פפטיד, חלבון כימות באמצעות כלים אוטומטיים חיסונית-MALDI (iMALDI)
18 באוגוסט 2017
פרוטוקול עבור כימות חלבון בנוזלים ביולוגיים מורכבים באמצעות טכנולוגיית חיסונית אוטומטית-MALDI (iMALDI) מוצג.
המטרה הכוללת של בדיקת אימונו-MALDI אוטומטית זו היא לכמת פפטידים וחלבונים שלמים בנוזלים ביולוגיים מורכבים בצורה מדויקת ורגישה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפרוטאומיקה הכמותית, כגון כימות רמות חלבון לאבחון או לניטור תגובת המטופל לטיפול. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא יכולה לכמת את רמות החלבון בצורה רגישה ומדויקת מאוד מדגימות מורכבות.
טכניקה זו מאפשרת אבחון מחלות בשלב מוקדם מכיוון ששלב ההעשרה החיסונית של הבדיקה מאפשר כימות של סמנים ביולוגיים של חלבון ופפטיד בשפע נמוך. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי פעילות רנין בפלזמה, ניתן ליישם אותה גם במחקרים אחרים הקשורים למחלות, כגון כימות חלבונים הקשורים לסרטן לצורך פרוגנוזה, אבחון וניהול טיפול. כדי להתחיל בהליך זה, הפשירו דגימות פלזמה אנושיות באמבט מים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.
לאחר מכן, הניחו את הדגימות על קרח עד להפשרה מלאה. לאחר מכן, העבירו ידנית 200 מיקרוליטר מכל דגימת פלזמה לבארות נפרדות של צלחת באר בעומק 1.1 מיליליטר. צנטריפוגה את הצלחת למשך 10 דקות בשתי מעלות צלזיוס ו -3, 000 סל"ד.
לאחר מכן, השתמש ב-Bravo כדי לדלל באופן סדרתי תמיסה סטנדרטית של 500 פמטומולה למיקרוליטר Ang-1 NAT להכנת שש תמיסות כיול עם אלבומין חלבון ביצת עוף. לאחר צנטריפוגה, פיפטה 200 מיקרוליטר מכל כיול לבאר ו-125 מיקרוליטר של מאגר ייצור לצלחת הדגימה. בעזרת מערכת אוטומטית לטיפול בנוזלים, מערבבים 125 מיקרוליטר של סופרנטנט פלזמה או 125 מיקרוליטר מתמיסת אלבומין חלבון ביצת עוף עם 25 מיקרוליטר של מאגר דור אנגיוטנסין I בצלחת באר עמוקה חדשה של 1.1 מיליליטר.
כעת, העבירו אוטומטית את התמיסות לצלחת של 96 בארות עם שלושה שכפולים לכל תמיסה ו-34 מיקרוליטר של תמיסה לכל באר. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לצורך צימוד הנוגדן עם חרוזי חלבון G, העבירו תחילה 78 מיקרוליטר של תמיסת חרוזים שהוכנה בעבר לצינור של 1.5 מיליליטר.
שטפו את החרוזים שבע פעמים עם מיליליטר אחד של 25% אצטוניטריל ב-PBSC ושלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBSC, בעזרת מעמד מגנטי כדי לגלול את החרוזים בין כל כביסה. לאחר שטיפת החרוזים, יש להשעות אותם מחדש ב -110 מיקרוליטר PBSC ולהוסיף 110 מיקרוליטר נוגדן נגד אנגיוטנסין I. מערבבים את החרוזים והתמיסה על ידי פיפטינג.
לאחר מכן, דגרו את החרוזים בטמפרטורת החדר למשך שעה תוך כדי סיבוב בשמונה סל"ד. לאחר מכן, שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBSC. לאחר מכן, השעו מחדש את החרוזים ב -1, 100 מיקרוליטר PBSC.
כעת, העבירו ידנית את תמיסת החרוזים לצלחת של 96 בארות. לאחר מכן, בקש מבראבו להצמיד את החרוזים לאותה צלחת של 96 בארות. לאחר תקופת הייצור של שלוש שעות אנגיוטנסין I, הנח את צלחת הדגירה על קרח למשך 10 דקות כדי לסיים את הייצור של אנגיוטנסין I. לדלל אוטומטית תמיסת מלאי פפטידים בתקני איזוטופים יציבים פי 100 עם מאגר PBS.
יתר על כן, ציטוט אוטומטי של דילול הפפטיד הסטנדרטי של האיזוטופ היציב לצלחת PCR של 96 בארות. העבירו 10 מיקרוליטר מתמיסת הפפטיד המדוללת לכל באר בצלחת הדגירה. מערבבים את תמיסת הפפטיד המדוללת עם דגימות הפלזמה או תמיסת האלבומין של חלבון ביצת העוף.
הוסף אוטומטית את המדגם או הפתרונות הסטנדרטיים לתמיסות החרוזים לצלחת הדגירה וערבב. לאחר הדגירה של שעה, שטפו אוטומטית את החרוזים שלוש פעמים בתמיסת אמוניום ביקרבונט של חמישה מילי-מולרים. השתמש במגנט כדי למשוך את החרוזים לתחתית לאחר כל שטיפה.
לאחר הכביסה האחרונה, הוסף 10 מיקרוליטר מתמיסת האמוניום ביקרבונט לכל באר כדי להשעות מחדש את החרוזים. העבר אוטומטית שבעה מיקרוליטר של תמיסת החרוזים על לוחית מטרה של MALDI בגודל נקודה של 2, 600 מיקרומטר. לאחר שהחרוזים התייבשו, הוסף אוטומטית שני מיקרוליטרים של תמיסת מטריצת HCCA שהוכנה בעבר מבאר המטריצה על כל נקודת דגימה על לוחית המטרה.
לאחר מכן, נתח את כתמי הדגימה עם מכשיר MALDI-TOF באמצעות מצב רפלקטור חיובי. בצע כיול פנימי, החלקת נתונים וחיסור בסיסי באמצעות התוכנה הספציפית לספק. הליך iMALDI האוטומטי למדידת אנגיוטנסין I מאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של מספר רב של דגימות עם מקדם שונות תוך יומי מתחת ל-10% ספקטרום מייצג המתקבל על ידי מדידת אנגיוטנסין I בדגימות פלזמה אנושיות מוצג כאן.
מתאם של ערכי PRA מ-188 דגימות מטופלים שהתקבלו עם בדיקת iMALDI האוטומטית עם ערכי PRA שהתקבלו באמצעות הליך LC-MS/MS קליני מוצג כאן. לשתי השיטות מקדם מתאם של 0.98, וההבדל בין המדרונות עשוי לנבוע משימוש בתקנים פנימיים שונים או בנוגדנים שונים. הטווח הליניארי של הבדיקה ודיוק הבדיקה מוצגים כאן.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כחמש שעות. בעת ניסיון הליך זה, זכור להתאים כראוי את ראש הקצה ואת מהירות הטיפול בנוזל. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות נוספות כדי לאשר אלדוסטרוניזם ראשוני בחולים, כולל העמסת מלח דרך הפה או בדיקות עירוי מי מלח.
טכניקת iMALDI האוטומטית מאפשרת סריקה כמותית ספציפית ומדויקת של דגימות ביולוגיות, כולל דגימות חולים, לחלבונים או פפטידים הקשורים למחלה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בדיקת iMALDI אוטומטית לכימות חלבון ופפטיד מבוסס ספקטרומטריית מסה. אל תשכח שעבודה עם דגימות ביולוגיות, כגון פלזמה אנושית, היא מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי הבטיחות הדרושים בעת ביצוע ההליך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לכימות פפטידים וחלבונים שלמים בנוזלים ביולוגיים מורכבים באמצעות טכנולוגיית immuno-MALDI אוטומטית (iMALDI). השיטה נועדה לספק מדידות מדויקות ורגישות, המסייעות באבחון ובמעקב אחר טיפול.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- פרוטאומיקה
- בדיקות ביולוגיות
- אבחון
רקע
- פרוטאומיקה כמותית חיונית להבנת רמות החלבון בתנאים שונים.
- כמות סימני חלבון ופפטידים נדירים יכולה להיות מאתגרת.
- אבחון מוקדם של מחלות יכול להשפיע משמעותית על תוצאות הטיפול.
- טכניקות אוטומטיות משפרות את הרגישות והדיוק בכימות חלבונים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה רגישה ומדויקת לכימות חלבונים.
- להקל על אבחון מחלות בשלב מוקדם.
- לספק תובנות לגבי פעילות הרנין בפלזמה וחלבונים הקשורים לסרטן.
שיטות ששימשו
- טכנולוגיית immuno-MALDI אוטומטית (iMALDI).
- שלב העשרת אימונו לחלבונים נדירים.
- הפשרת דגימות פלזמה אנושיות לצורך ניתוח.
- כימות חלבונים ופפטידים בנוזלים ביולוגיים מורכבים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת כימות רגיש של חלבונים מדגימות מורכבות.
- ניתן ליישם אותה במגוון מחקרים הקשורים למחלות.
- אבחון מוקדם של מחלות מתאפשר באמצעות מדידה מדויקת של חלבונים.
- ניתן להשיג תובנות לגבי מעקב אחר טיפול ותגובת המטופל.
מסקנות
- טכנולוגיית iMALDI אוטומטית היא כלי חשוב בפרוטאומיקה כמותית.
- השיטה משפרת את היכולת לאבחן מחלות בשלב מוקדם.
- היא מספקת מסגרת למחקרים עתידיים על כימות חלבונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Automated immuno-MALDI (iMALDI) addresses the critical challenge of quantifying low-abundance peptide and protein biomarkers in complex biofluids, enabling sensitive detection in the ng/mL to pg/mL range required for clinical applications. By integrating immuno-enrichment with MALDI-TOF mass spectrometry and full automation, the method delivers high-throughput, reproducible quantification with intraday CV below 10%, supporting reliable biomarker measurement for diagnostic and therapeutic monitoring workflows. This capability enhances predictive confidence in target validation and assay development for cardiovascular, endocrine, and oncology indications where low-abundance analytes drive clinical decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying low-abundance peptides like angiotensin I in plasma, supporting functional validation of disease-relevant targets.
- Operational Value: Provides specific and accurate measurements from complex samples, reducing false negatives in biomarker detection and improving target confidence.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking through precise correlation with clinical readouts such as plasma renin activity, demonstrated by R=0.98 vs LC-MS/MS.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, mass-specific readouts via MALDI-TOF detection, enabling precise comparison of analyte levels across conditions and samples.
- Operational Value: Streamlines sample preparation through automation on liquid handling systems, improving reproducibility and throughput for large-scale screening campaigns.
- Assay Readiness: Eliminates elution steps, simplifying workflow and reducing hands-on time while maintaining sensitivity for low-abundance analytes in biofluids.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports alignment with clinical biomarkers like plasma renin activity, enabling translation from discovery to preclinical validation using disease-relevant concentration ranges.
- Risk-Adjusted Advancement: Delivers quantitative data with defined precision (CV<10%) and linearity, informing go/no-go decisions in lead optimization and preclinical candidate selection.
- Disease-Relevant System: Applicable to human plasma and other complex fluids, ensuring physiological relevance for cardiovascular, renal, and oncology biomarker studies.
Pipeline & Workflow Integration
The iMALDI method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to translational screening, providing quantitative protein and peptide measurements that inform lead identification and preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling sensitive quantification of signaling peptides and protein biomarkers in native biological matrices.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs with high reproducibility, facilitating reliable compound effect measurement in phenotypic or target-based screens.
- Analytics: Generates mass-resolved, quantitative readouts suitable for statistical comparison and correlation with functional or clinical endpoints.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through biomarker alignment, as demonstrated by angiotensin I quantification correlating with plasma renin activity in patient samples.
- Enterprise Reuse: Automated platform design allows reuse across multiple targets by changing antibody-bead conjugates, supporting scalable implementation in core proteomics laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through sensitive, specific detection of low-abundance analytes in disease-relevant samples.
- Operational Value: Standardization, reproducibility (CV<10%), and scalability via automation, reducing variability and increasing sample throughput.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing reliable biomarker data, reducing late-stage biological attrition and improving capital efficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, translationally aligned measurements that reflect target engagement and pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoassay design, antibody conjugation, and MALDI-TOF operation for successful implementation and troubleshooting.
- Dependent on liquid handling automation, magnetic bead separation systems, and MALDI-TOF instrumentation with reflector mode capability.
- Necessitates standardization across teams for reagent preparation, washing protocols, and matrix application to ensure inter-run consistency.
- Adaptation to new targets requires validation of antibody specificity, bead coupling efficiency, and interference testing in relevant biological matrices.
- Practical limitations include potential ion suppression in complex samples and the need for optimization of washing and elution-free transfer steps for each analyte-matrix pair.
