Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לדמיין ולכמת אירועי תרגום ממודרים המתרחשים במהלך השלבים הראשונים של הידבקות התאים. לשיטה זו יש יישום רחב. השתמש בו בכל פעם שתגובת תרגום ספציפית מהירה עשויה להיות מבחן, כגון בעת ניתוח נדידת תאים, הידבקות או תגובה מוקדמת לתרופות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה, מהירה וחסכונית. זה דורש רק פורומיצין, נוגדנים המכוונים נגד פורומיצין, ומערכת הדמיה סטנדרטית של סריקה קונפוקלית. כדי להתחיל, בצע השעיה של תאי MRC-5.

השתמש בטריפסיניזציה, ואחריה צנטריפוגה, הסרת הסופרנטנט, ואז השעיה מחדש ב-DMEM עם עשרה אחוז FBS, ב-40 אלף תאים למיליליטר. דגרו את המתלה בסיבוב עדין למשך 20 דקות כדי לנתק לחלוטין את מתחמי ההדבקה המוקדית. זה קריטי.

לאחר מכן, לתוך שתי צלחות עם תחתית זכוכית של 35 מילימטר, הוסיפו תרחיף של שני מיליליטר aliquots, ודגרו אותם כדי לאפשר הידבקות תאית והיווצרות SiC. לאחר 40 דקות יש לטפל בצלחת אחת בציקלוקסימיד ולהחזיר אותה לחממה. צלחת זו תתפקד כבקרה שלילית.

לאחר 55 דקות יש למרוח פורומיצין על שתי הצלחות בריכוז שנקבע מראש, ולדגור על הצלחות למשך חמש דקות נוספות. לאחר שעה של זריעה וחמש דקות של פורומיצין בשיתוף פעולה, יש לשטוף כל צלחת פעמיים עם שני מיליליטר PBS קר כקרח. לאחר מכן תקן את התאים עם מיליליטר אחד של ארבעה אחוז פורמלדהיד ב- PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הקיבוע יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS, ואז לחדור את התאים באמצעות 500 מיקרוליטר של 0.5 אחוז טריטון X-100 ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הצלחות שלוש פעמים עם PBS, ולאחר מכן מרחו 500 מיקרוליטר של אחוז BSA אחד ב- PBS. המשיכו בדגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות נוספות.

כדי להסיר עודפי BSA, שטפו את התאים שלוש פעמים עם 0.1 אחוז Tween-20 ב-PBS. כעת, דגרו על התאים עם 300 מיקרוליטר של נוגדן נגד פורומיצין. הסר את הנוגדן הלא קשור באמצעות שלוש שטיפות עם 0.1 אחוז Tween-20.

לאחר מכן, יש למרוח שלוש מאות מיקרוליטר של תערובת של שני נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור כדי לדמיין פוליפפטידים פורומיקולטים ודה פקטם. דגרו על התאים למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר שעה יש לשטוף את הצלחות שלוש פעמים כדי להסיר את הנוגדנים הלא קשורים ולאחר מכן למרוח שלוש מאות מיקרוליטר של תמיסת Tween-20 של 0.1 אחוז, בתוספת DAPI.

אפשר ל-DAPI להישאר בתאים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, שטפו את התאים ארבע פעמים נוספות, וסיימו בשטיפה ב-PBS טהור. לאחר מכן, אחסן את התאים בשני מיליליטר PBS להדמיה.

באמצעות כל מערכת הדמיה קונפוקלית זמינה מסחרית, קבע תחילה את ההגדרות המתאימות הממקסמות את הטווח הדינמי לכימות ניתן להשיג התמקדות בכימות רק אם נמנעים מרוויה בגודל שיא והריכוז מותאם כראוי. ניתן להשיג את ההגדרה על ידי התאמה קפדנית של יתרון כוח הלייזר וההיסטים.

ראשית, התאם את גורם הזום ואת מספר הפיקסלים כדי לייעל את גודל הפיקסלים. עשה זאת על פי משפט נייקוויסט. לאחר מכן, הפחת את מהירות הסריקה והשתמש במיצוע כדי לשפר את יחס האות לרעש.

לאחר מכן, קבע ידנית את מישורי המוקד העליונים והתחתונים המתאימים לאורך ציר Z, והגדר את גודל הצעד על ידי חישוב הרזולוציה הצירית וחלוקת מרחק זה ב-2.3. התוצאה האופיינית היא 20 עד 25 שכבות תמונה. לאחר שינוי ההגדרות, רכוש תמונה קונפוקלית של תא בודד שלם באמצעות יעד טבילת שמן של 60x Plan Apo עם צמצם מספרי של 1.42.

כדי לכמת ולנתח את אותות הפלרופור, פתח תחילה תמונה המתאימה לשכבת מישור z המעניינת בתמונה J.לאחר מכן, באמצעות כלי הציור, צור קו דרך התא שבו רצוי כמות. לאחר מכן, שנה את ריח הקו על ידי לחיצה כפולה על ישר. ערכי העוצמה יחושבו בממוצע לאורך רוחב הקו, לכן השתמש בקו דק יותר כדי למנוע חפיפת אות ממבנים שונים.

לאחר מכן, פרופיל את צפיפות האות לאורך הקו. כעת, חזור על תהליך איסוף צפיפות האות לאורך אותו קו בערוץ המתאים לפלורופור. הערכים תמיד יהיו מסודרים לפי כיוון הקו.

כעת, העתק את נתוני הפרופיל והדבק אותם בגיליון אלקטרוני לניתוח. חזור על תהליך זה של איסוף נתונים מכל תמונת מישור Z מעניינת לפני שתמשיך בניתוח הסטטיסטי. לחלופין, במקום לאסוף אות לאורך ציר, ניתן לאסוף אות מאזור בתמונה.

תחילה השתמש בפונקציית הצורה הגיאומטרית כדי לבחור אזור עניין. לאחר מכן, התאם את רמת הסף כדי להימנע מכל רקע. בהיסטוגרמה של עוצמות פיקסלים, הזיזו את המחוון כדי להתאים את הפיקסלים שייכללו בכימות.

קבעו את הסף להסרת כל הפיקסלים האדומים מחוץ לתא. כעת, הגדר את פרמטרי המדידה הדרושים למדידת האות המעניין ולא אות רקע. החלף את המגבלה לאפשרויות סף וצפיפות משולבת.

לאחר מכן, השתמש בפקודת המדידה. פעולה זו תפתח חלון חדש עם ערכי האפור הממוצעים וספירת הפיקסלים באזור שנבחר. כעת חזור על התהליך, החל את אותו סף כדי לקבוע את עוצמת האות בתא כולו.

לאחר מכן השתמש בנתונים אלה כדי לחשב את היחס בין האות באזור שנבחר לזה של התא כולו. למדידה מדויקת של אירועי תרגום באמצעות שילוב פורמיצין, הוערכו תחילה התנאים האופטימליים למדידה צירית. הושווה ספקטרום של ריכוזים לעומת טיפול של חמש או עשר דקות.

ריכוז הפורומיצין המקובל עבור תאי MRC-5 ו-HeLa היה מעט גבוה יותר ממה שנדרש עבור תאי Huh-7. תאים שטופלו במשך עשר דקות בריכוזי פורומיצין גבוהים ייצרו בעיקר פוליפפטידים פורומיקולטים קטנים יותר. הפוליפפטידים הקטנים יותר נוטרלו מהר יותר, ואינם רצויים.

זמן הדגירה הקצר יותר נחשב אפוא לרצוי יותר. טיפול בציקלוקסימיד הוא בקרה שלילית יעילה וחשובה. בתאי MRC-5 זוהה רק אות פורומיצין חלש לאחר טיפול בציקלוקסימיד.

באמצעות כימות אותות ציריים, ניתן להעריך את הלוקליזציה הכללית של פוליפפטידים פורומיקולים המתאימים לחלבונים שסונתזו לאחרונה ברמות שונות בתוך התא. התפלגות כמותית של האות בכל התא הייתה אפשרית גם כן. עבור כל אחת מהטכניקות, היה חשוב לכמת את האות עבור כל מישור Z בערימת התמונות כדי להעריך במדויק את אירועי התרגום בתא שלם.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך אירוע תרגום בתא תת-תאי. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יום, אם היא מבוצעת כראוי. כשחושבים על ההליך הזה, חשוב לזכור שריכוז הפורומיצין וזמן הדגירה שלו חשובים.

כדי להגביל את הדיפוזיה, עדיף להגביל את זמן הדגירה. חשוב גם להכיר בכך שאיכות סוג רכישת התמונה היא קריטית להשגת תוצאות טובות. אל תשכח שעבודה עם פורמלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו עבודה במכסה מנוע כימי בעת ביצוע הליך זה.