הידרופוני Co- טיפוח מערכת לניתוח סימולטני ושיטתי של הצמח / מיקרובי אינטראקציות מולקולרית איתות

המטרה הכוללת של מערכת זו היא לחקור את האינטראקציה והתגובות ההדדיות של איתות בין צמח למיקרו-שותפים או תגובות צמחים לכימיקלים או לגורמים אביוטיים במערך ניסיוני פשוט המחקה מקרוב את הסביבה הטבעית. סרטון זה מציג גידול משותף של צמחים עם חיידק Agrobacterium tumefaciens. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח באינטראקציות מיקרוביאליות של צמחים, בתגובת עקה מיקרוביאלית או צמחית, ובאיתות מולקולרי, כולל איתות מורכב אפילו בשלב ראשוני של האינטראקציות המיקרוביאליות של הצמח.

היתרון העיקרי של השיטה הזו הוא שהיא מסייעת להבין את איתות הטבע ואת התגובה של האינטראקציות המיקרוביאליות של הצמח, במערך פשוט שכולל חיקוי של הסביבה הטבעית. אף על פי ששיטה זו יכולה לשמש כדי לספק תובנות לגבי אינטראקציות של צמחים עם מין מיקרוביאלי יחיד, היא יכולה לשמש גם לחקר אינטראקציות של צמחים עם מינים מיקרוביאליים מרובים או עם גורמים אביוטיים. היה לנו את הרעיון לשיטה זו בזמן שחיפשנו הומאוסטזיס איתות תאים במהלך אינטראקציות של חיידקי צמחים המחקים מקרוב מצבים טבעיים.

כדי להתחיל בניסוי, יש לעקר זרעים. עבור Arabidopsis thaliana, שלב כ-200 זרעים עם 500 מיקרוליטר של מים נטולי יונים בצינור מיקרו צנטריפוגה, ומערבל את הצינור במהירות גבוהה. צנטריפוגה את הצינור ב-9000 x גרם למשך 30 שניות במיקרו צנטריפוגה שולחנית.

בעזרת פיפט, הסר את נוזל המים. לאחר מכן, הוסיפו לזרעים 300 מיקרוליטר של 2% נתרן היפוכלוריט ומערבלו אותם. תנו לתערובת להתייצב בטמפרטורת החדר.

לאחר דקה אחת, צנטריפוגה את הזרעים. בעזרת הפיפט, הסר את תמיסת הנתרן היפוכלוריט. לאחר מכן מוסיפים לזרעים 500 מיקרוליטר מים סטריליים ונטולי יונים, ומערבלים את התערובת.

לאחר צנטריפוגה של הצינור, הסר את המים. מוסיפים לזרעים 500 מיקרוליטר של אתנול 70%, ומערבלים את התערובת. לאחר שאפשרו לזרעים להתיישב למשך דקה אחת, צנטריפוגה את הצינור.

הסר את האתנול 70% באמצעות פיפט. שוטפים את הזרעים חמש פעמים עם 500 מיקרוליטר מים סטריליים ונטולי יונים. לאחר מכן, השעו מחדש את הזרעים המעוקרים ב -500 מיקרוליטר מים סטריליים וטהורים במיוחד.

יוצקים 25 מיליליטר של מוראשיג'ה וסקוג בחצי חוזק, או מדיום MS עם 04% פיטו אגר לכל צלחת פטרי סטרילית ועמוקה. עבור כל צלחת פטרי, גזרו ריבוע של 90 מילימטר על 90 מילימטר של רשת נירוסטה. כופפו את הפינות של כל רשת מרובעת מספיק כדי שהרשת תיכנס לצלחת הפטרי.

כופפו את הפינות בזווית של 90 מעלות לחלק הארי של הרשת כדי לאפשר לרשת להישען על ידי הפינות, ולהשאיר מספיק מקום למטה להתפתחות שורשים. הכניסו את ריבועי הרשת החתוכים לכוס וכסו אותם בנייר אלומיניום. עקר את ריבועי הרשת על ידי חיטוי באמצעות מחזור ייבוש של 30 דקות.

לאחר שהמדיום התמצק בצלחות הפטרי, והרשת סטרילית, הניחו כל ריבוע רשת על גבי המדיום המוצק כשהפינות הכפופות פונות כלפי מטה. דחוף את הרשת כך שהפינות יחדרו למדיום ועיקר הרשת נוגע במשטח העליון של המדיום. לאחר מכן, השתמש בפיפט סטרילי של 200 מיקרוליטר כדי לשלוף את זרעי ה-A המעוקרים על פני השטח ולהעביר בעדינות כל זרע על גבי הרשת.

מניחים את הזרעים כך שיהיו מרווחים לפי מיני הצמחים וצרכי הניסוי. אטמו את צלחות הפטרי במכסים והניחו סרט כירורגי נקבובי סביב שולי הצלחות. עוטפים את הזרעים בנייר אלומיניום.

רובד את הזרעים על ידי הנחת כל צלחת הפטרי. לאחר יומיים, מטפחים את הזרעים בצלחת פטרי בטמפרטורה של 22 עד 24 מעלות צלזיוס עם תקופת צילום של 16 שעות למשך 10 עד 14 יום. במכסה זרימה מעוקר, שפכו 18 מיליליטר של מדיום MS נוזלי חיטוי למיכלי זכוכית גליליים סטריליים עם מכסים סטריליים.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר בעדינות כל ריבוע רשת עם שתילים בני 10 עד 14 יום מצלחת הפטרי של מדיום מוצק למחצה למיכל גלילי הידרופוני. השתילים המוצגים כאן הם אספסת. אטום את המכסים על המיכלים באמצעות סרט כירורגי נקבובי.

לאחר מכן, טפחו את השתילים בטמפרטורה של 22 עד 24 מעלות צלזיוס עם תקופת צילום של 16 שעות ורעידות ב -50 סל"ד. לפני החיסון, בדוק היטב את המיכל עם שתילים לאיתור כל זיהום פוטנציאלי. המדיום במיכלים הלא מזוהמים צריך להיות שקוף ושקוף.

אם הטנקים מעוננים מזיהום, השליכו אותם וספרו את שאר המיכלים. דגימו 20 מיקרוליטר של מדיום הידרופוני מכל מיכל ממוספר ואתרו אותו על צלחת פטרי עם מרק לוריא או אגר LB. דוגרים את המנה בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך 28 שעות.

חסנו מיד כל מיכל הידרופוני ממוספר ב-50 מיקרוליטר של תרחיף ה-agrobacterium tumefacians לכל מיכל הידרופוני ממוספר. לגדל במשותף את השתילים ואת חיידק הטומפאקים בטמפרטורה של 22 עד 24 מעלות צלזיוס עם תקופת צילום של 16 שעות ורעידות ב-50 סל"ד. בדוק את צלחת ה-LB המנומרת לאחר 12 ו-28 שעות דגירה כדי לוודא את הסטריליות של מצע הגידול ההידרופוני.

אם יש זיהום כלשהו, אל תשתמש במיכל הממוספר המתאים המחוסן בחיידקים לבדיקות נוספות במורד הזרם. לאחר מכן, הפרד את השורשים מהתרחיף החיידקי על ידי הרמת לוחית הרשת. אם משתמשים בשורשים לניתוחים הבאים, חותכים את השורשים, שוטפים אותם במהירות במים מזוקקים כפולים ומייבשים על נייר פילטר מעוקר.

אם משתמשים בעלה או ברקמה אחרת, חתכו את הטישו. לצורך ניתוח תעתיק צמחים, יש להפקיד מיד את השורשים או הקלעים בחנקן נוזלי. לניתוח תעתיק חיידקים, העבירו 1.5 מיליליטר מהתרבית ממיכל הגידול המשותף וגלו את התאים על ידי צנטריפוגה.

לאחר גידול משותף מתאים, השתמש במספריים סטריליים כדי להפריד בין שורשים משניים בודדים, הענפים הצדדיים של השורש הראשי. לאחר מכן, שטפו את השורשים במים מזוקקים כפולים כדי להסיר חומר קשור באופן רופף. טבלו כל שורש ב-30 מיקרוליטר מים על מגלשת מיקרוסקופ, וכסו אותו בכיסוי זכוכית.

אטום את שולי הכיסוי עם לק כדי להגן על השורשים מפני התייבשות. לאחר מכן דמיין את ההצמדה של טומפאקים לשורשי תליאנה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר גידול משותף מתאים, הפרד את הצמחים מהמדיום ההידרופוני.

עקר את 18 מיליליטר המדיום ההידרופוני על ידי העברתו דרך מסנן נקבוביות של 0.2 מיקרון לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר. הקפיאו את הדגימות בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, שחררו את המכסים על הצינורות החרוטיים של 50 מיליליטר והניחו אותם במכונת ייבוש בהקפאה למשך 36 שעות.

לבסוף, המשך לאחסן או לעבד את הדגימות לניתוח HPLC וזיהוי תרכובות. ללא חומרים מזינים שסופקו באופן מלאכותי, גידול טומפאקים c58 גדל במערכת הגידול המשותף. לעומת זאת, למעשה לא נצפתה צמיחת חיידקים בתרבית הביקורת ללא תליאנה.

ניתן להשתמש במערכות הגידול המשותף ההידרופוני כדי לחקור את ההצמדה של חיידקים למבנה השורש כפי שניתן לראות בהדמיה מיקרוסקופית זו, שבה חיידקים בעלי תווית פלואורסצנטית אדומה של PCherry היו ממוקמים במבנה שורש הצמח עם צורת סלע או חוט טיפוסית. ניתן לברר פרופילי ביטוי גנים הן של עמדות צמחים והן של חיידקים המקיימים אינטראקציה באמצעות QRTPCR. לאחר שמונה שעות של גידול משותף, שמונה תאים טומפאקיים חשפו ויסות של ביטוי גנים אלימים.

במקביל, שורשי A thaliana חשפו ביטוי גנים דיפרנציאלי בתגובה לגידול משותף. לאחר 72 שעות של גידול משותף, 35 תרכובות שופרו ו-76 תרכובות הופחתו בהפרשה של צמחים מחוסנים בהשוואה לביקורת. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לחקור אינטראקציות בין צמח למיקרוב ולחקור את התגובות ההדדיות בין צמח לחיידקים או שותפים לביומה של חיידקים, או תגובות צמחים לגורמים אביוטיים במערך פשוט המחקה מקרוב את הסביבה הטבעית.

לאחר צפייה בזה איתך, אנו מקווים שתוכל להקים מערכת גידול משותף של צמחים מיקרוביאלית בהידרופוניקה כדי לחקור צמחים מולקולריים, אינטראקציות מיקרוביאליות ותגובות איתות בסביבה טבעית וניתנת לניהול יותר.