li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li>
<li>Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+mediated+by+adeno-associated+virus+and+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks.</a> Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).</li>
<li>Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+effectors%3A+customizable+proteins+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.</a> Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).</li>
<li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501(2009).</li>
<li>Christian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+double-strand+breaks+with+TAL+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases.</a> Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).</li>
<li>Jiang, W., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas%3A+New+Tools+for+Genetic+Manipulations+from+Bacterial+Immunity+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).</li>
<li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li>
<li>Karginov, F. V., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR+system%3A+small+RNA-guided+defense+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea.</a> Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).</li>
<li>Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+genetic+silencing+systems+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea.</a> Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).</li>
<li>Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervening+sequences+of+regularly+spaced+prokaryotic+repeats+derive+from+foreign+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Evol%22%5BJournal%5D)">Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements.</a> J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).</li>
<li>Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+elements+in+Yersinia+pestis+acquire+new+repeats+by+preferential+uptake+of+bacteriophage+DNA%2C+and+provide+additional+tools+for+evolutionary+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies.</a> Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).</li>
<li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321 (5891), 960-964 (2008).</li>
<li>Deltcheva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+RNA+maturation+by+trans-encoded+small+RNA+and+host+factor+RNase+III%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.</a> Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).</li>
<li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li>
<li>Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference+limits+horizontal+gene+transfer+in+staphylococci+by+targeting+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA.</a> Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).</li>
<li>Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-crRNA+ribonucleoprotein+complex+mediates+specific+DNA+cleavage+for+adaptive+immunity+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Davis, A. J., Chen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double+strand+break+repair+via+non-homologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA double strand break repair via non-homologous end-joining.</a> Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).</li>
<li>Guirouilh-Barbat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+KU80+pathway+on+NHEJ-induced+genome+rearrangements+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells.</a> Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).</li>
<li>Moore, J. K., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+and+genetic+requirements+of+two+pathways+of+nonhomologous+end-joining+repair+of+double-strand+breaks+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).</li>
<li>Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology-directed+repair+is+a+major+double-strand+break+repair+pathway+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).</li>
<li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+and+efficient+CRISPR%2FCas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+rAAV-based+gene+targeting+vectors+by+Golden+Gate+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning.</a> Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, . Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> Elife. 3, e04766(2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מערכת CRISPR / Cas9 אפשרה ייצור יעיל של שינויים גנומיים יציבים, המספקים חלופה עקבית יותר לשיטות מניפולציה אחרות. הנה, הצגנו שתי שיטות לזיהוי מהיר של CRISPR / Cas9 גן knockouts בקווים תא יונקים. שתי השיטות דורשות חומר סלולרי קטן, ולכן הבדיקה יכולה להתבצע בשלבים המוקדמים של התרבות המשובצת, חיסכון בזמן ריאגנטים. כדי להגביר את היעילות של שתי השיטות, אנו ממליצים לבדוק sgRNAs מרובים, כמו יעילות להשתנות בהתאם רצף מיקום הגנום. בנוסף, שימוש sgRNAs מרובים הוא שימושי בזיהוי השפעות מחוץ היעד ...

<html> שינויים גנטיים יציבים מספקים יתרון על פני שיטות חולפות של הפרעות סלולר, אשר יכול להיות משתנה ביעילות שלהם משך. עריכה גנומית הפכה נפוצה יותר ויותר בשנים האחרונות עקב התפתחות של נוקלאזות ספציפיות למטרה, כגון נוקלאזות של אבץ אצבע , 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , ו RNA מונחה נוקלאזות הנגזרות, מקובצים בקביעות interinded קצר palindromic חוזר (CRISPR) מערכת 10 . CRISPR / Cas9 מכונות העריכה מותאמת מתוך המערכת החיסונית כי חיידקים ארכאי להשתמש כדי להגן מפני זיהומים ויראלייםהתחת = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 , 13 . בתהליך זה, קצרים, 20-30 nt שברי רצף ויראלי פולש משולבים לתוך לוקוס גנומי כמו &quot;מרווחים&quot; מוקף יחידות חוזרות 14 , 15 . תעתיק לאחר עיבוד RNA מייצר קטן CRISPR הקשורים RNAs 16 (crRNAs) כי, יחד עם הפעלת crRNA 17 (tracrRNA) מפעיל, להרכיב עם endonuclease Cas9 effector. CRRNAs ובכך לספק ספציפיות למיקוד Cas9, המנחה את המתחם לדבק רצפים דנ&quot;א ויראלי משלימה ומניעת זיהומים נוספים 18 , 19 . כל רצף &quot;protospacer&quot; בדנ&quot;א ממוקד יכול לשמש כמקור של ה- CRRNA, כל עוד הוא ישירות 5 &#39;כדי מוטיב קצר סמוך protospacer (PAM), NGG במקרה של S. pyogenes Cas9 <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 20. העדר רצף ה- PAM ליד המרווח באזור של ה- CRISPR המארח מבדיל בין העצמי לבין הלא-עצמי, ומנע את המיקוד של המארח. בגלל האוניברסליות והגמישות שלה, מערכת ביולוגית זו הותאמה בעוצמה לעריכה גנומית, כך שכמעט כל אתר דנ&quot;א הצמוד ל- PAM יכול להיות ממוקד. בגרסה זו, שינוי נוסף התמזגו crRNA ו tracrRNA לתוך RNA מדריך יחידה (sgRNA) רכיב נטען לתוך חלבון Cas9 21 . עם הביטוי של Cas9 ו sgRNA בתאים אוקריוטים, חלבון Cas9 cleaves שני גדילי דנ&quot;א על ​​מוקד ממוקדת. בהיעדר אזור מתאים של רצף הומולוגי, התא מתקן את ההפסקה הזאת באמצעות חיבור לא הומולוגי (NHEJ) 22 , 23 , 24 , אשר בדרך כלל מציג מחיקות קטנות או, לעתים נדירות, כניסות. בעת מיקוד פתוחמסגרת הקריאה, התיקון עלול להוביל frameeshift translational שמייצר מוצר חלבון שאינו פונקציונלי. לעומת זאת, כאשר מסופק עם תבנית אקסוגני עם אזורים גדולים של הומולוגיה, התא יכול לתקן את הפער פעמיים גדיל על ידי הומולוגיה מכוונת לתקן 25 , 26 . נתיב זה מאפשר מחיקות מדויקות יותר, תחליפים או הוספות בגנום, יחד עם הכנסת סמני הבחירה הנבחרים 27 . כאן, אנו מציגים פרוטוקולים ליצירת שורות תאים נוקאאוט על ידי אחד משני אלה CRISPR / Cas9 שיטות ( איור 1 א ). הגישה NHEJ משתמשת באתר חיתוך יחיד sgRNA ובחירה עצמאית ההקרנה, ולכן דורש הכנה מראש upfront. בעת שימוש בשיטה זו, מדריך RNAs משלימים אקסונים ליד הקצה 5 &#39;של התמליל, אשר סביר להניח לייצר נוקאאוט, חייב להיות מתוכנן. מאז modificatיונים לגנום במקרה זה הם קטנים, ההקרנה שיבוטים נוקאאוט מבוסס על כתמים נקודה, שבו המוצר חלבון מוערך בצורה תפוקה גבוהה. אנו משתמשים בדוגמה של ELAVL 1 כמו חלבון 1 (ELAVL1). הגישה השנייה מסתמכת על תיקון הומולוגיה מכוונת (HDR) ומשתמשת בשני אתרי חיתוך sgRNA המשתרעים על פני הגן או אזור העניין, ומאפשרים מחיקות של עשרות קילובייט. פלסמיד עם שני אזורים של הומולוגיה כי האגף אתרי מחשוף מספק תבנית תחליף ( איור 1B ), מציגה סמן התנגדות לבחירה כי מגביר את היעילות של הדור נוקאאוט. שיטה זו יכולה גם להיות מותאם כדי להציג שינויים גנים עם זרועות הומולוגיה מתוכנן כראוי. במקרה זה, שילוב של קטע DNA חדש מאפשר סינון מבוסס PCR ( איור 1C ). כאן, אנו משתמשים הדור של Pumilio RNA מחייב בן משפחה 2 (PUM2) נוקאוט שורות כדוגמה.

<table><tbody><tr><td>ערכת הכנת פלסמיד</td> E. coli מוכשרת <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(BB) פלסמיד</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td>Ran et al. 2013, שיבוט sgRNAs</td></tr><tr><td>BbsI אנזים</td><td>ThermoFisher</td><td>FD1014</td><td>Ran et al. 2013, שיבוט sgRNAs</td></tr><tr><td>T7 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0318L</td><td>Ran et al. 2013, שיבוט sgRNAs</td></tr><tr><td>Tango Buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>BY5</td><td>Ran et al. 2013, שיבוט sgRNAs</td></tr><tr><td>PlasmidSafe exonuclease</td><td>Epicentre</td><td>E3105K</td><td>Ran et al. 2013, שיבוט sgRNAs</td></tr><tr><td>Q5 התחלה חמה פולימראז נאמנות גבוהה</td><td>NEB</td><td>M0494A</td><td>הגברת HA</td></tr><tr><td>pUC19-BsaI</td><td></td><td></td><td>פלסמיד pUC19 שונה, מוטציה באתר BsaI קיים והוכנס שני אתרי BsaI הפונים החוצה לאחר עיכול BamHI/EcoRI</td></tr><tr><td>pGolden-Neo</td><td>Addgene</td><td>51422</td><td>קלטת התנגדות</td></tr><tr><td>pGolden-Hygro</td><td>Addgene</td><td>51423</td><td>קלטת התנגדות</td></tr><tr><td>אנזים BsaI NEB</td><td></td><td>R3535S</td><td>הומולוגיה של זרוע קונסטרוקציה</td></tr><tr><td>T7 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0318L</td><td></td></tr><tr><td>PlasmidSafe exonuclease</td><td>Epicentre</td><td>E3105K</td><td></td></tr><tr><td>קיסמים</td><td></td><td></td><td>חיידקים PCR</td></tr><tr><td>Taq פולימראז</td><td></td><td></td><td>מושבת חיידקים PCR</td></tr><tr><td>HEK293 תאים אנושיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטוקוס (אופציה)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות</td><td>BioLite</td><td>12556004</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LTI Transfection Reagent</td><td>Mirus</td><td>MIR2300</td><td>לליפופקציה בלבד</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td>לליפופקציה בלבד</td></tr><tr><td>G418 (Neomycin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720-5G</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3274-250MG</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחות באר</td><td>ThermoFisher</td><td>12556008</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזה פסיבי, מתכון מאגר</td><td></td> טעינה 5x Promega <td></td><td></td></tr><tr><td>1x SDS</td><td>מתואר בפרוטוקול</td>מתכון ממברנת ניטרוצלולוזה Bio-Rad 162-0115 TBST מתואר בפרוטוקול חלב מיובש <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura מצע משך מורחב</td><td>ThermoFisher</td><td>34075</td><td>לנוגדנים משניים מצומדים HRP</td></tr><tr><td>הכנת DNA ל-PCR</td><td>Quantabio</td><td>95091-025</td><td></td></tr><tr><td>KOD פולימראז</td><td>Novagen</td><td>71316</td><td></td></tr></tbody></table>

הבחירה תלויה עצמאית הדור של crispr / cas9 בתיווך גין knockouts בתאי יונקים

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

מערכת ההנדסה הגנטית של CRISPR / Cas9 חוללה מהפכה ביולוגית בכך שהיא מאפשרת עריכה מדויקת של הגנום עם מעט מאמץ. מודרך על ידי מדריך יחיד RNA (sgRNA) המעניק סגוליות, חלבון Cas9 cleaves שני גדילי DNA ב מוקד ממוקדת. ההפצה DNA יכול להפעיל או שאינם הומולוגיים סוף שהצטרף (NHEJ) או הומולוגיה מכוונת לתקן (HDR). NHEJ יכול להציג מחיקות קטנות או הוספות אשר להוביל מוטציות מסגרת משמרת, בעוד HDR מאפשר הפרעות גדול יותר מדויק. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להפקת קווי תא נוקאאוט על ידי צימוד הוקמה CRISPR / Cas9 שיטות עם שתי אפשרויות לבחירה במורד / הקרנה. הגישה NHEJ משתמשת באתר חיתוך יחיד sgRNA ובחירה עצמאית הבחירה, שבו ייצור החלבון מוערכת על ידי אימונובלוט נקודה בצורה תפוקה גבוהה. הגישה HDR משתמש בשני sgRNA לחתוך אתרים כי טווח הגן של עניין. יחד עם תבנית HDR בתנאי, שיטה זו יכולה להשיג מחיקהשל עשרות kb, בסיוע סמן התנגדות לבחירה לבחירה. היישומים והיתרונות המתאימים של כל שיטה נדונים.

עבור הדור של שורות ELOWL1 נוקאאוט, נוגדנים חזקים היה זמין, כך העריכה באמצעות sgRNAs יחיד ( איור 1 א , משמאל) בוצעה, ואחריו אימונובלוט נקודה. שלושה sgRNAs היו transfected באופן עצמאי כדי להשוות את היעילות כדי לשלול את ההשפעות היעד שיבוטים וכתוצאה מכך. לאחר איסוף ו lysates תא סופג מאוכלוסיות משובטים על שני קרומי ניטרוצלולוזה, כתמים נבדקו הן ELAVL1 ו PUM2 (כבקרת נורמליזציה) ( איור 2 א ). היחס...

ההתקדמות האחרונות ביכולת לתמרן גנטית קווי תאים סומטיים להחזיק פוטנציאל גדול עבור מחקר בסיסי ויישומי. כאן, אנו מציגים שתי גישות עבור CRISPR / Cas9 שנוצר נוקאאוט הייצור והקרנה שורות תאים יונקים, עם וללא שימוש סמנים לבחירה.

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

מטרת הליך זה היא לבודד ולזהות שורות תאים קלונאליות עם נוק-אאוט (knockout), שנוצרו באמצעות שני סוגים של עריכה גנומית המתווכת על ידי CRISPR/Cas9. שיטה אחת מזהה נוק-אאוט של חלבון הנגרם על ידי חיבור קצוות לא הומולוגי (nonhomologous end joining), בעוד שהשנייה מזהה שיבושים גנומיים שנוצרו על ידי תיקון מכוון הומולוגיה (homology-directed repair). שיטה זו שימושית במיוחד בתחום הביולוגיה המולקולרית, שבו יצירת שורות תאים עם שיבושים גנטיים היא כלי חשוב בניתוח תפקודי גנים.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא שיטה מהירה ובעלת תפוקה גבוהה יחסית, שניתן לבצעה בקלות באמצעות טכניקות בסיסיות של ביולוגיה מולקולרית. חיבור קצוות שאינו הומולגי (Nonhomologous end joining) גורם למחיקות או להכנסות קטנות, ואלו מוערכות באמצעות dot immunoblot, בעוד שתיקון מכוון הומולוגיה (homology-directed repair) מאפשר הפרעות גדולות ומדויקות יותר, ואלו מוערכות באמצעות colony PCR. ניסוי זה משתמש בתאי T-REx-293 שגודלו במצע DMEM, בתוספת 10% FBS בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide.לפני הטרנספקציה, זרעו את התאים בצלחות 6 בארות ושיירו בארה אחת עבור בקרת אי-טרנספקציה. גדלו את התאים עד להגעה למסף של כ-70% confluency. בצעו טרנספקציה לתאים עם 2.5 micrograms של פלסמיד כולל, תוך שימוש בפרוטוקול טרנספקציה מסחרי.עבור טרנספקציה של תאים ללא סלקציה, השתמש ב-2.5 micrograms של פלסמיד Cas9-sgRNA. עבור טרנספקציה של תאים עם סלקציה, השתמש ב-0.75 micrograms של Cas9-sgRNA1, 0.75 micrograms של Cas9-sgRNA2, ו-one microgram של תבנית לרקומינציה הומולוגית. דגרי את התאים שעברו טרנספקציה ואת ביקרת התאים שלא עברו טרנספקציה ב-37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 48 שעות.עבור תאים שעברו טרנספקציה לבחירה, התחילו את הברירה התרופתית על ידי טיפול בתאים בתרופה המתאימה, שבמקרה זה היא Neomycin. החזירו את פלטת שש הבארות לאינקובטור. עקבו אחר התאים המטופלים פעם ביום כדי לבדוק את שיעורי תמותת התאים, עד שכל התאים בביקרת הלא-טרנספקטיים ימותו.כדי לבודד אוכלוסיות קלונאליות, ראשית גדלו את התאים עד להגעה ל-100% confluency בבאר המקורית לאחר הברירה. לאחר מכן, בצעו דילולים סדרתיים של התאים וספרו אותם. מכיוון שהיווצרות נכונה של מושבות מונוקלונאליות היא המפתח להשגת knockout מלא, יש להקפיד לקבוע את הדילול הנכון להזרעת תאים בצפיפות הרצויה.לאחר שנקבעו הדילול הנכון, יש להעביר את התאים ללוחות בעלי 96 בארות בצפיפות של 0.33 תאים לבארה. העברת תאים לשלושה לוחות של 96 בארות היא נקודת התחלה טובה כדי להבטיח בידוד של יותר משבט נכון אחד. לאורך תקופה של שבועיים עד ארבעה שבועות, יש לעקוב אחר המושבות עד שיהיו גלויות לעין.תמונות מייצגות אלו מראות מושבות בשלבי גדילה שונים: תא בודד בעת ההשבה, תאים ביום החמישי, ומושבה מבוססת ביום העשירי. בעזרת טיפ של פפית סטרילית, אספו בזהירות ובדיוק מושבות נראות לעין, והשביו אותן לבארות חדשות כדי לעודד גדילה בשכבה אחת (monolayer).המשך לגדל את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. מועמדי knockout ללא סלקציה נסרקים באמצעות dot immunoblot כדי להעריך את תוצר החלבון באופן בעל תפוקה גבוהה. לאחר גידול של שיבוטים בודדים עד לרמת התמזגות (confluency) של 50 עד 100%, הפר את השכבה החד-שכלית (monolayer) של התאים על ידי פיפטור בתוך הבאר.העבירו מנה של 90 µL מתוך נפח כולל של 100 µL מכל באר לשפרויר מיקרוצנטריפוגה נקי. לצורך סרטון זה, יעובדו שתי דגימות בלבד. סובבו בצנטריפוגה ב-6,000 RPM למשך חמש דקות, הסירו את המדיום, והליסו את משקע התאים ב-10 µL של 1X SDS loading buffer.הוסיפו 90 µL של מצע גידול חדש לשארית התאים בבאר, והחזירו את הפלטה לאינקובטור כדי להמשיך את תרבית התאים. העבירו בעזרת פפט 1 µL של ליזאט תאים על גבי ממבנה ניטרוסלולוז יבש כדי ליצור נקודה. בצעו בלוט לכל דגימה פעמיים על שני ממבני ניטרוסלולוז נפרדים, כך שייווצרו שתי תבניות זהות של דגימות.חסמו את הממברנות ב-5% חלב ב-TBST בטמפרטורת החדר, תחת נטילה, למשך שעה אחת. לאחר שעה, חשפו את הממברנות לנוגדנים ראשוניים בדילול המומלץ לנוגדן הראשוני, ב-TBST בתוספת 5% חלב. בממברנה אחת השתמשו בנוגדן ראשוני נגד חלבון המטרה, ELAVL1 בניסוי זה.על הממברנה השנייה, השתמש בנוגדן ראשוני עבור חלבון בקרה שאינו צפוי להשתנות; כאן נעשה שימוש ב-PUM2. הדגרה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. הסר את תמיסת הנוגדן הראשוני מכל blot, הוסף TBST והדגרה למשך חמש דקות.בדרך זו, שטפו את הבלוטים שלוש פעמים עם TBST. לאחר מכן, הוסיפו לכל ממבנה את הנוגדן המשני המתאים המשורשר ל-HRP, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר שעה אחת, שטפו את הממבנים שלוש פעמים עם TBST למשך חמש דקות בכל פעם.יש להחיל תמיסת סובסטרט כימילומנסיאנטית על הבלוטים, בהתאם להוראות היצרן, ולהדמות את ממбраנות הבלוטינג במכשיר הדמיה כימילומנסיאנטית דיגיטלי. לבסוף, יש לכמת את עוצמת הנקודות עבור חלבוני המטרה והביקורת באמצעות התוכנה המתאימה, ולנתח את התוצאות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. מועמדים עם סמן עמידות נבחרים מסוננים באמצעות colony PCR.התחילו את ההליך על ידי שכפול של מושבות בודדות בתוך פלטה חדשה בעלת 96 בארות, וגדלו אותן עד להגעה ל-100% confluency לצורך הכנת ליזאטים של תאים. הסירו את המדיום מקבוצה אחת של השיבוטים, השעיקו מחדש את התאים מכל בארה ב-30 µL של תמיסת מיצוי מערכה מסחרית להכנת DNA, והעבירו לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה נקייה בנפח 1.5 mL. חממו את התמיסה ל-96 °C במשך 15 דקות, ולאחר מכן תנו לה להתקרר לטמפרטורת החדר.הוסיפו 30 µL של תמיסת ייצוב (stabilization buffer) לכל מבחנה למיקרוצנטריפוגה וערבבו היטב. כדי לזהות קווים מסוג פראי (wild-type) וקווים מוטנטיים מונו-אלליים או בי-אלליים באמצעות PCR של מושבות (colony PCR), תכננו שני סטים נפרדים של פריימרים ל-PCR להגברה של אזורים סביב זרועות ההומולוגיה, בהתבסס על הצלחה או כישלון של שילוב קסטת העמידות. בכל צד, השתמשו בפריימר משותף שנקשר מחוץ לזרוע ההומולוגיה.כדי לבדוק את האלל מסוג הפרא (wild-type), השתמשו בפריימר המשותף יחד עם הפריימר הזוגי התואם, המשלים לרצף האנדוגני המשתרע על פני אזור ההומולוגיה. כדי לבדוק את המוטציה הרצויה, השתמשו בפריימר המשותף יחד עם פריימר זוגי אחר, המשלים לקסטת העמידות שהוחדרה. עבור כל דגימה לבדיקה, הכינו תערובת תגובה המכילה את הרכיבים הבאים: 0.5 µL של ליסאט תאים, 1.25 µL של 10X KOD buffer, 0.75 µL של 25 mM מגנזיום סולפט, 1.25 µL של 2 mM dNTPs, 0.375 µL של פריימר קדמי (forward primer), 0.375 µL של פריימר אחורי (reverse primer), 0.25 µL של KOD polymerase ו-7.75 µL של מים.בצע PCR בתנאים הבאים: 95 °C למשך שתי דקות, ולאחריהם 25 מחזורים של 95 °C למשך 20 שניות, טמפרטורת ההמסה של הפריימר למשך 10 שניות, ו-70 °C למשך 20 שניות לכל KB. לאחר מכן, ויזואליזציה של תוצרי ה-PCR תבוצע באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. עריכה גנומית באמצעות חיבור קצוות לא הומולוגי (non-homologous end joining) בוצעה כדי ליצור קווי knockout של ELAVL1, ולאחריה dot immunoblot עם בדיקה (probing) ל-ELAVL1 ו-PUM2. קלונים שהפגינו אות בקרה חלש סומנו ב-X והוצאו מניתוחים נוספים.שיבטים עם אותות ELAVL1 נמוכים נבדקו בהמשך באמצעות western blot. מועמדים מאושרים מסומנים בירוק, ומועמדים שנפסלו מסומנים באפור. גרפיקה זו מציגה את היחסים בין אות ה-ELAVL1 לאות של חלבון הבקרה בסדר עולה.ברוב המקרים, אוכלוסיות קלונליות עם אות ה-ELAVL1 היחסי הנמוך ביותר זוהו נכונה כנוק-אאוטים (knockouts). מועמדים שנוצרו בשיטת תיקון מכוון על ידי הומולוגיה (homology directed repair) נסרקו באמצעות PCR של מושבות, ותוצרי ה-PCR הודגמו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. מוצגות כאן תוצאות לדוגמה תוך שימוש בפריימרים המכסים את נקודת החיבור של האינטגרציה במעלה הזרם, תוך שימוש בפריימרים פנימיים אנדוגניים ובפריימרים פנימיים של הנוק-אאוט.ראשית, הפריימרים תוקפו הן בתאי ההורה והן בתאים שנבחרו באופן כולל (bulk selected cells). תוצאות מ-24 שיבוטים מועמדים בודדים מוצגות יחד עם תבניות הפסים הצפויות עבור שיבוטי טיפוס פראי (wild-type), נוק-אאוט (knockout), ומחיקה מונו-אללית.קווי המוטנטים הבי-אלליים תוקפו בהמשך באמצעות western blot. חיבור קצוות לא הומולוגי (Nonhomologous end joining) משתמש בחיתוך Cas9 בודד ובסריקה שאינה תלויה בברירה, ולכן דורש מעט הכנה מוקדמת, וסריקה של שיבוטי knockout באמצעות dot blots יכולה לקבוע במהירות אם יצירת ה-knockout הצליחה. סריקה מבוססת PCR מזהה במדויק מועמדים נכונים בעלי הפרעות גנומיות גדולות שנוצרו על ידי תיקון מכוון להומולוגיה (homology-directed repair).טכניקות אלו מאפשרות לחוקרים בביולוגיה מולקולרית לזהות נוק-אאוטים (knockouts) בקלות וביעילות, ובכך לאפשר להם לחקור תהליכים תאיים תקינים או לקויים באמצעות שורות תאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד ולזהות שורות תאים של נוק-אאוט קלונלי שהופקו באמצעות עריכה גנומית מתווכת CRISPR/Cas9.

selection-dependent-independent-generation-crisprcas9-mediated-gene

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

CRISPR/Cas9 היא מערכת חזקה ליצירת שיבוש של גנים ואלמנטים גנטיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירה יעילה של מחיקות גנומיות בשורות תאים של יונקים באמצעות CRISPR/Cas9.

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

מערכת CRISPR / Cas9 מציעה את הפוטנציאל להפוך הגנום ממוקד עריכה נגישה ובמחיר סביר לקהילה המדעית. פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד ליצור וירוסים אשר מפסיד יוצאים גן של עניין באמצעות מערכת CRISPR / Cas9, ואז מזריקים אותם stereotaxically לתוך מוח העכבר הבוגר.

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

Microinjection של ביציות העכבר משמש בדרך כלל עבור transgenesis קלאסי ( כלומר, שילוב אקראי של transgenes) ו CRISPR בתיווך גישור המיקוד. פרוטוקול זה סוקר את ההתפתחויות האחרונות microinjection, עם דגש מיוחד על בקרת איכות אסטרטגיות genotyping.

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

פרוטוקול זה מתאר את השלבים לשיבוט מספר רב של מדריך RNAs לתוך אחד וקטור RNA concatmer מדריך, שהוא שימוש מיוחד ביצירת נוק-אאוט רב גנים באמצעות טכנולוגיית CRISPR / Cas9. הדור של נוקאאוטס כפול באורגנואידים במעיים מוצג כיישום אפשרי של שיטה זו.

פרוטוקול של נוקאוט גנים מרובים עכבר קטן Organoids באמצעות CISPR-concatemer

הגנום יישוב עריכה במערכת מודל רזבורה rerio (דג זברה) כבר באופן משמעותי בהנחייתם של הופעתה של גישות CRISPR. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול יעילים, חזקים הדור, זיהוי של אללים נגזר CRISPR שטויות המשלבת וזמינותו ניידות heteroduplex וזיהוי מוטציות באמצעות הדור הבא רצפי.

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

עבור פרוטוקול מהיר CRISPR/Cas9-מתווכת ' שיבוש גנטי עכבר, התאים hematopoietic העיקרי של האדם מתואר במאמר זה. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins הם הציגו ויה אלקטרופורציה עם sgRNAs שנוצר דרך במבחנה שעתוק ו Cas9 מסחרי. יעילות העריכה גבוהה מושגות עם זמן מוגבל ועלות פיננסיים.

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas היא טכנולוגיה רבת עוצמה להנדס הגנום מורכבים של צמחים ובעלי חיים. כאן, אנחנו פירוט נוהל לעריכת ביעילות הגנום האנושי באמצעות endonucleases רשויות אישורים שונים. אנחנו מדגישים שיקולים חשובים ופרמטרים עיצוב כדי למטב את יעילות העריכה.

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

CRISPR-Cas9 הטכנולוגיה מספקת שיטה יעילה בדיוק לערוך את הגנום היונקים בסוג תא כלשהו ומייצג את האמצעים הרומן לבצע מסכי גנטי רחב הגנום. פרוטוקול מפורט לדון בצעדים הנדרשים עבור ביצועים מוצלחים של מסכי CRISPR-Cas9 הגנום הרחב מסופק כאן.

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

כתב יד זה מתאר גישה מבוססת הגנום בקנה מידה מבוססי לזהות קולטן מסחטות-ליגניות ואינטראקציות.

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח מודלים של עכברים מהונדסים גנטית באמצעות תאי גזע עובריים, במיוחד עבור דנ"א גדול (KI). פרוטוקול זה מכוונן באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9, וכתוצאה מכך יעילות KI משופרת באופן משמעותי בהשוואה לשיטת מיקוד הדנ"א הליניארי ההומולוגית הקונבנציונלית בתיווך רקומבינציה.

מיקוד גנים יעיל ביותר בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים לפיתוח מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית

ככל שפרוטוקולים הקשורים לקריספר הופכים שימושיים ונגישים יותר ויותר, סיבוכים ומכשולים עדיין יכולים להיווצר בתנאי ניסוי ספציפיים. פרוטוקול זה מתאר את היצירה של קו תאים אנושיים נוקאאוט של סרין/תראונין-חלבון קינאז 1 (RIPK1/RIP1) באמצעות CRISPR/Cas9 ומדגיש אתגרים פוטנציאליים בהם נתקלים במהלך תהליך זה.

יצירת קו תאים RIP1 Knockout U937 באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

למד שתי שיטות CRISPR/Cas9 ליצירת קווי תאים knockout בתאי יונקים, באמצעות שחבור לא הומולוגי ותיקון מכוון הומולוגיה. השיטות מאפשרות סינון יעיל של קלונים ללא פונקציית גן.

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

גלה סרטונים נוספים