Retroviral סריקה: מיפוי MLV אתרי אינטגרציה להגדרת אזורים רגולטוריים ספציפיים לתא

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא למפות את אתרי האינטגרציה של וקטורים רטרו-ויראליים המופקים מנגיף הלוקמיה של העכבר (murine leukemia virus), כדי להגדיר אזורים רגולטוריים ספציפיים לתא. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במחקרי תרפיה גנית ובבקרת ביטוי גנים, כגון היכן הווקטור משתלב בגנום האנושי ואילו אלמנטים רגולטוריים יכולים להיות פעילים באמצעות תת-סוג מסוים. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה בעקבות התבוננות במחקרי תרפיה גנית, שבהם וקטורי MLV משתלבים בתוך פרומוטורים ואנחנסרים פעילים שספציפיים לתתי-סוגים של תאים.

התחל בהדבקה (transduction) של תאי המטרה באמצעות וקטור רטרו-ויראלי נגזר MLV הנושא את הגן המדווח EGFP ומעטוף פסאודוטיפי VSV-G או גליקופרוטאין מעטפת אמפרוטופי. תאים שעברו הדבקה דמה (mock transduction) ישמשו כביקורת שלילית. 48 שעות לאחר ההדבקה, סבב את הדגימות בצנטריפוגה ולאחר מכן השהה 100,000 תאים ב-300 µL של PBS המכיל 2% fetal bovine serum.

לאחר מכן, יש למדוד את ביטוי ה-EGFP באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה. קצרו 0.5 עד חמישה מיליון תאים מעוברי טרנסדוקציה נוספים להכנת DNA גנומי ולעיכול עוקב באמצעות אנזימי הגבלה. הכינו ארבעה עיכולי אנזימי הגבלה לכל דגימה במבחנות של 1.5 מיליליטר.

בצעו עיכול של 0.1 עד 1 µg G-DNA בכל מבחנה. הוסיפו 10 units של TRU91 ו-1 µL של buffer M לכל דגימה בנפח סופי של 10 µL. העבירו 2 µL מהתערובת למבחנות העיכול.

לאחר מכן, דגרו את התגובות בטמפרטורה של 65 °C למשך שש שעות או למשך הלילה. לאחר הדגירה, הוסיפו 40 µL מים למבחנה של 1.5 mL. לאותה מבחנה, הוסיפו 10 units של PST1 ו-1 µL של buffer H לכל דגימה.

העבירו 10 µL מתערובת תגובת העיכול למבחנות העיכול. דגרו את התגובות בטמפרטורה של 37 °C למשך שש שעות או למשך לילה. למחרת, הכינו שמונה תגובות ליגציה של לינקרים במבחנות של 1.5 mL.

עבור כל תגובה, הוסף את תערובת תגובת הליגאז ל-10 µL של ה-genomic DNA שעבר עיכול. דגור בטמפרטורה של 16 °C למשך שלוש עד שש שעות. עבור סבב ה-PCR הראשון, הכן 48 תגובות PCR באنبובות של 0.2 mL.

עבור כל PCR, הוסף את תערובת התגובה המכילה את הפריימר המקשר (linker primer) ואת פריימר ה-MLV3 prime LTR לשני מיקרוליטרים של תגובת הליגציה. הנח את הדגימות בטרמיקלסלר (thermal cycler) עם מכסה מחומם. הגדר את פרמטרי המחזור והפעל את תגובת ה-PCR של הסבב הראשון.

עבור סבב ה-PCR השני, הכינו את תערובת התגובה הכוללת את ה-linker nested primer ואת ה-MLV3 prime LTR nested primer. לאחר מכן, הוסיפו 2 µL מתוצר ה-PCR של הסבב הראשון כתבנית. לאחר מכן, הריצו את תגובת ה-PCR של הסבב השני כדי להפיק את תוצרי ה-LN PCR הסופיים.

לאחר סבב ה-PCR השני, העבירו את 48 תגובות ה-nested LM PCR לשפופרת של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו 20 מיקרוליטר של loading buffer ל-100 מיקרוליטר של תוצר ה-LM PCR המאוחד והמשקק. טענו את הדגימה על ג'ל אגרוז בריכוז של אחוז אחד יחד עם סולם DNA של 100 base pair.

הריצו את הג'ל במתח של 5 volt לסנטימטר למשך 30 עד 60 דקות. לאחר הפרדת הרצועות, גזרו את חלק הג'ל המכיל אמפליקונים באורך של 500 עד 150 base pair. לאחר טיהור תוצר ה-LM PCR באמצעות ערכה להוצאת DNA מג'ל המבוססת על עמודה, מדדו את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר UV לפני המעבר להכנת הספריה. כמו כן, העריכו את אורכם של תוצרי ה-LM PCR באמצעות מכשיר bioanalyzer בהתאם להוראות היצרן.

הכינו את הספריה על ידי ביצוע PCR לאינדקס. עבור כל PCR, השתמשו ב-150 עד 170 nanograms של תוצר LM PCR מטוהר, בשילוב אינדקסים שונה עבור כל דגימה. בצעו את ה-PCR במכשיר thermal cycler עם מכסה מחומם כפי שצוין.

לאחר ה-PCR, יש לדלל את הספרייה המטוהרת לריכוז של 10 nanomolar באמצעות 10 millimolar tris HCL. לאחר מכן, ערבבו חמישה µL מהמאגר המדולל עם חמישה µL של 0.2 N sodium hydroxide בתוך מבחנה חדשה של 1.5 mL. ערבבו קצרה במכשיר vortex, סובבו בצנטריפוגה (spin down) ולאחר מכן הדגרירו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לדנטור את הספריות.

הניחו את מבחנות ה-pool שעבר דנטורציה על קרח והוסיפו 990 microliters של חוצץ היברידיזציה HT1 שקולל מראש. לאחר מכן, העבירו אליקוט של 300 microliters מה-pool שעבר דנטורציה למבחנה חדשה של 1.5 milliliter. הוסיפו 300 microliters של HT1 שקולל מראש כדי להגיע לריכוז סופי של עשר picomolar עבור ה-library pool.

במקביל, ערבב 10 nanomolar של ספריית ביקורת קבועה בנפח של two microliter עם 3 microliters של 10 millimolar tris HCl במבחנה של 1.5 milliliter. הוסף five microliters של 0.2 newtons sodium hydroxide וערבב קצרות ב-vortex. לאחר ספינ-דאון (spinning down), הדגר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לדנטורה את הקיבוע המדולל.

לאחר הדגירה, יש להניח את המבחנה על קרח ולהוסיף 990 µL של HT1 מקורר מראש. כעת, יש להעביר מנה (aliquot) של 100 µL של fix דנטורי למבחנה חדשה של 1.5 mL ולהוסיף 300 µL של HT1 מקורר מראש כדי להגיע לריכוז סופי של 10 pM של fix. לבסוף, במבחנה חדשה של 1.5 mL, יש לערבב 510 µL של מאגר ספריה (library pool) דנטורי עם 90 µL של ספריה מקובעת (fixed library) דנטורית, ובכך להשיג מאגר סופי בריכוז 10 pM עם 15% של בקרת fix לריצוף.

תמונה זו מציגה את הניתוח של 3498, 2989, ו-4103 מקבצים (clusters) של אתרי אינטגרציה חוזרים של MLV בתאי אב גזע המטופואטיים, בתאי אב אריתרואידיים ובתאי אב מיאלואידיים, בהתאמה. בכל אוכלוסיית תאים, יותר מ-95% ממקבצי ה-MLV חפפו למגבירים (enhancers) ומקדמים (promoters) שהוגדרו אפיגנטית. אזורים של MLV שהיו ספציפיים לסוג התא היו בעלי רמת אצטילציה גבוהה והיו קשורים לביטוי ספציפי של הגן המטרה באותו סוג תא.

דוגמאות לכך הן הפרומוטור של הגן SPINK2 הספציפי ל-HSP; אזור הבקרה של הלוקוס (Locus control region) המכיל מחזקים (enhancers) חזקים של גני הגלובין דמויי-בטא הספציפיים לתאי אריתרואידים; ומחזקים הממוקמים במעלה הזרם (upstream) של הגן LYZ הספציפי ל-NPP.

בדיקות מדוח (reporter assays) של לוסיפראז תיקפו את תת-הקבוצה של מחזקי MLV המכוונים לסוגים ספציפיים של תאים ב-EPP וב-MPP. לאזורים המכווני MLV הספציפיים לתאי אריתרואידים הייתה פעילות גבוהה יותר ב-EPP מאשר ב-MPP ולהיפך, מה שמאשר כי MLV מזהה מחזקים ספציפיים לתאים העשויים לשלוט בביטוי של גנים סמוכים. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבוע אחד אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור למקסם את תדירות התאים שעברו טרנסדוקציה (transduced cells) כדי להשיג אחזור אופטימלי של אתרי האינטגרציה. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן מיפוי אתרי אינטגרציה ויראליים, החל מהתאמת ה-DNA הגנומי, לאחר מכן ליגציה של הפרגמנטים הגנומיים עם לינקר DNA, בהמשך הגברה של נקודת החיבור (junction) בין הגנום של המארח לווירוס באמצעות LM PCR ולבסוף ריצוף עמוק (deep sequencing) של ספריית האמפליקונים.