חוקרים פון Willebrand גורם פתופסיולוגיה באמצעות מודל קאמרית זרימה של פון Willebrand פקטור-טסיות מחרוזת היווצרות
14 באוגוסט 2017
בנייר זה, אנו מתארים שיטה להערכת Willebrand פון אנדותל מקדם שחרור, טסית דם עוקבות של לכידת תחת גזירה נוזלים בתגובה לגירויים דלקתיות באמצעות מערכת קאמרית זרימה במבחנה .
המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן ולכמת את היווצרות פקטור פון וילברנד או היווצרות מיתרי טסיות VWF בתגובה להפרשות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של פקטור פון ווילברנד ופתופיזיולוגיה של גוף וואבו-פליאטיבי. זה גם עוזר לנו לענות על שאלות לגבי מוטציות הפוגעות בשחרור פקטור פון וילברנד ובתפקוד קשירת טסיות הדם.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מסכמת את האינטראקציות in vivo בין קולגן תת-אנדותליאלי, תאים אנדואתוליים VWF וטסיות דם במערכת חוץ גופית חזותית וניתנת לכימות. אני מרגיש שההדגמה החזותית של שיטה זו היא חיונית. שלבי המיקרוסקופיה הנדרשים ללכידת היווצרות מחרוזת טסיות VWF בתנאים מרובים בו זמנית בזמן אמת יכולים להיות קשים לשליטה על ידי טקסט בלבד.
התחל בהעמסת 0.5 מיליליטר של מאגר ציפוי קולגן למזרק נעילת לואר של 1 מיליליטר. סובב את קצה המזרק על המאגר של מגלשת תא זרימה ולחץ על הבוכנה לאט עד שכל הנתיב מצופה וכל מאגר מלא. מלאו את המאגרים כדי להבטיח שכל אחד מהם מלא.
כאשר כל הנתיבים נטענו, דגרו את החדר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת, השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להסיר את מאגר ציפוי הקולגן. לאחר מכן יש לשטוף כל נתיב עם HBSS, לשאוב את מי המלח עם פיפטה של 200 מיקרוליטר.
לאחר השלכת הסבב השלישי של HBSS, הוסף בערך שלוש פעמים 10 לתאי האנדותל השישי של צמיחת הדם למיליליטר ב-100 מיקרוליטר של מדיום גידול, בתוספת 10% FBS לכל נתיב של תא הזרימה. לאחר מכן החזירו את החדר לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, והחליפו את המדיום כל שמונה עד 12 שעות. כדי להרכיב את מנגנון הזרימה, חבר תחילה מחבר מרפק זכר אחד לקצה אחד של כל אחת משלוש חתיכות של 70 סנטימטר של צינורות סיליקון סטריליים.
וחבר מתאם נעילת לואר נקבה אחד לקצה השני של כל צינור. חבר את מתאמי נעילת הלואר הנקביים למזרקים בודדים של 20 מיליליטר ותכנת את משאבת המזרק. טען את המזרקים על המשאבה, ואבטח היטב את הסוגריים סביב המזרקים והבוכנה.
לאחר מכן, חבר פתיונות מרפק זכריים בודדים לשני הקצוות של שלושה חתיכות שונות של 20 סנטימטר של צינורות סיליקון סטריליים, וחבר מחט קהה בגודל 18 לאחד משלושת פתיונות המרפק. לאחר מכן, במיקרוסקופ דיסק מסתובב המצויד בבמה אוטומטית לחלוטין, בחר את המטרה פי 20 והגדר את הגדרות הערוץ המתאימות. כדי להשיג את טווח הנתונים הדינמי המלא, הגדר את המכשיר המצמד של מטען הכפלת האלקטרונים לרווח הכפלת אלקטרונים של 150 עם זמן חשיפה של 200 אלפיות השנייה.
כוונן את עוצמת הלייזר של 491 ננומטר ל-20% והשתמש בתוכנת המיקרוסקופ כדי לסמן את מרכז כל שלושת הנתיבים. הגדר את טווח ה-Z ל-1.0 מיקרומטר ואת גודל הצעד ל-0.5 מיקרומטר. לבסוף, בחר את משך הזמן ואת מרווח הזמן כדי ללכוד תמונה כל 10 שניות ב-60 נקודות זמן לשקופית.
כדי לגרום להיווצרות מיתרי טסיות VWF החליפו את מדיום התרבות משלושה נתיבים של תא הזרימה, במדיום נטול סרום בלבד כבקרה, ואז הממריץ המעניין מדולל ב-100 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום לנתיבים הנוספים. לאחר מכן דגרו את החדר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף תקופת הגירוי, שטפו את כל שלושת הנתיבים עם 100 עד 200 מיקרוליטר PBS, והשתמשו בקליפסים של כלי הדם כדי למפות את תא הזרימה על מעמד מגלשה.
חבר מחבר לואר זכר אחד מקצה חתיכת צינור של 70 סנטימטר לכל מאגר של תא הזרימה. והפעל את משאבת המזרק כדי להסיר את שטיפת ה-PBS. פיפטה PBS נוסף למאגר תא הזרימה הנגדי כדי להבטיח שהנתיבים לא יתייבשו.
לאחר אישור זרימה שווה, השהה את משאבת המזרק. חבר מזרק 5 מילילטר עם מצמד נעילת לואר נקבה למחבר הלואר הזכר החופשי הראשון. וטבלו את המחט הקהה בצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל תמיסת טסיות שטופה.
לאט, משוך את תמיסת הטסיות דרך הצינור כדי לוודא שאין בועות אוויר בתוך המערכת. חבר את ה-luer הזכר למאגר הפתוח של תא הזרימה, והעמיס את שני הנתיבים האחרים בתמיסת טסיות דם, כפי שהודגם זה עתה. בדוק את הגדרת מערכת הזרימה כדי לוודא שכל החיבורים מאובטחים.
הפעל מחדש את משאבת המזרק ודמיין את זרימת הטסיות למשך 10 דקות בחושך. לאחר מכן נתק את הלואר מצינור היניקה במאגר תא הזרימה. ומלא את המאגר ב-PBS כדי לשמור על זרימת מלח עדינה על פני השכבה החד-שכבתית של תא האנדותל.
כדי לכמת את היווצרות מחרוזת טסיות ה-VWF, צלם 10 תמונות לכל שקופית מכל נתיב ללא חפיפה מאמצע השקופית. לאחר שכל התמונות התקבלו, פתח את תוכנת עיבוד התמונה ולחץ על תמונה, כוונן וניגודיות בהירות. כדי להתאים את הבהירות של התמונה הראשונה, גרור את פס הגלילה עד שניתן יהיה לראות את הטסיות המודבקות מספיק טוב לכימות.
לאחר מכן, רשום מחרוזת טסיות VWF כאשר נצפים שלושה, או יותר, טסיות מיושרות וספור את כל המיתרים בתמונה. לאחר התחלת תנאי הזרימה, התאים הלא מטופלים מדגימים מעט מאוד מיתרי טסיות VWF בהשוואה לתאים שטופלו בהיסטמין, או PMA. המציגים בממוצע שניים עד שלושה מיתרים לכל שדה ראייה.
יתר על כן, היסטונים, המפעילים טסיות דם כמו גם תאי אנדותל גורמים לייצור של יותר מיתרי טסיות VWF מאשר בקרות לא מטופלות, או היסטמין, או PMA. בזמן ניסיון הליך זה, שמור על טסיות הדם שקטות עד לניסוי הזרימה על ידי השלכת צינור איסוף הדם הראשון, שמירה על כל הריאגנטים בטמפרטורת החדר ושימוש בטכניקת פיפטה עדינה. ניתן לבצע שינויים בהליך זה כדי להעריך היווצרות מיתרי טסיות VWF בנוכחות לויקוציטים, חומרים המפעילים טסיות דם או פירוק מיתרים על ידי אטום האנזים החותך TS13.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך היווצרות מיתרי VWF המושרה על ידי הפרשה ומודל תא זרימה במבחנה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה להערכת שחרור של גורם פון וילברנד (VWF) אנדותליאלי ולכידת טבחיות תחת מאמץ גזירה של נוזלים עקב גירויים דלקתיים, באמצעות מערכת תא זרימה in vitro. הטכניקה מאפשרת תצפית וכימות של היווצרות שרשראות VWF-טבחיות בתגובה לחומרי הפרשה (secretagogues).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- המוסטזיס
רקע
- גורם פון וילברנד (Von Willebrand factor) ממלא תפקיד מכריע בקרישת דם.
- הבנת שחרור VWF והקישור לטסיות חיונית למחקר של מצבים פתופיזיולוגיים שונים.
- מוטציות המשפיעות על VWF עלולות להוביל להפרעות דימום.
- שיטה זו מדמה אינטראקציות in vivo בסביבה מבוקרת.
מטרת המחקר
- כימות האינטראקציות בין VWF לטבקיות תחת מאמץ גזירה.
- בדיקת ההשפעות של גירויים דלקתיים על שחרור VWF.
- בחינת ההשלכות של מוטציות ב-VWF על קישור טבקיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מערכת תא זרימה in vitro לסימולציה של מאמץ גזירה.
- טכניקות מיקרוסקופיה לצפייה בזמן אמת.
- ניתוח כמותי של היווצרות שרשראות VWF-platelet.
- הערכת השפעות של סקרטגוגים על שחרור VWF.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של אינטראקציות בין VWF לטסיות דם.
- הדגמה של השפעת גירויים דלקתיים על שחרור VWF.
- אספקת תובנות לגבי המכניקה של קישור VWF-טסיות דם.
- הדגשת חשיבותה של שיטה זו לחקר הביולוגיה של VWF.
מסקנות
- שיטה זו משחזרת ביעילות תנאים in vivo למחקר של VWF.
- היא מהווה כלי בעל ערך להבנת פתולוגיות הקשורות ל-VWF.
- ההדגמה הוויזואלית משפרת את ההבנה של אינטראקציות מורכבות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל תא זרימה זה מאפשר הערכה כמותית של אינטראקציות בין VWF לטבקיות תחת גזירה פיזיולוגית, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטית בתיקוף של יעדים לטיפול בתרומבוזה והמוסטזיס. באמצעות ויזואליזציה של שחרור VWF והיקשרות טבקיות בהשראת סקרטגוגים בזמן אמת, השיטה מספקת ביטחון חיזואי להערכת מסלולים פרו-תרומבוטיים ותפקוד לקוי של האנדותל. היא תומכת בהחלטות בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הבהרת הרלוונטיות הפתופיזיולוגית של VWF במודלים של היווצרות קרישי דם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות לגבי נתיבי הדבקות ואגרגציה של טסיות המתווכות על ידי VWF.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות VWF באמצעות יצירת שרשראות כמותיות תחת מאמץ גזירה.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מידול דינמיקה של VWF המעוגן לאנדותל, הרלוונטית להיווצרות גרעין קריש דם.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: הכנת מערכות אנדותליאליות הרלוונטיות למחלה לצורך הערכה סטנדרטית של שחרור VWF ולכידת טסיות.
- ערך תפעולי: אספקת קריאות כמותיות הניתנות לשחזור של היווצרות שרשראות VWF-platelet לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך מדעי: מאפשר הערכה מהימנה של תרכובות על ידי מדידת השפעות על שחרור VWF וקישור טסיות תחת תנאי זרימה מבוקרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם לאסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים על ידי מידול שחרור VWF בתגובה לגירויים דלקתיים כגון היסטונים חוץ-תאיים.
- ערך תפעולי: מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות אינטראקציות בין VWF לטבקיות התלויות במאמץ גזירה וניתנות לשחזור.
- ערך מדעי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי כימות השפעות של גירויים פרו-קואגולנטיים על נקודות סיום רלוונטיות לתרומבוזיס.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי המולקולה המובילה, על ידי אספקת תוצאות כמותיות תלויות-גזירה של אינטראקציות בין VWF לטבקיות, המעניקות תובנות מנגנוניות ומסייעות בסריקת תרכובות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על מנגנוני שחרור של VWF ותפקוד קישור טבקיות תחת גזירה פיזיולוגית.
- סריקה: מספק מערכות אנדותליאליות מוכנות לבדיקה עם תוצאים כמותיים הניתנים לשחזור להערכת מודולטורים של שחרור VWF.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה של היווצרות שרשראות VWF-platelet בתנאים שונים באמצעות כימות סטנדרטי מבוסס-תמונה של צבירי טבקיות מסודרים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי מידול תגובות אנדותליאליות לגירויים פרו-קוואגולנטיים הרלוונטיים לפתופיזיולוגיה של תרומבוזיס.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת ביולוגיה של VWF על פני מספר סקרטגוגים, מודלים גנטיים והתערבויות טיפוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי באימות המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולי האינטראקציה בין VWF לטסיות דם.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות ויזואליזציה כמותית בזמן אמת של היווצרות שרשראות תחת גזירה מבוקרת.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות של go/no-go על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של סיכון תרומבוטי ופרופילי אקטיבציה אנדותליאלית.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון על ידי כימות פוטנציאל היווצרות תרומבוס תלוי VWF במערכות רלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאי אנדותל, דינמיקת זרימה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית לצורך הקמה וכמתית מדויקות.
- תלוי במיכשור ייעודי הכולל מערכות תאי זרימה, משאבות מזרקים ומיקרוסקופי דיסקים מסתובבים עם יכולות EMCCD.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הגירוי, הכנת הפלטלטים וספי סף של ניתוח תמונות כדי להשיג תוצאות הדירות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה למודלים אנדותליאליים שונים, תרבולי משותף של לוקוציטים, או בדיקות של פיסול פרוטאוליטי.
- מוגבל על ידי המורכבות הטכנית של שמירה על זרימה יציבה ומניעת היווצרות בועות במהלך פרפוזיה של טסיות, כפי שצוין באזהרות הפרוצדורה.
