Name: חוקרים פון Willebrand גורם פתופסיולוגיה באמצעות מודל קאמרית זרימה של פון Willebrand פקטור-טסיות מחרוזת היווצרות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: חקור את פתופיזיולוגיית פקטור von Willebrand באמצעות מערכת תאי זרימה מבוקרת. שיטה זו מאפשרת תצפית וכימות של יצירת שרשראות VWF-טסיות בתגובה לסיקרטוגוגים תחת מאמץ גזירה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אליסון Michels הוא הנמען של פרדריק בנטינג ו צ'ארלס הטוב ביותר בקנדה לתואר שני את המלגה מ קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR). לורה ל' Swystun הוא הנמען מלגת CIHR. דוד Lillicrap הוא מקבל כיסא מחקר קנדה ב Hemostasis מולקולרית. מחקר זה מומן בחלקו על ידי CIHR הפעלה גרנט (פ'-97849).

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

בעוד הרלוונטיות פיזיולוגיים של VWF-טסיות מיתרים נשאר שנוי במחלוקת עקב פירוק מהיר שלהם בנוכחות פרוטאז VWF ביקוע ADAMTS13, הם לשמש מודל לכימות במבחנה של טסיות הגיוס באמצעות VWF לאתר- אשר כגון שעלולים להיווצר רכוש מקומי העלאות היסטון רמות5. יתר על כן, בפתולוגיות חסר פעילות כל כך ADAMTS13 כמו קדחת היווצרות קרישי דם (טרומבוציטופניה) - או ב- microenvironments דלקתיות - איפה ADAMTS13 פעילות עכבות-VWF-טסיות מחרוזות יכול להיות שנצפו ויוו32 ו אולי לתרום טסיות דם ext...

פקקת היא הסיבה המובילה לתמותה ברחבי העולם1 , יכולים לפתח תגובה todysregulated טסיות ההפעלה של תרומבין דור שני עורקים veinsand. פלזמה רמות של VWF מווסת מפתח של קרישת הדם, לפיה רמות נמוכות (< 50%) התוצאה הפרעת דימום המכונה Willebrand פון המחלה (VWD)2 ורמות גבוהות (> 150%) הם קשורים לסיכון מוגבר של ורידים3 ו פקקת עורקים4 .
VWF הוא גליקופרוטאין multimeric מסונתז על ידי megakaryocytes ותאי אנדותל ומאוחסנים טסיות α-גרגירים, WPBs, בהתאמה. על אתגר hemostatic, VWF יכול להשתחרר מן WPBs אנדותל לקשור טסיות הדם במחזור תאי אנדותל מופעל5 או קולגן חשוף על קיר הספינה6. עיגון של VWF לתאי אנדותל הוכח להיות מתווכת על-ידי בחירת שמלות P7 ואינטגרין αvβ38. שחרור עוקבות של טסיות α-גרגר חנויות יכולה להמשיך להגדיל ריכוזים VWF לשפות אחרות כדי לייצב טסיות-טסיות האינטראקציות עבור טסיות הכנס היווצרות, לגרדום לצורך התפשטות של קרישת הדם בהתאם להירארכיית הקשרים, פיברין התצהיר. פעילות טסיות-איגוד של VWF מוסדר על ידי המבנה multimeric שלה, עם משקל מולקולרי גבוה multimers בעלי פעילות hemostatic גדול9,10. במחזור, VWF גם משמש כנשא עבור השמיני גורם קרישה.
נוזל גזירה היא הרגולטור חיוני של פיזיולוגיה VWF. בהיעדרו של גזירה, VWF קיימת בטופס הכדוריים, הסתרת מחייב תחומים עבור טסיות גליקופרוטאין ליברות אדהזיה11. כאשר קיים מאמץ גזירה, באתר של המחשוף metalloprotease, disintegrin, ו metalloprotease עם מוטיב thrombospondin (ADAMTS13), נחשפת. ADAMTS13 cleaves מחרוזות VWF עירום, מעוצבים טסיות כדי לווסת את גודל multimer, ובכך מקצר את פעילות hemostatic12.
VWF הוא חלבון שלב חריפה, גירויים רבים, לרבות היפוקסיה13, זיהום14ציטוקינים proinflammatory, הוכחו לתווך שחרור תאי אנדותל VWF. דומה לשני סוכני דלקתיות, שינויים היסטוניים חוץ-תאית יש גם הוכח לזירוז במהדורה VWF מערכתית עכברים15,16 והפעלה של טסיות במבחנה17,18, 19. זה הוצגה להיות תלוי סוג של היסטון, כמו הבדלים ליזין ו ארגינין תוכן עשוי להשפיע על תפקוד15. מטרות המחקר שלנו להקים תא זרימה דגם לחקור את ההשפעה של ליזין-עשיר (HK) וללכוד ארגינין-עשיר (HR) היסטון יחוברו, secretagogues על אנדותל VWF שחרור, טסית דם בזמן אמת, פוטנציאל םיעוריא מוקדם דלקת-induced פקקת.
מתודולוגיה קאמרית זו הזרימה recapitulates ויוו אינטראקציות בין קולגן subendothelial, תאי אנדותל, VWF טסיות הדם במערכת במבחנה הוא חזותי, הדירים לכימות. היא מאפשרת ההערכה בזמן אמת של כל ההיבטים של מסלול המסדירה את האינטראקציות VWF-טסיות, כולל הפרשת WPB, הפעלת טסיות VWF proteolysis. מחקרים של VWF בתנאים מבוקרים גזירה שימשו להערכת מוטציות VWD שפוגעים שחרור VWF, תפקוד טסיות מחייב20, פיזיולוגיה WPB21, VWF המחשוף מאת ADAMTS135. אנו משתמשים מתודולוגיה זו כדי לכמת את היווצרות מחרוזת VWF-טסיות כתוצאה גירוי דלקתי: שינויים היסטוניים חוץ-תאית.

<table><tbody><tr><td>היסטונים לא מופרדים של עגל-תימוס (UH)</td><td>וורת'ינגטון ביוכימיה</td><td>HLY</td><td>משוחזר במצע מופחת סרום (5 מ"ג/מ"ל)</td></tr><tr><td>היסטונים עשירים בליזין עגל-תימוס (HK)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H5505</td><td>משוחזר במצע מופחת סרום (5 מ"ג/מ"ל)</td></tr><tr><td>היסטונים עשירים בארגינין עגל-תימוס (HR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4830</td><td>משוחזר במצע מופחת סרום (5 מ"ג/מ"ל)</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>משוחזר ב-DMSO (20 מ"מ)</td></tr><tr><td>היסטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H7125-1G</td><td>משוחזר במים (50 מ"ג/מ"ל)</td></tr><tr><td>3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td><td>Invitrogen</td><td>D273</td><td>משוחזר במתנול (20 מ"מ)ארנב</td></tr> <tr><td>אנטי-VWF ציפוי נוגדן</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>עבור VWF ELISA</td></tr><tr><td>נוגדן לזיהוי ארנב נגד VWF, HRP מצומד</td><td>DAKO</td><td>P0026</td><td>עבור VWF ELISA ובדיקת קשירה של היסטון-VWF</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp שטוח תחתון 96 בארות מיקרו-פלטות</td><td>eBioscience</td><td>44-2404-21</td><td>לבדיקת קשירת היסטון-VWF</td></tr><tr><td>Immulon 4 HBX מיקרוטיטר תחתון שטוח 96 בארות צלחות</td><td>Thermo Scientific</td><td>3855</td><td>עבור VWF ELISA</td></tr><tr><td>Humate-P</td><td>CSL Behring</td><td>N/A</td><td>קומפלקס גורם פון ווילברנד אנושי שמקורו בפלזמה / פקטור VIII</td></tr><tr><td>התייחסות נורמלית פלזמה</td><td>דיוק ביולוגיקה</td><td>CCNRP-05</td><td>עבור VWF ELISA עקומה סטנדרטית</td></tr><tr><td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8287</td><td>מוצר שווה ערך זמין דרך ThermoFisher Scientific (מספר קטלוגי: 34006)</td></tr> <tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>לתרבית וראשונית זריעה של</td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של BOEC Hank (HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>קולגן זנב עכברוש סוג 1</td><td>קורנינג</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I מדיה מופחתת סרום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>לגירוי תאי אנדותל</td></tr><tr><td>METAMORPH מיקרוסקופיה אוטומציה וניתוח תמונה תוכנה</td> מכשירים <td>מולקולריים</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>צינורות איסוף דם BD Vacutainer, ללא תוסף</td><td>BD Biosciences</td><td>366703</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide III 0.1 (תאי זרימה)</td><td>Ibidi</td><td></td><td>מוצר זה הופסק. אנו מציעים להשתמש ב-&micro;-Slide VI 0.1 (#80661) או 0.4 (# 80601) ולחשב מחדש את קצב הזרימה ונפח הטסיות הדרושים לשמירה על מתח גזירה של 4.45 דין/סמ"ר</td></tr><tr><td>צינורות סיליקון 1.6 מ"מ ID: 5 מ', מעוקר</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock Connector נקבה: פוליפרופילן טבעי, מעוקר</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>Elbow Luer Connector זכר: פוליפרופילן לבן, מעוקר</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>מחט קהה 18G</td> BD <td>Biosciences</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים 20 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td> New <td>Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Quorum WaveFX- 4X1 מיקרוסקופ דיסק מסתובב</td><td>Quorum Technologies</td><td>N/A</td> תוכנה לעיבוד תמונה ImageJ N/A <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

חוקרים פון willebrand גורם פתופסיולוגיה באמצעות מודל קאמרית זרימה של פון willebrand פקטור-טסיות מחרוזת היווצרות

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

פקטור Willebrand פון (VWF) הוא multimeric גליקופרוטאין קרישה פקטור זה שמתווכת הדבקות טסיות, צבירת באתרים של נזק אנדותל ונושא זה פקטור VIII במחזור. VWF הוא מסונתז על ידי תאי אנדותל משוחרר גם צורונים לתוך הפלזמה או מאוחסן ב- organelles מיוחדים, שנקרא גופות Weibel-Palade (WPBs), לשחרור לפי דרישה, בתגובה אתגר hemostatic. גירויים procoagulant ו- proinflammatory יכול לגרום במהירות WPB אקסוציטוזה ושחרור VWF. רוב שפורסמו על ידי תאי אנדותל VWF מסחררת ב הפלזמה; עם זאת, שיעור של VWF מעוגנת אל פני השטח של תאי אנדותל. בתנאים של הטיה פיזיולוגית, המעוגנת אנדותל VWF יכול לאגד טסיות, ויוצרים מחרוזת VWF-טסיות עשויים לייצג את nidus של כגון היווצרות. מערכת קאמרית זרימה ניתן להתבונן באופן חזותי את שחרורו של VWF מתאי אנדותל, של טסית דם עוקבות ללכוד באופן זה רלוונטי הפתופיזיולוגיה של היווצרות כגון בתיווך VWF הדירים. באמצעות מתודולוגיה זו, תאי אנדותל בתרבית בתוך תא זרימה, מומרץ לאחר מכן עם secretagogues כדי לגרום WPB אקסוציטוזה. טסיות דם שטף הם perfused ואז מעל אנדותל מופעל. טסיות הדם מופעלים, לאחר מכן לאגד מחרוזות VWF מאורכים בכיוון של זרימת נוזלים. באמצעות שינויים היסטוניים חוץ-תאית כמו גירוי procoagulant, proinflammatory, הבחנו היווצרות מחרוזת VWF-טסיות מוגברת על תאי אנדותל שטופלו היסטון בהשוואה לתאי אנדותל ללא טיפול. פרוטוקול זה מתאר הערכה כמותית, חזותי, בזמן אמת של ההפעלה של אינטראקציות VWF-טסיות במודלים של פקקת, hemostasis.

ישירות, כדי להעריך את ההשפעה של שינויים היסטוניים על שחרור תאי אנדותל VWF אנחנו חשופים BOECs confluent בינונית ללא סרום המכיל PMA (בקרה חיובית), אה, בית של HK כבר שעתיים. הראינו כי HK המושרה עלייה 2-fold VWF חלבון (VWF:Ag) בהמדיום של תאי אנדותל שטופלו (איור 1). מעניין, כאשר BOECs היו מגורה עם אה ו- HR, שם פחות VWF:Ag זוהה המדיום מאשר במצב ללא טיפול. אנחנו שיערו כי בגלל שינויים היסטוניים באפשרותך לאגוד ישירות ל- VWF30, הם עלולים באופן ש...

בנייר זה, אנו מתארים שיטה להערכת Willebrand פון אנדותל מקדם שחרור, טסית דם עוקבות של לכידת תחת גזירה נוזלים בתגובה לגירויים דלקתיות באמצעות מערכת קאמרית זרימה במבחנה .

חוקרים פון Willebrand גורם פתופסיולוגיה באמצעות מודל קאמרית זרימה של פון Willebrand פקטור-טסיות מחרוזת היווצרות

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לצפות ולכמת את התהוות שרשראות של גורם פון וילברנד (von Willebrand factor) או VWF-platelet בתגובה לחומרים מעוררי הפרשה (secretagogues). שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בביולוגיה של גורם פון וילברנד ובפיזיולוגיה פתולוגית של גוף עם וובו-פליאטיב (wavo-palliative body). היא מסייעת לנו גם לענות על שאלות בנוגע למוטציות הפוגעות בשחרור גורם פון וילברנד ובפונקציית קישור לטבקיות.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא משחזרת את האינטראקציות in-vivo בין קולגן סוב-אנדותליאלי, תאי אנדותל, VWF וטבקיות במערכת in-vitro ויזואלית וכמותית. אני סבור שההדגמה הוויזואלית של שיטה זו היא חיונית. את שלבי המיקרוסקופיה הנדרשים ללכידה של היווצרות שרשראות VWF-platelet תחת תנאים מרובים ובודדים בו-זמנית ובזמן אמת, עשויים להיות קשים לשליטה באמצעות טקסט בלבד.התחילו בהטענת 0.5 milliliters של תמיסת חיפוי קולגן למזרק luer lock בנפח 1 milliliter. הברגו את קצה המזרק למאגר של שקופית תא זרימה ולחצו על הבוכנה באיטיות עד שכל הנתיב יחוף וכל מאגר יהיה מלא. מלאו את המאגרים עד הסוף כדי להבטיח שכל אחד מהם מלא.לאחר שטענו את כל הנתיבים, דגרו את התא בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 24 שעות. למחרת, השתמשו בפיפטה של 200 microliter כדי להסיר את תמינת הציפוי של הקולגן. לאחר מכן, שטפו כל נתיב ע

investigating-von-willebrand-factor-pathophysiology-using-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מפל הידבקות טסיות מתקיים בנוכחות זרימה גזירה, גורם לא היוו ב קונבנציונאלי (סטטי) היטב הצלחת מבחני. מאמר זה מדווח על assay טסיות צבירה תוך שימוש בתבנית microfluidic צלחת היטב לחקות פיסיולוגי תנאי הזרימה גזירה.

הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים Microfluidic

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

כדי לחקור את האינטראקציה של חיידקים עם כלי הדם תחת לחץ גזירה, מתוארים תא זרימה ומודל מיקרוסקופיה תוך-חיונית מזנטרית in vivo המאפשרים לנתח את גורמי החיידקים והמארח התורמים להידבקות כלי הדם.

במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת

עירוי טסיות דם והמוסטזיס עוצבו באמצעות בנייה מחדש של דם ותאי זרימה מיקרופלואידיים כדי לחקור את תפקוד טסיות הדם. הנתונים מדגימים את ההשלכות של נגע אגירת טסיות דם על המוסטזיס, במבחנה.

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

מאמר זה מתאר מודל ניסיוני של המוסטאסיס המודד פונקציה וקרישה טסיות זמנית. טסיות קרינת הפיברין נמדדות בזמן אמת, וקצב הידבקות טסיות דם, קרישת שיעור, והתחלה של קרישה נחושה. המודל משמש כדי לקבוע מאפיינים טסיות procoagulant תחת זרם מתרכז עבור עירוי.

מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

עבודה זו מתארת ​​שיטה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטי לחקר הדבקה טסיות, התפשטות, והפרשה תחת זרימה. פלטפורמה רב-תכליתית זו מאפשרת חקירת תפקוד טסיות למחקר מכניסטי על פקקת והמוסטאזיס.

Live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה

לויקוציטים בלהיטות אינטראקציה עם טסיות הדם והתאים כלי הדם לאחר פציעה קיר הספינה או בעת דלקת. כאן, אנו מתארים assay מבוסס זרימה שכבתית פשוטה כדי לאפיין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות בין לויקוציטים ושותפים הסלולר שלהם.

מבחני מבוסס זרימה שכבתית לחקור ליקוציט גיוס על תאים בתרבית וסקולרית, טסיות חסיד

מחקר זה מתאר את הניטור המיקרוסקופית של הדבקות הפנקוקוס על מחרוזות וויללרנד של פון וילבלאנד המיוצר על פני השטח של תאים אנושיים מובחנים ראשוניים תחת לחץ הטיה בתנאי זרימה מוגדרים. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב להדמיה מפורטת של מבני תאים ספציפיים וכימות חיידקים על ידי החלת הליכי חיסוני דיפרנציאלי.

זיהום פנאומטי של תאים אנושיים ראשוניים של האדם בזרימה קבועה

ניתן להעריך את תפקוד טסיות הדם תחת זרימה ולדמות החייאה המוסטטית באמצעות מכשיר מיקרופלואידי, שיש לו יישומים ברפואת טראומה ועירוי.

מיקרופלואידיקה בהערכת תפקוד טסיות הדם

מאמר זה מפרט את הפרוטוקול לכימות אחוז הטסיות החיוביות לפקטור רקמה (TF) באמצעות ציטומטריית זרימת דם מלאה, תוך הערכת החלבון: (1) תוך-תאית במצבי מנוחה, ו-(2) על פני התא, הן במנוחה והן בתנאי פעילות. ניתנת גם הנחיות להערכת טסיות חיוביות TF בפלזמה עשירה בטסיות.

ניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי גורמי רקמה בטסיות בבני אדם

עבודה זו מתארת בדיקה מיקרופלואידית המשתמשת במאמץ גזירה כדי להפעיל יצירת קרישי דם בדם ומאפיינת את הקריק באמצעות ממדים מרובים של קריאה. הבדיקה יכולה למדוד את הנטייה הפרותרומבוטית של דגימות דם, ולכן היא שימושית באבחון מחלות, גילוי תרופות, וכן במחקרים מכניים בסיסיים הקשורים לטרומבוזיס.

מבחן פרופיל תרומבוס: פלטפורמה מבוססת מיקרופלואידיקה לאפיון מקיף של תרומבוגנזה ביומכנית

חקור את פתופיזיולוגיית פקטור von Willebrand באמצעות מערכת תאי זרימה מבוקרת. שיטה זו מאפשרת תצפית וכימות של יצירת שרשראות VWF-טסיות בתגובה לסיקרטוגוגים תחת מאמץ גזירה.

חוקרים פון Willebrand גורם פתופסיולוגיה באמצעות מודל קאמרית זרימה של פון Willebrand פקטור-טסיות מחרוזת היווצרות

גלה סרטונים נוספים