Name: Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: למדו שיטת אימונופלואורסצנציה כמותית לחקר תרגום מקומי בתאי MRC-5 במהלך הידבקות תאית. טכניקה זו מאפשרת הדמיה וכימות מהירים של אירועי תרגום בתאים חיים באמצעות פיורומיצין ומיקרוסקופ קונפוקלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ד ר ראשיד Mazroui (אוניברסיטת לאוול, קוויבק, קנדה) על קריאה ביקורתית של כתב היד. אנו מודים יחידת דימות תא של המרכז לחקר לסיוע טכני שלהם. Huot מé. הוא חוקר המחקר ג'וניור 1 דה Fonds du רשרש קוויבק-Santé (FRQ-S). עבודה זו נתמכה על ידי קנדי מוסדות של בריאות המחקר (להעניק מספר CIHR, מגב-286437 למ-É. Huot).

1. נחישות של תנאים Puromycilation הערה: טכניקה זו מתאר את השיטה להערכת תרגום לשפות אחרות במהלך תהליך 5 אדהזיה תא MRC-5. כפי puromycilation יכול להיעשות בתא כלשהו, חשוב למטב את התנאים puromycilation עבור שורות תאים מסוים לשמש, כי התנאים הטיפול אינם זהים עבור כל קו תא מבחינת הריכוז puromycin, את הרצוי זמן הדגירה. כדי להראות כמה תנאים אלה מוגדרים, שלוש שורות תאים דוגמה (קרי, הלה, MRC-5 ו- 7-מה) טופלו עם הגדלת ריכוזי puromycin לזמנים שונים דגירה ( איור 1).
מספרים זהים <ol><li>הגידול של תאים בצלחת 24-ובכן ב- 0.5 מ ל המתאים להשלים תרבות בינוני h 16 לפני המבחן. זרע 30,000 MRC-5 תאים, התאים הלה 50,000 או 50,000 תאים מה-7 לכל טוב. הקפד להימנע מחריגה 60-70% הנהרות (איור 1 א').</li>
	<li>הכן 6 צינורות עם mL 1.5 תא שלם של תרבות בינוני עם הגדלת ריכוזים של puromycin (0, 5, 10, 15, 20, ו 30 µg/mL). חם מראש ב 37 º C</li>
	<li>עבור כל ריכוז של puromycin בינוני (שלב מוכן ב- 1.2), העברת 0.5 מ של כל צינור לתוך צינורות חדשים 6 ולהוסיף cycloheximide-ריכוז הסופי של µg 50/mL כל 6 צינורות חדשים. חם מראש ב 37 º C</li>
	<li>לשנות את המדיום עם 0.5 מ של תרבות שלמה בינוני (שורה 1 ו- 2). השורה השלישית, הוסיפו 0.5 מיליליטר בינוני תרבות מלאה בתוספת 50 µg/mL של cycloheximide ( איור 1B). 
	הערה: טיפול Cycloheximide הוקם של הפקד שלילי הטוב ביותר עבור puromycilation חלבון בשל יכולתו לחסום את התארכות תרגום. כי puromycin התאגדות דורש תרגום התארכות, טיפול cycloheximide מוביל לאובדן של puromycilated חלבון אותות 5 , 18-</li>
	<li>תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2).</li>
	<li>להוסיף 0.5 מ"ל של המדיום puromycin מוכן בשלב 1.2 על השורה השניה כדי לקבל ריכוזים הסופי של 0, 2.5, 5, 7.5, 10 ו- 15 µg/mL, בהתאמה, בעמודות A, B, C, D, E ו- F. במקביל, להוסיף 0.5 מ של puromycin בתוספת cycloheximide המדיום (שלב 1.3) בשורה השלישית ( איור 1C).</li>
	<li>תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2).</li>
	<li>להוסיף 0.5 מ"ל של המדיום puromycin מוכן בשלב 1.2 לשורה הראשונה כדי לקבל ריכוזים הסופי של 0.0, 2.5, 5, 7.5, 10 ו- 15 µg/mL ( איור 1C).</li>
	<li>תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2).</li>
	<li>לרחוץ כל אחד מן שורות 1-3 עם 1 מ"ל של קרח 1 X באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) 5 דקות לאחר התוספת של puromycin כדי בארות של השורה הראשונה (לשטוף פעמיים). להוסיף µL 75 מאגר X Laemmli 1 (4% נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות), 4% מרקפטואתנול, M HCl טריס 0.120 pH 6.8, גליצרול bromophenol כחול, ו-10% 0.004%) כדי להשיג כל-תא lysates עבור כל תנאי.</li>
	<li>לרוץ 10% מרחביות-לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) באמצעות 1/3 של הדגימות מוכן כדי להעריך puromycin ההתאגדות.
	<ol><li>לקבוע רמת התאגדות puromycin על ידי ניתוח תספיג באמצעות נוגדן אנטי puromycin (12 יח 10) מדולל ביחס של ערים ב מאגר הדגירה נוגדן ראשוני (2% שור אלבומין (BSA)), 430 מ מ NaCl, 10 מ מ טריס pH 7.4 ו- 0.01% אזיד הנתרן). 
		הערה: להחליפן בתמונות המתאים תמציות קו תא שונים שנעשו כפי שמתואר בשלב 1 מוצגות כדוגמאות באיור 2.</li>
	</ol></li></ol> 2. ב- Cellulo לשפות אחרות תרגום חזותי הערה: בטכניקה המתוארת כאן שימש להערכת תרגום לשפות אחרות בתוך SICs בתאים MRC-5 במהלך תהליך אדהזיה 5. למרות MRC-5 תאים משמשים כאן, שורות תאים אחרים ניתן להשתמש עם המתודולוגיה באותו שמתואר בשלב 2.1.
<ol><li>תא הכנה-
	<ol><li>ניתוק MRC-5 תאים באמצעות 0.25% טריפסין/2.21 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) בהאנק &#39; s מאוזנת פתרון מלח (HBSS). גלולה התאים על ידי צנטריפוגה (5 דקות ב- 200 x גרם) בשפופרת צנטרפוגה חרוט 15-mL ו להשעות אותם ב- Dulbecco &#39; s השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS)-תאים למ"ל 40,000 לאחר ספירת עם חדר הספירה.</li>
		<li>דגירה התאים על תנאי ב 37 ° C תחת סיבוב עדין באמצעות מסובב שפופרת של כעשרים דקות כדי לשמור אותם ההשעיה. 
		הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לאפשר הדיסוציאציה מלאה של מתחמי אדהזיה מוקד.</li>
		<li>צלחת 2 מ"ל של תאים MRC-5 על תנאי (40,000 תאים/mL) בשתי מנות 35 מ מ זכוכית-התחתון. המנה 35 מ מ זכוכית המדרגה הראשונה לשימוש וזמינותו puromycilation (ראה שלב 2.1.5) ולהשתמש השני כפקד שלילי (ראה שלב 2.1.6).</li>
		<li>לשמור את התאים ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2) במשך 55 דקות לאפשר אדהזיה סלולרית ויצירת SIC.</li>
		<li>Puromycin הוסף למדיום מנות 35 מ מ זכוכית-התחתון (assay) באמצעות ריכוז שהוגדרה קודם לכן בסעיף 1. כדי להתייחס MRC-5 תאים, השתמש puromycin µg/mL 10 עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2).</li>
		<li>כפקד שלילי, להוסיף cycloheximide למנה 35 מ מ זכוכית המדרגה השניה 40 דקות לאחר זריעה התאים להתייחס אליהם מראש עם µg/mL 50 cycloheximide ( איור 2B). לאחר מכן, 15 דקות לאחר cycloheximide תוספת, להוסיף puromycin המדיום באמצעות ריכוז, דגירה זמנית כמו שלב 2.1.5 (למשל, שימוש 10 µg/mL של puromycin עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2) MRC-5).</li>
		<li>לרחוץ כל צלחת פעמיים עם 2 מ של קרח 1 X PBS ולתקן את התאים עם 1 מ"ל של 4% פורמלדהיד (מדולל ב- 1 X PBS) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT). 
		התראה: Paraformaldehyde יש להשתמש אך ורק ברדס כימי.</li>
	</ol></li> <li>Immunostaining.
	<ol><li>בעקבות קיבוע paraformaldehyde, לשטוף שלוש פעמים עם 2 מ ל 1 X PBS, תקופת דגירה של 500 µL של PBS-TritonX-100 (0.5%) של 20 דקות ב RT כדי permeabilize את התאים.</li>
		<li>כדי למנוע מחייב נוגדן ספציפי, לחסום את הדגימה עם 500 µL PBS &#8211; BSA (1%) במשך 20 דקות ב- RT.</li>
		<li>שלוש פעמים עם 2 מ של PBS-Tween20 (0.1%) וקונטה דגירה עם 300 µL של 1:12,500 אנטי-puromycin נוגדנים (12 יח 10) מדולל ב- PBS X 1 על 1 h RT.</li>
		<li>3 פעמים עם 2 מ של PBS-Tween20 (0.1%) וקונטה דגירה עם 300 µL של העכבר אנטי איג מצומדת כדי fluorophore (כאן, 488 ננומטר) מדולל ב- PBS לדמיין puromycilated polypeptides ועם phalloidin מצומדת כדי fluorophore אחרת (כאן, 555 ננומטר) כדי להמחיש F-אקטין. תקופת דגירה של 1 h RT.</li>
		<li>ואז תקופת דגירה של 5 דקות ב RT ב- 300 µL של PBS-Tween20 (0.1%) בתוספת µg 1/4 מ"ל וקונטה שלוש פעמים עם 2 מ של PBS-Tween20 (0.1%) &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי).</li>
		<li>לרחוץ שלוש פעמים עם 2 מ של PBS-Tween20 (0.1%), ולאחר מכן לשטוף עם 2 מ ל 1 X PBS. למנוע את התאים מתייבשים על ידי שמירה המדגם על 2 מ ל 1 X PBS במהלך ייבוא תמונות.</li>
	</ol></li></ol> 3. ייבוא תמונות immunofluorescent הערה: המתודולוגיה הבאים ניתן להשתמש עם כל מערכת הדמיה זמינים מסחרית קונפוקלי.
<ol><li>המתאים לקבוע הגדרות עבור כל fluorophore להגדיל את הטווח הדינמי על כימות. 
	הערה: נציג כימות יכולה להיות מושגת רק אם רוויה פיקסל הוא נמנע הסף אות מכוונן כראוי. הגדרות אלה יכולות להיות על-ידי התאמת בקפידה את עוצמת הלייזר, מתח גבוה (HV), לקבל, היסט...
	<ol><li>התאם הזום גורם (5 X), מספר הפיקסלים (512 x 512) כדי למטב את גודל פיקסל. 
		הערה: זה צריך להיות לפחות 2.3 - פעמים קטנים יותר לרזולוציה אופטית, על-פי משפט נייקוויסט.</li>
		<li>להקטין את מהירות סריקה (12.5-20 µs לפיקסל), להשתמש בממוצע (2 - 3 פעמים) כדי לשפר את יחס אות לרעש בהתאם להגדרות הנ ל.</li>
	</ol></li> <li>באופן ידני לקבוע העליון המתאים והתחתונים מטוסים מוקד לאורך ציר z עם גודל צעד אופטימלית (0.4 מיקרומטר פרוסה). 
	הערה: המטוס גודל צעד נקבעת לפי הרזולוציה צירית מחולק 2.3, בהתאם משפט נייקויסט המוכלל. בדרך כלל, 20-25 שכבות נחוצים לכסות את כל התא עומק תאים חסיד.</li>
	<li>לרכוש תמונה קונאפוקלית של תא יחיד כולו עם 60 X לתכנן Apo שמן טבילה יעד (מפתח נומרי 1.42 ג ' יגה).</li>
</ol> 4. כימות תמונה immunofluorescent <ol><li>נחישות העשרה.
	<ol><li>לפתוח תמונה המתאימה בשכבת מטוס ה-z עניין מקובץ הנתונים רכשה תא באמצעות התוכנה ImageJ (freeware לרשותכם http://fiji.sc).</li>
		<li>לצייר קו באמצעות הכלי קו ציור (סרגל הכלים &#8594; ישר) דרך האזורים של התא שבו רצוי כמת. לשנות את רוחב הקו על-ידי לחיצה כפולה על &#34; שכיבה על הגב &#34; ערכי העוצמה ייכללו בממוצע דרך רוחב הקו (מוגדר ב-8 באיור 3). 
		הערה: קו דק יותר הוא העדיף להימנע אות חפיפה של מבנים שונים.</li>
		<li>אחרי הקו מוגדר כראוי, פרופיל הצפיפות אות לאורך הציר נחוש (שורת התפריטים &#8594; ניתוח &#8594; פרופיל מגרש). 
		הערה: חלון חדש יפתח המציגה פרופיל התואם עוצמת האות לכל פיקסל של הערוץ שנבחר (fluorophore ספציפי) לאורך הקו עבור המקטע שנבחר מטוס ה-z.
		<ol><li>חזור על התהליך לכל ערוץ התואם fluorophore בשימוש (קרי, כימות אחד עבור 488, אחד עבור 568 ואחד 405). 
			הערה: הערך עוצמת האות תמיד תידרש בעקבות הכיוון של הקו מצוירות.</li>
		</ol></li> <li>כדי להשיג את הערכים מספריים בגווני אפור לכל פיקסל של הפרופיל התואם quantifications של השכבה שנבחרה מטוס ה-z, העתק את נתוני הפרופיל (שורת תפריטים בחלון התמונה &#8594; עותק) והדבקתו בתוכנה בכל גיליון אלקטרוני-</li>
		4.1.1-4.1.4 <li>חזור על שלבים עבור כל מקטע מטוס ה-z של התמונה קונאפוקלית רכשה ו כל ערוץ שבו רצוי כמת. 
		הערה: יכול להיות איחדו כימות של שכבות שונות של מטוס ה-z כדי לקבל הערכה כללית של העשרת מיוחד של האות על-ידי חישוב הערך סכום של כל פיקסל לאורך הקו עבור כל שכבת מטוס ה-z. סוג זה של איגוד תושג רק קו שצויר הינו זהה עבור כל שכבת מטוס ה-z כללו את הערכים רשע.</li>
		<li>כאמצעי חלופי עבור כל תא כימות של ערוצים שונים עם מספר רב של שכבות, להשתמש במאקרו שנקרא StackprofileData (ראה קובץ משלים). 
		הערה: פקודת מאקרו זו נגישה בחופשיות-https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt והוא יכול לשמש כדלקמן: <ol><li>להדביק את המאקרו לתוך קובץ טקסט ולשמור את זה</li>
			<li>לפתוח את קובץ התמונה הכוללת את כל השכבות קונאפוקלית של התא.</li>
			<li>לצייר קו, כמתואר בשלב 4.1.2, לפתוח חלון חדש לייבא את המאקרו (שורת התפריטים &#8594; תוספים &#8594; מאקרו &#8594; להפעיל), בחר את קובץ הטקסט שנשמר התואם המאקרו StackprofileData ולחץ &#34; פתוח. &#34; 
			הערה: בעקבות מאקרו היבוא, חלון חדש בשם &#34; תוצאות &#34; יפתח, כל כימות לאורך הציר נחוש יפורטו עבור כל שכבת מטוס ה-z של ערוץ נוכח קובצי התמונה.</li>
			<li>להעתיק את הנתונים לכל ערוץ (שורת התפריטים &#8594; לערוך &#8594; Copy) כדי לקבל ייצוג גרפי הפרופיל התואם quantifications אות. להדביק אותם בכל תוכנת הגיליון האלקטרוני. לחשב את ערך סכום של כל ערוץ לכל פיקסל לאורך הקו עבור כל שכבת מטוס ה-z. השתמש בערכים אלה כדי ליצור ייצוג גרפי הדומה לזה המוצג באיור 3.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>כימות של האות באזור המיועד הסלולר או נפח.
	<ol><li>לפתוח את קובץ התמונה בתוכנה ImageJ.</li>
		<li>לצייר על שטח לציון אזור עניין באמצעות הפונקציה צורה גיאומטרית (סרגל הכלים &#8594; &#34; מלבן, &#34; &#34; סגלגלות, &#34; או &#34; מצולע &#34;). 
		הערה: הערך כימות ייקבעו על האזור המתאים בטופס מצוירות.</li>
		<li>להתאים את רמת הסף כדי למנוע כל אות רקע (שורת התפריטים &#8594; להתאים את התמונה &#8594; סף); יופיע חלון חדש כדי לייצג את עוצמות פיקסל בטופס היסטוגרמה. לשנות את הערכים לכלול/לא לכלול פיקסלים כימות בעזרת המחוון ' '. בחר סף המונע אדום פיקסלים מחוץ לתא, כמו פיקסלים המסומנים באדום ייכלל כימות.</li>
		<li>להגדיר את הפרמטרים מדידה לכמת את האות פיקסל בתוך האזור הנבחר, ללא רקע אות (שורת התפריטים &#8594; ניתוח &#8594; להגדיר מידות), הקפד לבדוק &#34; הגבלה על הסף &#34; ו &#34; צפיפות משולב &#34; תיבות.</li>
		<li>למדוד כמותית הערכים עבור האזור שנבחר (שורת התפריטים &#8594; ניתוח &#8594; מדידה). 
		הערה: כימות עוצמת האות יוצגו בחלון חדש תחת &#34; IntDen &#34; זיהוי, אשר מייצג את המוצר של ערכי אפור רשע לבין מספר הפיקסלים בתוך האזור הנבחר.</li>
		<li>לצייר אזור הכולל את התא כולו באמצעות צורה גיאומטרית (סרגל הכלים &#8594; &#34; מלבן, &#34; &#34; סגלגלות, &#34; או &#34; מצולע &#34;) ולהמשיך עם 4.2.3-4.2.5 צעדים כדי להשיג ערך התואם לאות הכולל. לחשב את היחס של האות בתוך האזור הנבחר מעל האות כל להשיג את האחוזים של האות בתוך אזור עניין.</li>
		<li>חוזר 4.2.2-4.2.6 צעדים כדי להשיג כימות של תא האחסון עבור כל מטוס ה-z. להתאים את הצורה הגיאומטרית כנדרש.</li>
		<li>העתק/הדבק הנתונים המתקבלים &#34; תוצאות &#34; של windows עבור כל שכבת מטוס ה-z לתוך גיליון אלקטרוני לקבלת תיאור גרפי וכדי למצוא ערך רשע.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Translation+of+Single+mRNA+Molecules+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo.</a> Cell. 165, 976-989 (2016).</li>
<li>Morisaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+single+RNA+translation+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells.</a> Science. 352, 1425-1429 (2016).</li>
<li>Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+dynamics+of+single+mRNAs+in+live+cells+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons.</a> Science. 352, 1430-1435 (2016).</li>
<li>Halstead, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRICK%3A+A+Single-Molecule+Method+for+Imaging+the+First+Round+of+Translation+in+Living+Cells+and+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals.</a> Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).</li>
<li>Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+translation+regulates+cell+adhesion+and+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration.</a> J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).</li>
<li>El Fatimy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+in+a+Highly+Ordered+Neuronal+RiboNucleoParticles+Population%3A+A+Link+between+Stalled+Polyribosomes+and+RNA+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules.</a> PLoS Genet. 12, e1006192(2016).</li>
<li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorafenib%2C+a+multikinase+inhibitor%2C+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).</li>
<li>Paronetto, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sam68+regulates+translation+of+target+mRNAs+in+male+germ+cells%2C+necessary+for+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis.</a> J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).</li>
<li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUnSET%2C+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nat Methods. 6, 275-277 (2009).</li>
<li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+puromycin+action%3A+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).</li>
<li>Goodman, C. A., Hornberger, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+synthesis+with+SUnSET%3A+a+valid+alternative+to+traditional+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Exerc+Sport+Sci+Rev%22%5BJournal%5D)">Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques.</a> Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).</li>
<li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).</li>
<li>Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+muscular+atrophy%3A+the+role+of+SMN+in+axonal+mRNA+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation.</a> Brain Res. 1462, 81-92 (2012).</li>
<li>Costa-Mattioli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+by+the+eIF2alpha+kinase+GCN2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2.</a> Nature. 436, 1166-1173 (2005).</li>
<li>Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+long-lasting+synaptic+plasticity+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory.</a> Neuron. 61, 10-26 (2009).</li>
<li>Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+cells+move+messages%3A+the+biological+functions+of+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization.</a> Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).</li>
<li>Ephrussi, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3A+the+bicoid+morphogen+gradient+matures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures.</a> Cell. 116, 143-152 (2004).</li>
<li>Mardakheh, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Analysis+of+mRNA%2C+Translation%2C+and+Protein+Localization%3A+Local+Translation+Is+a+Key+Regulator+of+Cell+Protrusions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions.</a> Dev Cell. 35, 344-357 (2015).</li>
<li>Lacsina, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translational+termination+products+are+rapidly+degraded+substrates+for+MHC+class+I+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation.</a> PLoS One. 7, e51968(2012).</li>
<li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li>
<li>Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+human+diploid+cell+designated+MRC-5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5.</a> Nature. 227, 168-170 (1970).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות איפשרו הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים translational קולטנים upregulation או הדיכוי של mRNAs ספציפיים של תהליכים ביולוגיים, כגון פיתוח עצביים, סמים התגובה גרורות. המתודולוגיה חסכונית המתוארים כאן מאפשר תרגום אירועים, ניתן לאבחן בתאים כדי ללמוד כיצד RNA מחייב חלבונים להסדיר תהליכים גרורתי, כגון אדהזיה הסלולר, הגירה, הפלישה.
למרות פותחו שיטות רבות כדי להעריך תרגום החלבון דה נובו , וכולם חולקים את האסטרטגיה אותה, שבו מפוליפפטיד elongating משלבת ששונה חומ...

התקנון של תרגום על ידי תאיים שונים יש בקשה רבים צוותי המחקר לפתח כלים חדשים, שיטות לקביעת ההתאמה subcellular של mRNA תרגום וחלבון מוסדר סינתזה1,2 ,3,4. ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות אלה מאפשרים הבנה משופרת של המנגנונים הקשורים קולטנים upregulation תרגום או הדיכוי של mRNAs ספציפי במהלך תהליכים ביולוגיים, כגון פיתוח עצביים, סמים התגובה גרורות5 ,-6,-7,-8. עם זאת, רוב השיטות האלה דורשים יקר או מסוכנים ריאגנטים וציוד ספציפי כי לא יכול להיות זמין ברוב מעבדות. ככזה, פותחה שיטה חסכונית כדי לאפשר ההערכה המהירה של תרגום אירועים לעקוף באופן ספציפי אלה בעיות פוטנציאליות. שיטה זו מזהה חריפה האפנון translational להתרחש במהלך תהליכים תאיים ספציפיים, מאפשר גם עבור ההתאמה של תרגום באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
השיטות המתוארות כאן שימשו כדי לפקח על תרגום לשפות אחרות בתוך תאי subcellular שנקרא חניכה מתפשטת מרכזי (SIC)5. SICs הם מבנים ארעיים נמצאו בתאים הזריעה מותאמים על מתחמי אדהזיה המתהווה. למרות SICs, מתחמי אדהזיה ברורים, וגורלם הדוק. אכן, SICs ידועים להיעלם בהדרגה עם ההבשלה מורכבים אדהזיה מוקד לתוך אתר אדהזיה בשלב הראשוני של הידבקות. מצאנו כי RNA מחייב חלבונים ידוע בקרה ספציפית על תרגום ה-mRNA (למשל, Sam68, FMRP, ו G3BP1) ומבנים polyadenylated RNAs היו מועשר בתוך אלה5. שימוש בשיטות המתוארות כאן, הראינו כי ברגולציה של mRNA SIC-הקשורים תרגום משמש מחסום ומאפשר נזרע תאים כדי לאחד אדהזיה תא. שיטה זו, המבוססת על תאגיד puromycin, יכול להיחשב גירסה מותאמת של חישת משטח תרגום assay (שקיעה). פותח במקור כדי למדוד את המחירים סינתזת חלבון העולמי באמצעות של חומצת אמינו שאינן radioactively שכותרתו, חלבון puromycilation מציע דרך יעילה כדי להמחיש סינתזה של חלבון דה נובו 9. שיטה זו מתבססת על ההתנהגות מהותי של puromycin, אנטיביוטיקה החוסמת תרגום דרך שרשרת מוקדמת סיום ריבוזום10. אכן, puromycin הוא מקביל מבחינה מבנית tyrosyl-tRNA, המאפשר השתלבות מתארך פפטיד שרשראות דרך היווצרות של קשר פפטידי. לעומת זאת, מחייב puromycin שרשרת פפטיד גדל מונעת של קשר פפטידי חדשה נוצרת עם הבא aminoacyl-tRNA, מאז puromycin יש קשר אמיד hydrolysable במקום הקשר אסתר hydrolysable נמצאו ב- tRNAs. לפיכך, שילוב של puromycin לתוך מתארך polypeptides תוצאות במהדורה מוקדמת של polypeptides puromycilated קטום רבים המתאימים מתורגם באופן פעיל mRNA9,11,12 .
באמצעות שיטה זו, ניתן היה להעריך פעיל תרגום בתוך אלמנה זמן קצר (למשל, 5 דקות) במהלך אדהזיה הסלולר באמצעות של נוגדנים ספציפיים נגד puromycin על תאים היו בתוספת האנטיביוטיקה לתקופות 5-מין בנקודות זמן שונות במהלך תהליך אדהזיה5תאים. הדיוק של שיטת זו מסתמכת על נוגדנים ספציפיים מאוד נגד את moiety puromycilated. זיהוי immunofluorescent מפוליפפטיד puromycilated מספק של repartition subcellular הכללי של mRNA שתורגם, אשר גם ניתן לכמת בדיוק רב באמצעות מערכות הדמיה קונפוקלי.
לכן, השיטה מציעה אופציה רלוונטית עבור מספר רב של מעבדות לימוד מנגנוני הרגולציה translational המעורבים בתהליכים כגון פרור עצביים6,13,14, 15, מורפוגן mRNA לוקליזציה ותרגום במהלך פיתוח16,17. זה גם מתאים במיוחד לימודי תרגום לשפות אחרות או ממודר במהלך מהיר אירועים ביולוגיים כגון נדידת תאים, הדבקות או חדירה או להעריך פשוט טיפולים בסמים עלול לגרום שינויים translational5, 7 , 18. בסך הכל, שיטה זו מאפשרת עבור הפריט החזותי של אירועים תרגום לשפות אחרות או מבוקר בצורה מהירה, מדויקת וחסכונית.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>wisent</td><td>325-043 EL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן פורויצין 12D10</td><td>EMD מיליפור</td><td>MABE343</td><td>< דילול כתם מערבי 1:25,000br/> דילול אימונופלואורסנטי 1:10,000</td></tr><tr><td>IgG נגד עכברים, איתות תאי נוגדנים מקושרים ל-HRP</td><td> טכנולוגיה</td><td>7076</td><td>דילול כתם מערבי 1:8,000</td></tr><tr><td>ברק מערבי פלוס-ECL</td><td>פרקין אלמר</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר IgG (H+L), F(ab')2 שבר (Alexa Fluor 488 מצומד)</td> <td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>4408</td><td>דילול אימונופלואורסצנטיות 1:400</td></tr><tr><td>CF568 פלואידין</td><td>ביוטיום</td><td>00044</td><td>דילול אימונופלואורסצנטיות 1:400</td></tr><tr><td>ציקלוהקסמיד</td><td>סיגמא</td><td>C1988-1G</td><td>50&מיקרו; גרם/מ"ל ריכוז סופי</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>ריכוז סופי 1&micro; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>bio-Basic</td><td>PJ593</td><td>2.5&micro; גרם/מ"ל עד 10&מיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>איבידי &מיקרו;-צלחת 35 מ"מ, גבוהה, ibiTreat</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>תאי MRC-5</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>תאי HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7 תאי</td><td>ד"ר מזרועי (אוניברסיטה&eacute; Laval)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fv1000</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>מערכת הדמיה קונפוקלית</td></tr><tr><td>תוכנת</td><td></td><td></td> פיג'י <td>http://fiji.sc</td></tr><tr><td>PBS (Phosphate BuffeRed Saline)</td> <td>ביו-בייסיק</td><td>PD8117</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד 37% פתרון</td><td>ביו-בייסיק</td><td>C5300-1</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>ביו-בייסיק</td><td>TB0198</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>טווין20</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

מנגנוני ויסות ה-mRNA תרגום מעורבים תהליכים ביולוגיים שונים, כגון פיתוח קו נבט, תאית התמיינות organogenesis, כמו גם מחלות מרובות. פרסומים רבים הראו בצורה משכנעת למנגנונים הספציפיים לווסת בחוזקה mRNA תרגום. עניין גדל בוויסות הנוצרות על-ידי תרגום של ביטוי חלבון הובילה בפיתוח שיטות רומן ללמוד ולעקוב אחרי דה נובו חלבון סינתזה ב- cellulo. עם זאת, רוב השיטות האלה הם מורכבים, הפיכתם יקר, לעיתים קרובות הגבלת מספר מטרות mRNA שניתן ללמוד. כתב יד זה מציעה שיטה הדורשת רק בסיסי ריאגנטים, מערכת הדמיה פלורסצנטיות קונאפוקלית כדי למדוד והמחש את השינויים בתרגום mRNA המתרחשים בכל שורת התאים בתנאים שונים. לאחרונה להשתמש בשיטה זו כדי להציג תרגום לשפות אחרות המבנים subcellular של תאים חסיד על פני תקופה קצרה של זמן, ולכן מציע את האפשרות להמחיש תרגום דה נובו לתקופה קצרה במהלך מגוון ביולוגי תהליכים או של אימות שינויים בפעילות translational בתגובה לגירויים מסוימים.

להבחין במדויק באירועים תרגום באמצעות התאגדות puromycin, זה קריטי כדי לקבוע את התנאים אופטימליים עבור כל קו תא כי כל מראה שונה puromycin התאגדות קינטיקה (איור 1)9,11 12, ,18. מכאן, כדי לאמת puromycin התאגדות, זה צורך להתייחס לקו התא הרצוי עם קשת מתוקננת של ריכוז puromycin (1.0 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0 µg/mL) לתקופות שונות (5 ו- 10 ד...

כתב יד זה מתאר שיטה כדי להמחיש ולכמת תרגום לשפות אחרות אירועים בתאים subcellular. הגישה המוצעת כתב יד זה דורש מערכת הדמיה קונאפוקלית בסיסית, ריאגנטים, והוא מהיר וחסכוני.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להדמיות ולכימות של אירועי תרגום (translation) ממוקמים המתרחשים במהלך השלבים הראשוניים של היצמדות תאים. לשיטה זו יישומים רחבים. השתמשו בה בכל פעם שיש לבחון תגובת תרגום ספציפית ומהירה, כגון בניתוח נדידה של תאים, היצמדות, או תגובה מוקדמת לתרופות.היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם שהיא פשוטה, מהירה וחסכונית. היא דורשת רק puromycin, נוגדנים המכוונים נגד puromycin, ומערכת הדמיה סטנדרטית של סריקה קונפוקאלית. כדי להתחיל, הכינו תרחיף של תאי MRC-5.בצעו טריפסינציה, ולאחריה סרכזגציה, הסרה של הנוזל העליון, ולאחר מכן השהיה מחדש ב-DMEM עם ten percent FBS, בריכוז של 40 thousand cells per milliliter. דגרו את התרחופף בסיבוב עדין למשך 20 דקות כדי לפרק לחלוטין את קומפלקסי ההיצמדות המוקדיים (focal adhesion complexes). שלב זה הוא קריטי.בשלב הבא, העבירו מנות של 2 ml מהסספנסיה לשתי צלחות עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר, והדגירו אותן כדי לאפשר היצמדות תאית ויצירת SiC. לאחר 40 דקות, טפלו בצלחת אחת ב-cycloheximide והחזירו אותה לאינקובטור. צלחת זו תשמש כביקורת שלילית.לאחר 55 דקות, יש להוסיף puromycin לשתי הצלחות בריכוז שנקבע מראש, ולהדגיר את הצלחות למשך חמש דקות נוספות. לאחר שעה של זריעה וחמש דקות של חשיפה ל-puromycin, יש לשטוף כל צלחת פעמיים עם 2 mL של PBS קר מאוד. לאחר מכן, יש ל

quantitative-immunofluorescence-to-measure-global-localized

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מדגים שיטה לניטור חלבון תא נגוע 0, ICP0 סחר בזיהום הרפס סימפלקס-1. לאחר סינתזת נובו, ICP0 עובר טרנסלוקציה לגרעין, ומאוחר יותר עובר לציטופלסמה במהלך התקדמות הזיהום. מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי חושף ומנתח את הלוקליזציה התת-תאית של החלבון, ומציע תובנות לגבי הסחר שלו לאורך שלבי זיהום.

טכניקת אימונופלואורסנציה ללוקליזציה של חלבונים נגיפיים בתאים נגועים

כאן אנו מתארים שיטה לדמיין mRNAs endoplasmic reticulum הקשורים בתאי תרבית רקמת יונקים. טכניקה זו כרוכה permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה עם digitonin להסיר תוכן cytoplasmic אחרי...

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

כאן, פותחה בדיקת פלואורסצנציה כמותית חדשה כדי למדוד שינויים ברמת חלבון במיוחד בצנטרוזומים על ידי נורמליזציה של עוצמת הקרינה של החלבון לזו של תקן פנימי מתאים.

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

סוגי התאים הדבקים העיקריים שמקורם בשריר אנושי הם תאים מיוגניים ופיברובלסטים. כאן, אוכלוסיות התאים מועשרות באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי המבוסס על אנטיגן CD56. תיוג חיסוני לאחר מכן עם נוגדנים ספציפיים ושימוש בטכניקות ניתוח תמונה מאפשר כימות של מאפיינים ציטופלזמיים וגרעיניים בתאים בודדים.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

פרוטוקול זה מתאר שיטה רגיש למדוד את קצב ההעברה nucleocytoplasmic בתוך נוירון כמו NSC-34 תאים תאים על ידי כימות השינוי בזמן אמת ביבוא גרעיני של חלבון NLS-NES-GFP.

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

ההתאמה המדויקת של תושבים גולג'י חיוני להבנת פונקציות הסלולר של גולג'י. עם זאת, מיקרוסקופ אופטי קונבנציונאלי אין אפשרות לפענח את מבנה תת-גולג'י. כאן נתאר את פרוטוקול שיטה סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה קונבנציונאלי המבוסס באופן כמותי לקבוע לוקליזציה תת-גולג'י של חלבון.

לוקליזציה כמותית של חלבון גולג'י על ידי הדמיה המסה מרכז של זריחה

אנו מתארים את השימוש immunoblotting כמותיים כדי לאמת היסטולוגיה immunofluorescence בשילוב עם ניתוח תמונות כאמצעי לכימות חלבון עניין בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע דגימות רקמה (FFPE). התוצאות שלנו להפגין את התועלת של היסטולוגיה immunofluorescence עבור ברור הכמות היחסית של חלבונים סמן דגימות ביופסיה שגרתית.

Immunoblotting כמותית של שורות תאים כסטנדרט לאימות Immunofluorescence לכימות תנועת סמן חלבונים בדגימות הרקמות שגרתיות

כאן, אנו מתארים גישה כמותית לקביעת ההתפלגות של חלבון סינפטית יחסית חלבון סמן באמצעות צביעת immunofluorescence ', ' מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח מבוססת מחשב.

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

Reproducibly לספור את המספרים של mRNAs ב oocytes בודדים, מולקולה בודדת RNA פלורסצנטיות באתרו הכלאה (RNA-דג) היה אופטימיזציה עבור תאים שאינם מחסידי. Oocytes נאספו, hybridized עם הגששים ספציפית התעתיק, לכמת באמצעות תוכנה כימות של התמונה.

השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (SM-דג) כדי mRNAs Quantify ו Localize ב Oocytes מאתר

מעקב אחר אירועי תרגום בודדים מאפשר מחקרים קינטיים ברזולוציה גבוהה של מנגנוני תרגום תלויי כובע. כאן אנו מדגימים מבחנה במבחנה של מולקולה אחת המבוססת על אינטראקציות הדמיה בין נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית לפפטידים המתהווים המתויגים באפיטופ. שיטה זו מאפשרת אפיון מולקולה אחת של קינטיקה של חניכה והתארכות פפטיד במהלך תרגום פעיל תלוי כובע במבחנה.

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

למדו שיטת אימונופלואורסצנציה כמותית לחקר תרגום מקומי בתאי MRC-5 במהלך הידבקות תאית. טכניקה זו מאפשרת הדמיה וכימות מהירים של אירועי תרגום בתאים חיים באמצעות פיורומיצין ומיקרוסקופ קונפוקלי.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

גלה סרטונים נוספים