Name: פפטיד, חלבון כימות באמצעות כלים אוטומטיים חיסונית-MALDI (iMALDI) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: למדו כיצד לכמת פפטידים וחלבונים בנוזלים ביולוגיים מורכבים באמצעות טכנולוגיית iMALDI אוטומטית. שיטה זו מאפשרת אבחון מדויק של מחלות בשלב מוקדם ומעקב אחר תגובת המטופל לטיפול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים סיוע כספי מן הגנום קנדה של הגנום קולומביה הבריטית עבור פעולות (204PRO), פיתוח טכנולוגיות (214PRO) דרך רשת חידושים הגנום (ג'ין). אנו מודים פלטפורמת גילוי סמים במכון המחקר של מרכז הבריאות באוניברסיטת מקגיל לשימוש של המכשיר MALDI-TOF לצלם. מרגשת היא אסירת תודה על התמיכה של מלגת פוסט-דוקטורט מן המדע הלאומית להנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC). C.H.B הוא אסיר תודה על התמיכה של הקרן הקרן החדשנית (ליף). C.H.B. הוא אסיר תודה על התמיכה היו ר סגל אוניברסיטת מקגיל אונקולוגיה מולקולרית באוניברסיטת מקגיל (מונטריאול, קוויבק, קנדה). M.X.C., C.H.B. אסירי תודה על תמיכה מ את וורן י' סופר (מתורגם) צדקה אמון, הקרן המשפחתית על סגל אלווין לבית החולים הכללי היהודי (מונטריאול, קוויבק, קנדה).

כמויות ריאגנטים המתוארים להלן מבוססות על המידה של 20 דגימות פלסמה החולה. הפרוטוקול שיובאו להלן להלן ההנחיות של האוניברסיטה של ויקטוריה &#39; ועדת האתיקה האנושית מחקר s.
 1. דור של אנג לי בפלסמה אנושית <ol><li>להפשיר דגימות פלסמה (&#8805; 200 µL) בחדר טמפרטורת מים אמבטיה במשך 5 דקות, ולאחר מכן הצב את הדגימות על הקרח עד לחלוטין הקרת.</li>
	<li>µL 200 העברה של כל מדגם פלזמה באופן ידני כדי להפריד בארות של צלחת באר 1.1 mL (לדוגמה צלחת), ו centrifuge את הצלחת ומפרידה 10 דקות-2 ° C ו- g x 1278</li>
	<li>השתמש של נוזל אוטומטיות טיפול מערכת לדלל באופן סדרתי 500 fmol/µL אנג I NAT פתרון רגיל להכין שישה פתרונות כיל עם תרנגולת חלבון אלבומין (0.1 0.2, 0.6, 1.9, 5.7, fmol 17.2/µL).</li>
	מאגר <li>פיפטה 200 µL של כל כיל µL טוב, 125 של הדור מדגם לצלחת. 
	הערה: CEWA ב פוספט תמיסת מלח במאגר (PBS) המאגר צריך להיות מוכן טרי ביום של הניסוי-</li>
	<li>באמצעות נוזל אוטומטיות של טיפול המערכת, בתוך צלחת חדשה מערבבים 125 µL של פלסמה supernatant או µL 125 של CEWA ב- PBS עם 25 µL של אנג לי מאגר הדור, אשר מכיל 1 מ' טריס, חומצה ethylenediaminetetraacetic 0.2 מ מ (EDTA), ו 1 מ מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF). 
	הערה: להכין את אנג אני דור מאגר על ידי ערבוב 1 מ' טריס/0.2 מ מ EDTA מימית מאגר (להתאים את ה-pH 5.5 באמצעות חומצה אצטית) ופתרון PMSF (100 מ מ ב מתנול). שני פתרונות ניתן לאחסן חודש-4 מעלות צלזיוס. לערבב השני פתרונות ביום של הניסוי-</li>
	<li>להעביר באופן אוטומטי את הפתרונות לתוך צלחת 96-ובכן, משכפל 3 לכל פתרון, µL 34 לכל טוב. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ח'</li>
</ol> 2. חיסונית-העשרה של אנג לי חרוזים מצופים נוגדן באמצעות <ol><li>ההטיה של נוגדנים על גבי beads מגנטי חלבון G הערה: ההטיה של הנוגדן עם החרוזים מבוצעת באופן ידני במהלך ה 3 אנג לי תקופת הדור- יום של הניסוי. עבור אחרים analytes, החרוזים מצומדת יוכל לאחסן במאגר PBS המכיל 0.015% בחורים (PBSC) ב 4 מעלות צלזיוס למשך שלושה חודשים או יותר, בהתאם המאפיינים ואת היציבות של הנוגדן.
	<ol><li>µL 110 העברה של slurry חרוז (מספיק מדידה 20 דגימות וביצוע עיקול רגיל 6 נקודות) לתוך צינור 1.5 מ ל. לשטוף את החרוזים שבע פעמים עם 1 מ"ל של 25% acetonitrile/PBSC ועם שלוש פעמים 1 מ"ל של PBSC. השתמש עמדה מגנטי כדי הצניפה החרוזים בין שלב לשלב הכביסה. להסיר את המאגר לשטוף לאחר לשטיפה האחרונה 
		הערה: כביסה 7 פעמים עם 25% acetonitrile/PBSC הוא קריטי עבור הסרת התוסף MS-לא תואם slurry חרוז, כגון Tween-20. אם ישנם תוספים כאלה לא חרוזים שנבחר, שלב כביסה נרחב זה לא יהיה הכרחי.</li>
		<li>Resuspend את החרוזים ב 110 µL של PBSC, ולהוסיף µL 110 של אנטי-אנג לי נוגדנים (ריכוז נוגדן הסופי: µg 100/mL). לערבב את החרוזים ואת הפתרון על ידי pipetting ולאחר מכן דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך 1 h, מסתובב ב 8 סל ד.</li>
		<li>לרחוץ את החרוזים 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBSC ולאחר resuspend ב 1100 µL של PBSC. 
		הערה: אם כל פתרון חרוז יש זרמו לתוך הכיפה של הצינור במהלך הדגירה, ספין למטה הפתרון בעזרת צנטריפוגה benchtop 2680 ג x</li>
		<li>העברת הפתרון חרוז באופן ידני צלחת 96-ובכן (צלחת רגילה חרוז). השתמש הנוזל אוטומטיות טיפול למערכת aliquot את החרוזים לצלחת 96-ובכן אותו, µL 120 לכל טוב.</li></ol></li> <li>חיסונית-העשרה על החרוזים <ol><li>אחרי ה 3 אנג תקופת הדור, אתה מבין את הצלחת דגירה קרח למשך 10 דקות לסיים את הדור של אנג. אני</li>
		<li>אוטומטי לדלל את אחותי פפטיד הפתרון מניות (10 pmol/μL) 100-fold עם PBS מאגר ולאחר נוספת באופן אוטומטי aliquot דילול פפטיד סטנדרטי isoptope יציב על צלחת PCR 96-ובכן. העברת µL 1.5 של פתרון פפטיד סטנדרטים (SIS) איזוטופ יציב (מכיל 100 fmol) לבאר כל צלחת דגירה, ולערבב עם הדגימות פלזמה או את CEWA במאגרי PBS.</li>
		<li>באופן אוטומטי להעביר את התוכן של צלחת הדגירה הפתרון חרוז, 10 מ לכל טוב, לערבב.</li>
		<li>דגירה את הצלחת ב 4 ° C עבור 1 h תוך כדי סיבוב על סל ד 8.</li>
		<li>לשטוף את החרוזים שלוש פעמים באופן אוטומטי עם 5 מ מ פתרון אמוניום ביקרבונט (AmBic), µL 100 לכל טוב לכל לשטוף. לאחר השטיפה האחרונה resuspend את החרוזים ב 7 µL של 5 מ מ פתרון AmBic כל טוב. השתמש מגנט למשוך את החרוזים לתחתית לאחר לשטיפה האחרונה</li>
	</ol></li></ol> 3. העברה של חרוזים על גבי MALDI המטרה צלחת עם הוספת מטריקס פתרון <ol><li>µL 7 העברה של slurry חרוז באופן אוטומטי על גבי צלחת היעד MALDI עם גודל נקודה של 2,600 מיקרומטר. תן החרוזים להתייבש. 
	הערה: מאוורר מאפיק USB קטן יכול לשמש כדי להאיץ את החרוז ייבוש תהליך.</li>
	<li>להוסיף באופן אוטומטי µL 2 α-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (HCCA)-פתרון מטריקס (מכיל 3 מ"ג/מ"ל HCCA, ציטראט אמוניום 1.8 מ"ג/מ"ל, acetonitrile 70% ו- 0.1% חומצה trifluoroacetic) מתוך מטריצת טוב על גבי כל מדגם ספוט בצלחת היעד .</li>
</ol> 4. אות רכישה על-ידי MALDI-תוף-MS ניתוח נתונים <ol><li>ניתוח המדגם כתמים עם מכשיר MALDI-TOF באמצעות מצב חיובי רפלקטור. לבצע כיול פנימי נתונים החלקה, חיסור בסיסית באופן אוטומטי עם תוכנה ספציפית לספק. 
	הערה: למצב (לינארי חיובי/שלילי, / רפלקטור) הנבחר עבור MALDI-TOF המדידה תלויה פפטידים היעד או חלבונים.</li>
	<li>לחשב את היחס תגובה יחסית (Nat/אחות בעוצמה יחס) ולהשוות אותם, עיקול רגיל כדי לקבוע של אנג ריכוז בכל מדגם. לחשב PRA באמצעות משוואה (1), שבה Δt אנג אני דור מייצג את הזמן המשמש את הדור של אנג. אני 
	PRA = [אנג אני] / Δt אנג אני דור (1)</li></ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Nicol, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+Immunoaffinity-Mass+Spectrometry-based+Approach+for+the+Quantification+of+Protein+Biomarkers+from+Serum+Samples+of+Lung+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).</li>
<li>Webster, J., Oxley, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+J+%22Chemical+Genomics+and+Proteomics%3A+Reviews+and+Protocols%22">Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols</a>. Zanders, E. D. , Humana Press. 227-240 (2012).</li>
<li>Yergey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+sequencing+of+peptides+using+MALDI%2FTOF-TOF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).</li>
<li>Anderson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+decades+searching+for+meaning+in+the+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Six decades searching for meaning in the proteome.</a> J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).</li>
<li>Landegren, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+Sensitive+Plasma+Proteome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).</li>
<li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+Enrichment+and+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Protein+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li>
<li>Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-linked+immuno-mass+spectrometric+assay+with+the+substrate+adenosine+monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocapture+strategies+in+translational+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunocapture strategies in translational proteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Affinity+Capture+and+On-Tip+Digestion+to+Accurately+Quantitate+in+Vivo+Deamidation+of+Therapeutic+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies.</a> Anal. Chem. , (2016).</li>
<li>Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+quantification+of+human+plasma+proteins+using+the+automated+SISCAPA+Immuno-MS+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow.</a> N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).</li>
<li>Razavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+SISCAPA+Quantitation+of+Peptides+from+Human+Plasma+Digests+by+Ultrafast%2C+Liquid+Chromatography-Free+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).</li>
<li>Anderson, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SISCAPA+Peptide+Enrichment+on+Magnetic+Beads+Using+an+In-line+Bead+Trap+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).</li>
<li>Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+clinical+proteomics+-+a+review+and+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based clinical proteomics - a review and prospective.</a> The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).</li>
<li>Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+Development+of+an+Immuno+MALDI+%28iMALDI%29+Mass+Spectrometry+Assay+for+the+Diagnosis+of+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).</li>
<li>Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexed+iMALDI+for+the+detection+of+angiotensin+I+and+angiotensin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II.</a> Methods. 56 (2), 213-222 (2012).</li>
<li>Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+immuno-MALDI+%28iMALDI%29+assay+for+angiotensin+I+and+the+diagnosis+of+secondary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension.</a> Clin. Proteomics. 10 (1), 20(2013).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+immuno+tandem+mass+spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+EGFR+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis.</a> Proteomics Clin Appl. 1, (2007).</li>
<li>Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Immunoaffinity+Tandem+Mass+Spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+Detection+of+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+chimica+acta%22%5BJournal%5D)">An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis.</a> Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).</li>
<li>Popp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+assay+for+the+clinical+measurement+of+plasma+renin+activity+by+immuno-MALDI+%28iMALDI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI).</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).</li>
<li>Schoenherr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+monoclonal+antibodies+for+SISCAPA+assays+using+a+magnetic+bead+processor+and+liquid+chromatography-selected+reaction+monitoring-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry.</a> J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).</li>
<li>Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , US 7846748 B2 (2010).</li>
<li>Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , CA 2507864 C (2011).</li>
<li>Weiß, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+measure-mass+spectrometry-based+immunoassays+in+biomarker+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).</li>
<li>Nelson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+fragments%3A+Hope+and+hype%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Antibody fragments: Hope and hype.</a> mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+an+aptamer+for+use+as+an+affinity+reagent+with+MS%3A+PCSK9+as+an+example+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein.</a> Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).</li>
</ol>

C.H.B מחזיק את הפטנט על טכנולוגיית iMALDI.

לעומת חלבון מבוססי MS קונבנציונאלי כמת, iMALDI משתמש נוגדנים כדי לטהר אותם מדגימות מורכבות, ולכן כך שניתן לכמת חלבונים או פפטידים בריכוזים נמוכים ולהעשיר את analytes. שלב קריטי בפרוטוקול iMALDI הוא חיסונית-ההעשרה של פפטידים היעד. למטרה זו, יש לבחור נוגדנים עם ירידה לפרטים גבוה ואהדה. ב- SISCAPA, דווח כי הזיקות נוגדן-10-9 מ' או יותר יהיה צורך להשיג רגישות גבוהה נמוך ng/mL21. בנוסף, חרוזים עם נוגדנים גבוהים מחייב קיבולת עדיפים העשרה אופטימלית.
חשוב גם ליצור ספק...

ספקטרומטר מסה הפך להיות כלי חיוני ב פרוטאומיקס כמותית. ספקטרומטר מסה יכול לקבוע את ההמונים של חלבונים היעד או פפטידים, לכן אותות analyte שהושג יכול להיות ספציפי מאוד בהשוואה ל- immunoassays. שתי שיטות יינון, ספקטרומטריית electrospray ו- MALDI, משמשים בדרך-כלל זיהוי חלבונים ו פפטידים1,2,3,-4. האתגר העיקרי של חלבון מבוססי MS כימות טמון זיהוי חלבונים נמוכה-שפע בדגימות מורכבים בריכוזים ng/mL או pg/mL בנוכחות גבוהה-שפע חלבונים, והם רבים המועמד חלבון סמנים ביולוגיים נמצאו לפלסמה אנושית במסגרת זו בטווח5. בעיה זו נגרמת בעיקר על ידי טווח דינמי רחב מטבעו והמורכבות של האדם פרוטאום6.
כדי להתגבר על האתגרים הללו זיהוי, פותחו שיטות חיסונית-MS כדי להעשיר את היעד חלבונים או פפטידים מן הפתרונות מדגם על גבי משטח יציב, ואחריו • תנאי של analytes ו- MS מידה7,8 , 9 , 10. דרך חיסונית-העשרה, analytes וגופם מטוהר מדגימות מורכבות, ולכן ההשפעות יון-דיכוי של מולקולות אחרות הן מזעריות. בין תומך מוצקים שונים, beads מגנטי הם כיום בשימוש נרחב ביותר כפי שהם את היתרונות של נוגדנים גבוהים מחייב יכולת וקלות הטיפול. יש beads מגנטי עם functionalizations שונים וגדלים פותחה, ממוסחר לניסויים immunoprecipitation. עד כה, חיסונית-העשרה על חרוזים יש כבר לממשק עם ספקטרומטריית electrospray יינון (ESI) וגם MALDI-MS למדידה חלבון ופפטיד. איזוטופ יציב סטנדרטים, לכידת על-ידי טכנולוגיית נוגדנים אנטי-פפטיד (SISCAPA), חלבונים הדגימות מתעכלים, ואחריו הדגירה עם חרוזים מצופים נוגדן חיסונית-העשרה. ב- SISCAPA "הקלאסי", פפטידים שנתפסו proteotypic eluted של החרוזים, נמדד על ידי נוזלי כרומטוגרפיה-ESI-MS (LC-MS), או על ידי אינפוזיה ישירה ניטור התגובה ESI-מרובה-MS (ESI-MRM-MS)11,12. חיסונית-העשרה שיפור הרגישות assay MRM מאת 3-4 סדרי גודל, להגיע לטווח נמוך ng/mL13.
בהשוואה לספקטרומטריית electrospray-MS, MALDI-MS מהר יותר, אינו כרוך equilibration מחדש של עמודות LC או ניקיון אז אין בעיות דחויים וזיהום, שהופך אותו מתאים יותר תפוקה גבוהה לימודי14. חיסונית-MALDI הטכנולוגיה פותחה במעבדה שלנו לשלב חיסונית-העשרה עם MALDI-MS על כימות רגיש וספציפי של פפטידים וחלבונים (מבוסס על כימות של פפטידים proteotypic)15,16 ,17. לאחר חיסונית-העשרה, החרוזים מופקדים על צלחת היעד MALDI, הפתרון מטריקס מתווסף חרוזים, הצלחת הוא מוכן לניתוח על ידי MALDI-תוף-MS לאחר הייבוש. • תנאי של פפטידים של החרוזים אינה מבוצעת כשלב נפרד, אך זיקה מכורך analytes הם eluted לפי הפתרון מטריקס MALDI כאשר היא מתווספת לנקודות חרוז, ובכך לפשט את הכנת הדוגמא וצמצום מדגם הפסד. IMALDI טכנולוגיה הוחל במגוון יישומים18,19, לאחרונה יש כבר אוטומטי, המשמש למדידת אנגיוטנסין אני (אנג אני) לקביעת פלזמה רנין פעילות (PRA)20. פרוטוקול זה תדגים ההליך המשמש לביצוע וזמינותו של iMALDI אוטומטית. לוקח וזמינותו PRA כדוגמה, הבין-היום CVs של פחות מ-10% הושגו באמצעות אוטומציה, עם יכולת המדידה 744 דוגמאות לכל יום20.
וזמינותו PRA iMALDI הפגינו כתב יד זה אינה דורשת עיכול חלבון, כמו המולקולה היעד (אנג אני) הוא פפטיד עם משקל מולקולרי של 1295.7 Da. מבחני אחרים לעיכול חלבון נחוץ ואיפה פפטיד משמש הפונדקאית חלבון שלם, פפטיד שנבחר עבור iMALDI צריכה להיות ייחודיות וספציפיות כדי החלבון היעד, עם גוש מעל 800 Da אז זה ניתן להבדיל בקלות בין c רעש hemical מהפתרון מטריקס MALDI. נוגדנים אנטי-פפטיד נדרשים עבור חיסונית-ההעשרה של פפטידים. הפרוטוקול עבור assay iMALDI מדידת PRA כוללת ארבעה שלבים: 1) דור של אנג לי בפלסמה אנושית; 2) חיסונית-העשרה של אנג לי באמצעות חרוזים מצופים נוגדן; 3) העברה של חרוזים MALDI המטרה צלחת, הוספת מטריקס פתרון; . ו-4) אות רכישה על-ידי MALDI-תוף-MS ונתונים ניתוח20.

<table><tbody><tr><td>בקרה בריאה של פלזמה אנושית</td><td>HMPLEDTA2</td><td></td><td>ביו-רקבונט</td></tr><tr><td>אמוניום ביקרבונט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום ציטראט דו-בסיסי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>09833</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS (>=98%)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין מחלבון ביצת עוף (>98%)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70990</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered מלח</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic</td><td>acid Thermo Fisher Scientific</td><td>85172</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>פלוקה</td><td>34967</td><td>LC-MS</td></tr><tr><td>כיתה מים</td><td>פלוקה</td><td>39253</td><td>LC-MS</td></tr><tr><td>כיתה חומצה אצטית</td><td>פלוקה</td><td>320099</td><td>LC-MS כיתה</td></tr><tr><td>טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן</td><td>רוש אבחון</td><td>3118169001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads חלבון G חרוזים מגנטיים</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>10003D</td><td>2.8 &mu; m, 30 מ"ג/מ"ל</טווח></td></tr><tr><td>אנטי-Ang I נוגדן רב-שבטי עז</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-7419</td><td></td></tr><tr><td>Nat ו-SIS Ang I</td><td>מסונתז באוניברסיטת ויקטוריה-גנום BC מרכז</td><td></td><td></td>פרוטאומיקה</tr><tr><td>מערכת אוטומטית לטיפול בנוזלים</td><td>Agilent</td><td>16050-102</td><td>תחנת עבודה רובוטית Agilent Bravo</td></tr><tr><td>מגנט</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Invitrogen DynaMag-2</td></tr><tr><td>מגנט צינור מסובב</td><td>Theromo Scientific</td><td>400110Q</td><td>Labquake צינור מסובב</td></tr><tr><td>מגנט</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>DynaMag-96 מגנט חצאית צד</td></tr><tr><td>מגנט</td><td>VP Scientific</td><td>771RM-1</td><td>המשמש למשיכת החרוזים לתחתית הבאר</td></tr><tr><td>מכשיר MALDI-TOF</td><td>Bruker Bruker</td><td></td><td>Microflex LRF</td></tr></tbody></table>

פפטיד, חלבון כימות באמצעות כלים אוטומטיים חיסונית-maldi (imaldi)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

ספקטרומטר מסה (MS) היא אחת הטכנולוגיות הנפוצות ביותר לכימות תנועת החלבונים בדגימות מורכבים, עם ירידה לפרטים assay מעולה בעקבות זיהוי ישיר היחס בנפח גדול לתשלום של כל מולקולה היעד. עם זאת, פרוטאומיקס מבוססי MS, כמו רוב טכניקות אנליטיות אחרות, יש דעה קדומה כלפי מדידה גבוהה-שפע analytes, אז זה מאתגר כדי להשיג זיהוי גבולות של נמוך ng/mL או pg/mL דוגמאות מורכבות, וזאת הוא הטווח ריכוז עבור רבים חלבונים מחלות רלוונטיות ב biofluids כגון לפלסמה אנושית. כדי לסייע זיהוי analytes נמוך-שפע, חיסונית-העשרה שולב וזמינותו כדי להתרכז ולטהר את analyte לפני המדידה MS, באופן משמעותי לשיפור הרגישות וזמינותו. בעבודה זאת, חיסונית - הטכנולוגיה Matrix-Assisted לייזר Desorption/יינון (iMALDI) הוא הציג כימות של חלבונים ופפטידים biofluids, בהתבסס על חיסונית-העשרה על חרוזים, ואחריו MALDI-MS מדידות ללא • תנאי מוקדמת. נוגדנים אנטי-פפטיד functionalized על beads מגנטי, מודגרות עם דוגמאות. לאחר הרחצה, החרוזים מועברים ישירות לצלחת היעד MALDI, האותות נמדדת על ידי זמן-MALDI של כלי הטיסה (MALDI-TOF) לאחר הפתרון מטריקס הוחלה על החרוזים. הליך הכנת המדגם היא פשוטה יותר לעומת שאר מבחני חיסונית-MS, המדידה MALDI הוא מהיר. הכנת המדגם כולו היא אוטומטית עם נוזל טיפול במערכת, ועם הפארמצבטית assay שיפור תפוקה גבוהה יותר. במאמר זה, וזמינותו iMALDI משמש לקביעת אנגיוטנסין פפטיד של אני (אנג אני) ריכוז בפלסמה, אשר משמש קלינית readout פעילות רנין פלזמה להקרנה של ראשי aldosteronism (פי אי).

שגרת iMALDI אוטומטיים למדידת אנג אני מוצג באיור1. פפטידים היעד (פפטידים אנדוגני או פפטידים של חלבונים מתעכל) מועשרים בפפטיד אנטי beads מגנטי ולאחר מכן החרוזים מועברים צלחת היעד למדידה MALDI. כל התהליך היא פשוטה יותר לעומת טכנולוגיות אחרות חיסונית-MS דורשים צעדים • תנאי פפטיד נוספים. אוטומציה של וזמינותו iMALDI מאפשר תפוקה גבוהה ניתוח של מספר רב של דוגמאות עם מקדם הבין-היום וריאציה (CV) להלן 10% 20. נציג ספקטרה התקבלו ע י מדידת אנג אני ...

פרוטוקול עבור כימות חלבון בנוזלים ביולוגיים מורכבים באמצעות טכנולוגיית חיסונית אוטומטית-MALDI (iMALDI) מוצג.

פפטיד, חלבון כימות באמצעות כלים אוטומטיים חיסונית-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

המטרה הכוללת של בדיקת immuno-MALDI אוטומטית זו היא לכמת פפטידים וחלבונים שלמים בנוזלים ביולוגיים מורכבים באופן מדויק ורגיש. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הפרוטאומיקה הכמותית, כגון כימות רמות חלבון לצורכי אבחון או למעקב אחר תגובתו של מטופל לטיפול. היתרון המרכזי של שיטה זו הוא היכולת לכמת רמות חלבון ברגישות ובדיוק גבוהים מדגימות מורכבות.טכניקה זו מאפשרת אבחון של מחלות בשלב מוקדם, מכיוון ששלב ההעשרה החסונית של הבדיקה מאפשר כימות של סמנים ביולוגיים של חלבונים ופפטידים בריכוז נמוך. אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי פעילות רנין בפלסמה, ניתן ליישמה גם במחקרים אחרים הקשורים למחלות, כגון כימות של חלבונים הקשורים לסרטן לצורך פרוגנוזה, אבחון וניהול טיפולי. כדי להתחיל בהליך זה, הפשיתו דגימות של פלסמה אנושית באמבט מים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.לאחר מכן, הניחו את הדגימות על קרח עד להפשרה מלאה. בשלב הבא, העבירו ידנית 200 µL מכל דגימת פלזמה לבארות נפרדות של פלטת בארות עמוקות בנפח 1.1 mL. סובבו את הפלטה בצנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 2 °C ובמהירות של 3,000 rpm.לאחר מכן, השתמש במכשיר ה-Bravo כדי לבצע דילול סדרתי של תמיסת סטנדרט Ang-1 NAT בריכוז 500 femtomole per microliter להכנת שש תמיסות כיול עם אלבומין מחלבון ביצת תרנגולת. לאחר סבב צנטריפוגה, העבר בפיפט 200 microliters מכל תמיסת כיול לבאר ו-125 microliters של באפר ייצור (generation buffer) ללוחית הדגימות. באמצעות מערכת אוטומטית לטיפול בנוזלים, ערבב 125 microliters של עליית פלזמה או 125 microliters של תמיסת אלבומין מחלבון ביצת תרנגולת עם 25 microliters של באפר לייצור angiotensin I בלוחית בארות עמוקות חדשה בנפח 1.1 milliliter.כעת, העבירו באופן אוטומטי את התמיסות לפלטת 96 בארות, עם שלוש חזרות לכל תמיסה ו-34 µL של תמיסה לכל בארה. לאחר מכן, דגרו את הפלטה ב-37 °C למשך שלוש שעות. לצורך צימוד הנוגדן לחרוזי Protein G, העבירו תחילה 78 µL של תרחיף חרוזים שהוכן מראש למבחנה של 1.5 mL.שטפו את החרו지를 שבע פעמים עם 1 ml של 25% acetonitrile ב-PBSC ושלוש פעמים עם 1 ml של PBSC, תוך שימוש במעמד מגנטי להסמכת החרוזים למשקע בין כל שטיפה. לאחר שטיפת החרוזים, השהו אותם מחדש ב-110 µl של PBSC והוסיפו 110 µl של נוגדן anti-angiotensin I. ערבבו את החרוזים והתמיסה באמצעות פיפטינג.לאחר מכן, הדגרי את החרוצים בטמפרטורת החדר למשך שעה תוך כדי סיבוב במהירות של 8 rpm. לאחר מכן, שטפי את החרוצים שלוש פעמים ב-1 mL של PBSC. לבסוף, השעי את החרוצים מחדש ב-1,100 µL של PBSC.כעת, העבירו ידנית את תמיסת החרוצים ללוחית 96 בארות. לאחר מכן, השתמשו במערכת ה-Bravo כדי לחלק את החרוצים לאותה לוחית 96 בארות. לאחר תקופה של שלוש שעות ליצירת angiotensin I, הניחו את לוחית האינקובציה על קרח למשך 10 דקות כדי להפסיק את יצירת ה-angiotensin I. דללו באופן אוטומטי תמיסת סטוק של פפטיד תקני עם איזוטופ יציב (stable isotope standards peptide) בדילול של 100-fold באמצעות בופר PBS.בנוסף, חלק באופן אוטומטי את דילול הפפטיד של סטנדרט האיזוטופ היציב לפלטת PCR בעלת 96 בארות. העבר 10 µL של תמיסת הפפטיד המדוללת לכל בארה בפלטת האינקובציה. ערבב את תמיסת הפפטיד המדוללת עם דגימות הפלסמה או עם תמיסת אלבומין מחלבון ביצה של תרנגולת.הוסיפו באופן אוטומטי את תמיסות הדגימות או התמיסות הסטנדרטיות אל תמיסות החרוצים בלוח האינקובציה וערבבו. לאחר אינקובציה של שעה אחת, שטפו באופן אוטומטי את החרוצים שלוש פעמים עם תמיסת ammonium bicarbonate בריכוז 5 mM. השתמשו במגנט כדי למשוך את החרוצים לתחתית לאחר כל שטיפה.לאחר השטיפה האחרונה, יש להוסיף 10 µl של תמיסת ammonium bicarbonate לכל באר כדי לתלה את החרוצים. העבר באופן אוטומטי 7 µl מתחליט החרוצים אל לוח מטרה של MALDI בעל גודל נקודה של 2,600 µm. לאחר שהחרוצים התייבשו, הוסף באופן אוטומטי 2 µl של תמיסת HCCA matrix שהוכנה מראש, מבאר המטריקס, לכל נקודת דגימה בלוח המטרה.לאחר מכן, נתח את נקודות הדגימה באמצעות מכשיר MALDI-TOF במצב positive reflector. בצע כיול פנימי, החלקת נתונים והסרת קו בסיס באמצעות התוכנה הייעודית של היצרן. הליך ה-iMALDI האוטומטי למדידת angiotensin I מאפשר ניתוח בתפוקה גבוהה של מספר רב של דגימות עם מקדם וריאציה יומי נמוך מ-10%. ספקטרומים מייצגים שהתקבלו ממדידת angiotensin I בדגימות פלסמה אנושית מוצגים כאן.המתאם בין ערכי PRA מ-188 דגימות חולים שהתקבלו באמצעות בדיקת iMALDI האוטומטית לבין ערכי PRA שהתקבלו באמצעות הליך קליני של LC-MS/MS מוצג כאן. לשתי השיטות מקדם מתאם של 0.98, וההבדל בין השיפועים עשוי לנבוע מהשימוש בתקנים פנימיים שונים או בנוגדנים שונים. הטווח הליניארי של הבדיקה ודיוק הבדיקה מוצגים כאן.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בכשבע שעות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, זכרו לכוונן כראוי את ראש הטיפ ואת מהירות הטיפול בנוזלים. לאחר פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות נוספות כדי לאשר אלדוסטרוניזם ראשוני בחולים, כולל בדיקת העמסה אוראלית של מלח או בדיקות עירוי של תמיסת סלין.טכניקת ה-iMALDI האוטומטית מאפשרת סריקה כמותית בעלת תפוקה גבוהה, ספציפית ומדויקת של דגימות ביולוגיות, כולל דגימות מחולים, לאיתור חלבונים או פפטידים הקשורים למחלה. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן ביצוע בדיקת iMALDI אוטומטית לצורך כימות חלבונים ופפטידים מבוסס ספקטרומטריית מסות. זכרו כי עבודה עם דגימות ביולוגיות, כגון פלזמה אנושית, היא מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי הבטיחות הנדרשים בעת ביצוע הפרוצדורה.

peptide-and-protein-quantification-using-automated-immuno-maldi-imaldi

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

תקנים איזוטופ יציב ו ללכוד על ידי Anti-פפטיד נוגדנים (SISCAPA) זוגות להעשרת הזיקה של פפטידים עם איזוטופ יציב דילול ספקטרומטריית מסה (MRM-MS) כדי לספק מדידה כמותית של פפטידים כתחליפי עבור חלבונים, בהתאמה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות חלקיקים מגנטיים בפורמט אוטומטיות חלקית.

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

פיתחנו טכנולוגיה המבוססת על הסרט סיליקה mesoporous דק להתאוששות סלקטיבית של חלבונים נמוך משקל מולקולרי ופפטידים מ בסרום אדם. פיסיקלי כימי את המאפיינים של שבבי mesoporous שלנו היו מכוון היטב כדי לספק שליטה משמעותית להעשרת פפטיד ולכן פרופיל proteome סרום למטרות אבחון.

חלבון נמוך מולקולרית משקל העשרה על סרטים סיליקה mesoporous דק גילוי סמן ביולוגי

תיוג איזוטופ יציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא אסטרטגיה מהירה וזולה לפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה מדויקת כמותית. כאן אנו מדגימים שיטה חזקה לעריכה ולניתוח של תערובות חלבון באמצעות הגישה רדה שניתן ליישם כמעט כל סוג מדגם.

פרוטאומיקה כמותית באמצעות Reductive Dimethylation לתיוג איזוטופ יציב

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע בדיקות כימות מוחלטות של חלבוני מטרה בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות באמצעות ניטור תגובה נבחר. הוא שימש לכימות מדויק של חלבונים של מסלול האיתות הכימוטקסיס של מקרופאגים בעכבר. בחירת פפטיד יעד, פיתוח בדיקה ובדיקות איכותיות וכמותיות מתוארים בפירוט.

תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט

כאן, אנו מתארים assay כרומטוגרפי בשילוב עם ההפרדה ניידות יון של פפטיד מבשרי ואחריו ברזולוציה גבוהה (~ 30,000) MS-הזיהוי של פפטיד קטעים על כימות של פפטיד מחודדים הסטנדרטים של נוגדן חד שבטי תקציר.

וזמינותו HS-MRM עבור כימות של התא המארח חלבונים בחלבון ביופרמצבטיקה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית יון ניידות QTOF ספקטרומטר מסה

אנו מתארים את השימוש immunoblotting כמותיים כדי לאמת היסטולוגיה immunofluorescence בשילוב עם ניתוח תמונות כאמצעי לכימות חלבון עניין בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע דגימות רקמה (FFPE). התוצאות שלנו להפגין את התועלת של היסטולוגיה immunofluorescence עבור ברור הכמות היחסית של חלבונים סמן דגימות ביופסיה שגרתית.

Immunoblotting כמותית של שורות תאים כסטנדרט לאימות Immunofluorescence לכימות תנועת סמן חלבונים בדגימות הרקמות שגרתיות

אנו מציגים שיטה לטיהור, איתור וזיהוי של פפטידים diGly שמקורם בחלבונים אוביקטיביים מדגימות ביולוגיות מורכבות. השיטה המוצגת מופצת, איתנה, ומבצעת שיטות שפורסמו ביחס לרמת העומק של האנליזה האוביקווינופית.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

זרימת עבודה זו מתארת את ביצועי הזמן והעשרת העלויות היעילות של שינויים מרובים בחלבון שלאחר ההעברה (לפטין) בו זמנית עבור ניתוח פרוטמית גלובלי כמותי. הפרוטוקול מנצל את העשרה ברמת הפפטיד PTM עם נוגדנים מרובה מצוחים, ואחריו נתונים עצמאיים רכישה המסה ניתוח ספקטרומטר מאסה כדי לקבל תובנות ביולוגיות לתוך הוצלב PTM.

העשרת אהדה בו של שני שינויים שלאחר ההעברה לקוונפיקציה ולוקליזציה לאתר

תיוג איזוטופי משולב ותיוג איזובארי (cPILOT) היא אסטרטגיית מולטיפלקס מדגימה משופרת המסוגלת להגדיל את מספר הדגימות שניתן לנתח בו-זמנית עם תגיות איזובריות זמינות. התאגדות של פלטפורמה רובוטית הגדילה מאוד את התפוקה הניסיונית, הרבייה והדיוק הכמותי.

מולטיפלקס לדוגמה אוטומטי באמצעות תיוג איזוטופי משולב מקדים ותיוג איסוברי (cPILOT)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לטיהור של MHC class I ומתחמי פפטיד מדרגה II מקווי עכבר ותא אנושי המספקים נתוני אימונופטידומיקה באיכות גבוהה. הפרוטוקול מתמקד בהכנת דגימה באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית.

אימונופטידומיקה: בידוד של עכבר ו- MHC אנושי Class I- ופפטידים הקשורים II לניתוח ספקטרומטריית מסה

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה של פרוטאומיקה לאפיון פרוטאום פני התא של סוגי תאים שונים. זרימת עבודה זו כוללת העשרת חלבון על פני התא, הכנת דגימה לאחר מכן, ניתוח באמצעות פלטפורמת LC-MS/MS ועיבוד נתונים עם תוכנה מיוחדת.

זרימת עבודה של "לכידת פני התא" לכימות ללא תוויות של פרוטאום פני התא

למדו כיצד לכמת פפטידים וחלבונים בנוזלים ביולוגיים מורכבים באמצעות טכנולוגיית iMALDI אוטומטית. שיטה זו מאפשרת אבחון מדויק של מחלות בשלב מוקדם ומעקב אחר תגובת המטופל לטיפול.

פפטיד, חלבון כימות באמצעות כלים אוטומטיים חיסונית-MALDI (iMALDI)

גלה סרטונים נוספים