Name: מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: למד איך לחלץ פרמטרים תרמודינמיים של קיפול ואיגוד ביומולקולרי באמצעות DSC עם ליגנדים תרמולאביליים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מהיר לעיצוב תרופות וביוקלורימטריה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

V ח וו ר נתמכה על ידי מדעי הטבע מקגיל תוכנית אימונים הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC) ב- Bionanomachines. א ק מ ופי אי ג'יי נתמכו על ידי מענקים NSERC 327028-09 (א ק ז), 238562 (פי אי ג'יי).

1. הכנת הדוגמא
<ol><li>לטהר את biomolecule הרצוי13. הערה: זה פרוטוקול שימושים לרכוש קוקאין-איגוד ה-DNA aptamer MN4 לאחר החלפת נגד 2 M NaCl 3 פעמים ואחריו שלושה סבבי מים יונים באמצעות מסנן צנטריפוגלי עם קרום ניתוק משקל מולקולרי 3 kDa.</li>
	<li>לסנתז, לטהר, או לרכוש את הרצוי ליגנד thermolabile13. הערה: MN4 נקשר ליגנד thermolabile הקוקאין. MN4 נקשר גם כינין, אשר משמש פקד שלילי ליגנד thermolability בטמפרטורות אלה ניסיוני.</li>
	<li>להכין מאגרי דיאליזה של biomolecule מטוהרים והפירוק של ליגנדים (מאגר NaCl נתרן פוספט ו- 140 מ מ 20 מ מ, pH 7.4, MN4, את ליגנדים המשמש כאן).</li>
	<li>Dialyze את biomolecule נגד לפחות 2 L מאגר באמצעות דיאליזה אבובים עם 0.5 - 1.0 kDa ניתוק.</li>
	<li>לסנן המאגר הסופי (המכונה מאגר עובדים) דרך מסנן 0.2 µm יש כבר equilibrated ביסודיות עם מאגר.</li>
	<li>שוקל את ההמונים ליגנדים הרצוי, לפזר אותם במאגר העבודה מסוננים. אם הריכוזים ליגנד הרצוי לדרוש גושים קטנים מדי לשקול במדויק, ליצור פתרון מניות ליגנד מרוכז (10 x למשל). הערה: זה הכרחי כי כל הניסויים DSC לנצל את המאגר לעבוד באותו המדגם, ליגנד, קרי, לא לבצע ניסוי שבו ליגנד הוא מומס אצווה שונה מאגר עובדים מאשר biomolecule כמו זה יגרום מאגר חפצים אי התאמה של הנתונים.</li>
	<li>לסנן את הפתרון מניות biomolecule דרך מסנן 0.2 µm יש כבר equilibrated ביסודיות באמצעות מאגר עובדים.</li>
	<li>לקבוע את הריכוז biomolecule על ידי ספיגת מדידות (260 ננומטר עבור חומצות גרעין כמו MN4 ו- 280 ננומטר חלבונים).</li>
	<li>לאחסן את biomolecule מוכן ואת ליגנד במקרר 4 ° C (מתאים MN4 של ליגנדים המשמש כאן), או ב-20 או -80 ° C אם biomolecule ואת ליגנדים לסבול הקפאה ואחסון לטווח ארוך נדרש. דגה הפתרונות מאגר, biomolecule וליגנד מלמעלה בטבלה degasser (ראה טבלה של חומרים) לפני טעינה אל DSC. הערה: Degassing מסייעת למנוע היווצרות בועה ב DSC בטמפרטורות גבוהות יותר. בועות לגרום חפצים אות שמחשיך DSC שיא וצורות בסיסיות.</li>
</ol>2. DSC הכנה
<ol><li>לפרק ידית לחץ מ DSC (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>הפעל סיליקון אבובים מתוך המאגר עבודה ולחבר אותו מקורבות הקדמי (מתכת פתיחה) של נים ההפניה.</li>
	<li>ליצור גשר בין הנימים הפניה, לדוגמה על-ידי חיבור והסתיר את הפניית האחוריים והסתיר דגימת קבלה.</li>
	<li>צרף פיסת סיליקון אבובים מקורבות אחורי מדגם שפועל אל בקבוק פסולת עם קו ואקום מצורף.</li>
	<li>הפעל את הקו ואקום לרוקן את DSC עם 200 מ ל מאגר עובדים.</li>
	<li>לטעון את נימי הפניה של DSC עם מאגר עובדים. לצרף בערך 3-5 ס מ מקטעים של סיליקון אבובים flanges נימי ההפניה.</li>
	<li>להוסיף טיפ פיפטה 1 מ"ל סיליקון אבובים של מקורבות אחורי. לצייר 0.8 מ של מאגר עובדים עם פיפטה והכנס את הטיפ פיפטה עם מאגר לתוך צינורות סיליקון של מקורבות אסמכתא קבלה.</li>
	<li>לחץ בעדינות על הבוכנה פיפטה אל מעבר המאגר לעבוד דרך לאורך צינור סיליקון קבלה לתוך נימי הפניה ומצורפת למעלה לתוך של לכנף אחורית טיפ פיפטה. לחץ כלפי מטה הבוכנה פיפטה עד רמת מאגר עובדים מגיע בדיוק מעל לאורך צינור סיליקון הקבלה, ואז לשחרר את הבוכנה פיפטה עד רמת מאגר עובדים מגיע בדיוק מעל לאורך צינור אחורי סיליקון.<ol>
<li>חזור על העברת מאגר עובדים הלוך לטהר את עוצמת הקול נימי הפניה של בועות. הערה: בדרך כלל, עובר 10 של הפתרון הלוך מספיקים לנקות את כל הבועות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>קאפ הקצה האחורי פיפטה עם האגודל ומשוך בעדינות פיפטה אחורי עצה, פיפטה קבלה כדי להסיר אותם מן flanges ההפניה עם לאורך צינור סיליקון המצורפת.</li>
	<li>לטעון את נימי מדגם באמצעות מאגר עובדים כמו מדרגות 2.6 2.9. במקום כובע פלסטיק שחור על ההפניה אחורי, לטעום flanges, עוזב את אוגן קדמי חשפו.</li>
	<li>לצרף את הידית לחץ.</li>
	<li>לפתוח את התוכנה DSC (ראה טבלה של חומרים), לדחוס את המכשיר על ידי לחיצה על החץ בחלק העליון של הממשק האדום העולה למעלה ברגע הקריאה כוח התייצב; הכוח DSC מסומן בתוך קופסה בחלק העליון הימני של הממשק יחד עם כלי טמפרטורה, קריאה לחץ. הערה: הצג הכוח לקרוא גם DSC הרמטי סיליקון. שינויים בשלטון של יותר מ ~ 10 µW מצביעים על היווצרות בועה הנימים, אשר יכול לגרום חפצים הנתונים. הפתרונות חייבים להיות הוסר, degassed נוסף לפני שתמשיך.</li>
	<li>Equilibrate על DSC עם מאגר עובדים על-ידי ביצוע סריקה ואחורה. בכרטיסיה "השיטה הניסיונית" בצד שמאל של המסך, ודא כי האפשרות "סריקה" נבחרה לנהל את DSC ב טמפרטורה ומצב סריקה. הערה: ניסיוני הפרמטרים הם הטמפרטורה סריקה טווח, קצב סריקה, חום נמוך וגבוה equilibration זמן ומספר של סריקות.<ol>
<li>שיבוץ "טמפרטורה פרמטרים" תחת הלשונית "השיטה הניסיונית", לחץ על הלחצן "חימום". הזן 1 ו- 100 ° C בטמפרטורות ניסיוני העליון והתחתון, 1 ° C/דקה את קצב הסריקה, 60 s עבור התקופה equilibration.</li>
		<li>לחץ על לחצן "הוסף סדרה" תחת השדה קלט עבור התקופה equilibration. הזן 2 לתוך השדה "להוסיף שלבים" בחלון מוקפץ (עבור אחד סריקה הקירור והחימום אחד) וסמן את התיבה "חלופי חימום/קירור". לחץ על "אישור"; הסריקות שנוספו מופיעים בחלק התחתון של הממשק. בדוק הפרמטרים עבור כל סריקה הם כמו הרצוי.</li>
		<li>להתחיל את הניסוי על-ידי לחיצה על הכפתור הירוק "לשחק" בחלק העליון של הממשק. נווט אל התיקיה הרצויה, קלט שם קובץ לשמירת הניסוי בחלון מוקפץ. להציג את התקדמות הניסוי על-ידי לחיצה על הכרטיסיה "נתונים" בצד ימין של הכרטיסייה "שיטת הניסוי".</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. איסוף Datasets DSC ליגנד Thermolabile
הערה: ההליך מינימלית כוללת חמישה ניסויים: מאגר ניסויים הפניה עם ובלי ליגנד (שימוש עבור חיסור בסיסית, ראה דיון), לטעום ניסויים עם biomolecule ללא תשלום, biomolecule מאוגד-ליגנד, ו ליגנד-מחויב biomolecule עם פרק זמן ארוך יותר equilibration בטמפרטורה גבוהה.
<ol><li>עורכים ניסויים הפניה עבור חיסור בסיסית של הנתונים לדוגמה. רענן את DSC עם מאגר עובדים בשני נימים ולאסוף מספר סריקות ואחורה על טווח טמפרטורה מתאימים ב- 1 ° C דקות-1 עם ממריץ (חום גבוה) equilibration הזמן של 120 s.<ol>
<li>למחוק את הסריקות equilibration מאגר קודמות בחלק התחתון של הממשק על-ידי סימון כל אחד בנפרד, לחיצה על ה-X האדום באמצע נכון של הממשק. הוסף את הסריקות החדש על ידי לחיצה על לחצן "הוסף סדרה", כניסה 20 את השדה "צעדים כדי להוסיף" סימון התיבה "חלופי חימום/קירור". לחץ על אישור והפעל את הניסוי על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה הירוקה כמפורט לעיל.</li>
		<li>חזור על שלבים 3.1 - 3.1.1 עם עבודה מאגר המכיל את הריכוז הרצויה של ליגנד ב שני נימים כדי להשיג את ההפניה ניסויים עבור ליגנד (לאסוף שני ניסויים נפרדים באמצעות 120 s ו- 600 s בטמפרטורה גבוהה equilibration פעמים בהתאמה, כדי לשמש להשגת על קצב קבוע עבור המרה ליגנד thermolabile). הערה: קצב הסריקה המשמש כאן מבטיח biomolecule בניסויים הבאים ב שיווי משקל תרמי סריקות ואחורה (ראה דיון). סרוק המחירים < 0.1-0.2 ° C דקות-1 להוביל thermograms רועש ו אינם ישימים בניסויים DSC. הטמפרטורות כדאי להאריך מן מתחת טמפרטורת ההיתוך biomolecule חינם טוב מעל טמפרטורת ההיתוך רווי-ליגנד biomolecule (~ 20-80 ° C עבור MN4). ודא הפארמצבטית של הסריקות (עבור דוגמה, קדימה 10 וסריקות הפוכה 10 20 הכולל מספיקה).</li>
		<li>אם משתמש ליגנדים מרובים (כגון קוקאין כינין), לרוקן את DSC עם 200 מ ל מאגר עובדים (אני חוזר משלב 2.5) בין פועל כדי להסיר ליגנד הנימים ולמנוע זיהום צולב. הערה: מומלץ לבצע ניסוי שכפל על biomolecule חינם לאחר ריצה ליגנד מאוגד על מנת לבדוק אם ליגנד הקודם adsorbs בחוזקה אל קירות נימי, אינו מוסר בצורה הולמת עם מאגר שטיפה. אם thermograms עבור biomolecule חינם מופיעה כדי להיות מוזז בסדר גודל גדול יותר, טמפרטורת דנטורציה גבוהה לאחר הניסוי ליגנד מכורך, סביר להניח כי ליגנד הקודם הוא עדיין נוכח קלורימטר לאחר שטיפה. הסר את ליגנד הספוחה על-ידי המקננת הנימים עם 20% Contrad-70 לשעה ב 60 מעלות צלזיוס עם מכסי פלסטיק, ידית לחץ. בתוכנה DSC, שנו את מצב ניסיוני כדי "איזותרמי" תחת הכרטיסיה השיטה הניסיונית 3,600 לבחור s עבור משך ו- 60 ° C עבור הטמפרטורה איזותרמי, עם אפס שהוזנו עבור הזמן equilibration. לחץ על "הוסף את השיטה הניסיונית". הניסוי איזותרמי מופיע בחלק התחתון של המסך. לאחר השלמת, לשטוף את המכשיר עם יונים 2 ל' מים וחזור מ שלב 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עורכים ניסויים מדגם באמצעות אותו DSC טעינת הליך ופרמטרים ניסיוני כמו סורק ההפניה. עבור ערכת הנתונים biomolecule חינם, ודא כי נימי הפניה מכיל מאגר עובדים בזמן נימי מדגם מכיל את biomolecule חינם-הריכוז הרצוי במאגר עבודה.<ol>
<li>לניסויים מאוגד-ליגנד, ודא ליגנד נמצאת במאגר לעבוד בנים הפניה, biomolecule בתוספת ליגנד נמצאים במאגר לעבוד בנים הדגימה. לרוקן את המערכת בין תוספות של ליגנדים שונים כמו שלב 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בצע אחד ניסוי נוסף עם biomolecule חייב ליגנד thermolabile איפה התקופה equilibration בטמפרטורה גבוהה מוגברת 600 s ו פרמטרים ניסיוני אחרים הם כמו שלב 3.2.1. הערה: משך תקופת equilibration בטמפרטורה גבוהה עבור הניסוי השני ליגנד מכורך פשוט נבחר כדי להבטיח ליגנד מדולדל במהירות רבה יותר מאשר הניסוי זמן קצר equilibration. אם הפסגות ליגנד מכורך מהראשון ניסוי דעיכה לאט כפונקציה של מספר סריקה (למשל, הבדלי שיא רצופים maxima נמצאים ≤ 0.5 ° C), הערכת 10 - עד 20 פי מגביר את תקופת equilibration בטמפרטורה גבוהה על מנת שלמאחה לרוקן את ליגנד במהלך הניסוי השני. חישוב מדויק קבוע קצב לגיור ליגנד דורש כי הניסוי השני יש דלדול מואץ ליגנד ביחס הראשון. הריכוזים ליגנד שחולצו מן הבדיקה הכללית של שני ניסויים יהיו דומים, ולכן בלתי שמיש אם דלדול ליגנד היא לא מספיק מואצת של הניסוי השני.</li>
</ol>4. עיבוד נתונים
<ol><li>פתח DSC ניסוי קבצים בתוכנת ניתוח נתונים DSC (ראה טבלה של חומרים) ולייצא את הנתונים בעצמתה כמו גליונות אלקטרוניים.</li>
	<li>לייבא את גליונות אלקטרוניים המכילה את נתוני כוח גולמי לתוך תוכנת עבור נתונים מתאים.</li>
	<li>בסיסית להחסיר את הנתונים לדוגמה על-ידי חיסור מאגר נתונים כוח מ חופשי וניסויים מאוגד-ליגנד biomolecule. הערה: עבור הניסוי ליגנד thermolabile, הריכוז של ליגנד הראשונית הולך ופוחת עם כל סריקה. לכן, הוא אידיאלי כדי לחסר את הסריקה מאגר 1 באמצעות סריקה מדגם 1, וכן הלאה. מצאנו כי הסריקות מאגר עם קוקאין אינם משתנים ניכרת ההמרה ליגנד התמורה, ולכן סריקת מאגר יחיד ליגנד thermolabile יכול לשמש כדי לחסר את כל הנתונים מאוגד-ליגנד thermolabile.</li>
	<li>המרת הנתונים כוח לדוגמה המופחת בסיסית קיבול חום. הערה: ההמרה מחייבת של biomolecule חלקי אחסון מסוים, אשר יכול להיות מוערך14,15,16. המשוואה לחישוב המרת כוח קיבול חום כבר שתוארה לעיל17.</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
<ol><li>באופן כללי להתאים את equilibration קצר זמן thermolabile קיבול חום של ליגנד מאוגד נתונים (dataset) עם ערכה אחת של תוכנית בסיסית, ליגנד, קיפול לריכוז ליגנד תיחום פרמטרים כפי שתואר לעיל4.</li>
	<li>חזור על שהעולמי מתאים ערכת הנתונים זמן equilibration זמן כדי לחשב את שיעור קבוע לגיור ליגנד thermolabile כפי שתואר לעיל4.</li>
</ol>

<ol><li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+in+life+science%3A+thermodynamics%2C+stability%2C+molecular+recognition+and+application+in+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li>
<li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Anatoliy_Dragan/publication/7002826_Microcalorimetry_of_biological_macromolecules/links/0912f507f62e09cd1b000000.pdf">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li>
<li>Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+strong+to+ultratight+protein+interactions+using+differential+scanning+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry.</a> Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).</li>
<li>Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+characterization+of+folding+and+binding+interactions+with+thermolabile+ligands+by+DSC%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC.</a> Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).</li>
<li>Garbett, N. C., Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+studies+for+drug+design+and+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Dis%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic studies for drug design and screening.</a> Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).</li>
<li>Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+binding+thermodynamics+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Measurements of binding thermodynamics in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).</li>
<li>Plotnikov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li>
<li>Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics-based+drug+design%3A+strategies+for+inhibiting+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions.</a> Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).</li>
<li>Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2173508511000141">Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure.</a> Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).</li>
<li>Murray, J. B., Alshora, H. I. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2710.1978.tb00096.x/full">Stability of Cocaine in Aqueous-Solution.</a> J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).</li>
<li>Waterman, K. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12066569">Hydrolysis in pharmaceutical formulations.</a> Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).</li>
<li>Mergny, J. L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15025917">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li>
<li>Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+stem+length-dependent+binding+mechanism+for+the+cocaine-binding+aptamer.+A+combined+NMR+and+calorimetry+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study.</a> Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).</li>
<li>Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+electrophoretic+and+hydrodynamic+properties+of+DNA+and+RNA+oligonucleotide+duplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes.</a> Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).</li>
<li>Hinz, H. -J. Chapter 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDurchschlag%2C+H+%22Thermodynamic+Data+for+Biochemistry+and+Biotechnology%22">Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. 45-128 (1986).</li>
<li>Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenomenological+partial-specific+volumes+for+G-quadruplex+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J+Biophy%22%5BJournal%5D)">Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs.</a> Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).</li>
<li>Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Protein+Folding+Cooperativity+by+Differential+Scanning+Calorimetry+and+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy.</a> J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).</li>
<li>Reinstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quinine+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.+Thermodynamic+and+hydrodynamic+analysis+of+high-affinity+binding+of+an+off-target+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li>
<li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="https://web.stanford.edu/~kimth/www-mit/8.13/error_propagation.pdf">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li>
<li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

שינויים ופתרון בעיות
הפרטים של הניתוח התאמה העולמית בשימוש איור 1 , איור 2 היה שתואר לעיל4. כאן, אנחנו חלוקה לרמות ההיבטים המעשיים של ביצוע וניתוח DSC מחייב בין ניסויים ליגנדים thermolabile. שימו לב כי תוכנית בסיסית DSC להשיג עבור ליגנד thermolabile לבד המופחת של ליגנד + biomolecule dataset, ביטול ביעילות את החום שוחררו או נספג על ידי ההמרה התרמית לעבד את עצמה. הניתוח מתאים הכללית ליגנד thermola...

דיפרנציאלית סריקה calorimetry (DSC) היא שיטה חזקה עבור איגוד למערכות ביולוגיות quantitating ומתקפלים אינטראקציות1,2,3. נקודות החוזק של DSC כוללים את יכולתו להבהיר מחייב וקיפול מנגנונים, תשואה של2,המקביל פרמטרים תרמודינמי3. יתר על כן, DSC יכול להתבצע בפתרון בתנאים ליד-פיזיולוגיים, לא דורשת תיוג של biomolecule או ליגנד, למשל, עם fluorophores, ספין-תוויות או גרעינית איזוטופים4. המכשיר סורק בטמפרטורה, מודדים את כמות החום הדרושה כדי denature את biomolecule, הנוכחות ואת היעדר ליגנד. Thermograms שנוצר משמשים כדי לחלץ את הפרמטרים תרמודינמי המסדירים את ליגנד מחייב וקיפול תהליכים. המידע שנמסר על ידי DSC או בטכניקות אחרות תרמודינמי חיוני המנחה את העיצוב של שהתרופות המתוות מולקולות1,5,6,7,8. עם זאת, סריקה חוזרת ונשנית לטמפרטורות גבוהות (~ 60-100 ° C) יכול להיות בעייתי. לדוגמה, תרכובות הם חשובים רבים עוברים סידור או ריקבון על חשיפה מתמשכת בטמפרטורות גבוהות9,10,11, קרי, הם thermolabile. בחינה של איגוד אינטראקציות על ידי DSC בדרך כלל דורש מספר סריקות ואחורה כדי לאמת את הפארמצבטית של תמוגרפיה ניתוח תרמודינמי12. המרה תרמי של ליגנד הראשונית בטופס משני עם איגוד שינו מאפיינים מוביל בולטת הבדלים הצורה והמיקום של thermograms רצופות, מאז ריכוז ליגנד הראשונית יורדת עם כל סריקה בזמן ההמרה התרמית מוצרים לצבור. אלה נתונים (datasets) נתונות לא ניתוח מסורתי.
לאחרונה פיתחנו שיטת המדידה הכללית datasets ליגנד thermolabile DSC המניבה את הערכה המלאה של פרמטרים תרמודינמי המסדירים את הקיפולים למערכות ביולוגיות ואיגוד אינטראקציות של ניסוי מאוגד-ליגנד אחד הפניה תמוגרפיה כנדרש עבור חינם biomolecule4. הניתוח מקטין את זמן הניסוי ואת מדגם הנדרש על-ידי ~ 10-fold בהשוואה הגישות DSC סטנדרטי. יש לנו פיתרון ליגנד ההמרה התרמית שייטול את זה קורה במהלך החלק בטמפרטורה גבוהה של כל סריקה איפה תמוגרפיה אינו תלוי בריכוז ליגנד. לכן, ריכוז ליגנד הוא קבוע בתוך החלק של תמוגרפיה המשמש כדי לחלץ תרמודינמי פרמטרים. בנוסף להדגים איך קצב קבוע לגיור תרמי ליגנד יכולה להיות מושגת על ידי ביצוע ניסוי משלים אחד עם פרק זמן ארוך יותר equilibration בטמפרטורה גבוהה. עבור מערכות ההמרה התרמית ליגנד איפה פחות תלוית טמפרטורה (קרי, המתרחשים ניכרת בטמפרטורות כל), הניתוח יכול להיות שונה כדי לכלול ריכוזים ליגנד משתנה. כאן אנחנו מוכיחים את הליך זה עבור aptamer DNA MN4 בנוכחות הקוקאין ליגנד thermolabile, אשר ממירה במהירות benzoylecgonine בטמפרטורות גבוהות (> 60 ° C). כינין משמש פקד שלילי ליגנד thermolability כיוון שהוא אינו עובר המרה בטמפרטורות אלה ניסיוני נקשר גם MN4. אנו מתארים הרכישה של ליגנד thermolabile DSC datasets וניתוח שלהם מניב פרמטרים תרמודינמי, קינטי של קיפול, איגוד, ליגנד תהליכי ההמרה.

<table><tbody><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Chem Impex</td> <td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בייסי דיהידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>מים דה-יואיניזציה לביולוגיה מולקולרית</td><td>Millipore</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>מסנני מזרק סטריליים 0.2 מיקרון</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>מסננים צנטריפוגליים 3 kDa</td><td></td> צינורות דיאליזה <td>Millipore</td> UFC900324 <td></td></tr><tr><td>0.5-1.0 kDa ניתוק</td><td>מעבדות ספקטרום</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td>צינורות סיליקון</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>מכסי אוגן DSC מפלסטיק</td><td>TA Instruments 6111</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA aptamer MN4</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>קוקאין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>כינין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>NanoDSC-III מיקרוקלורימטר</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr> <tr><td>DSCRun software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת</td><td>NanoAnalyse TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr> <tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת למערכות ביולוגיות dsc פרופילים עם thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

דיפרנציאלית סריקה calorimetry (DSC) היא טכניקה חזקה לכימות תנועת תרמודינמי פרמטרים הנוגעים למערכות ביולוגיות קיפול ואינטראקציות מחייב. מידע זה חיוני בעיצוב של תרכובות פרמצבטיות חדש. אולם, רבים ליגנדים הרלוונטיים הם הם לא יציב מבחינה כימית בטמפרטורות גבוהות בשימוש DSC ניתוחים. לפיכך, מדידת אינטראקציות מחייב הוא מאתגר כי הריכוזים של ליגנדים ומוצרים המרה תרמית משתנים ללא הרף בתוך התא קלורימטר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול באמצעות ליגנדים thermolabile ו DSC להשגת במהירות מידע תרמודינמי קינטי קיפול, האיגוד, לבין ליגנד תהליכי ההמרה. אנחנו החלת שיטת שלנו aptamer ה-DNA MN4 המאגד הקוקאין ליגנד thermolabile. באמצעות ניתוח כללי התאמה חדשים that חשבונות for ליגנד thermolabile ההמרה, הערכה המלאה של קיפול ופרמטרים איגוד מתקבלים מן זוג ניסויים DSC. בנוסף, נראה כי ניתן להשיג את קצב קבוע עבור המרה ליגנד thermolabile עם dataset DSC משלים אחד בלבד. ההנחיות לזיהוי וניתוח נתונים של מספר תרחישים יותר מסובך מוצגים, כולל צבירת בלתי הפיך של biomolecule, קיפול איטי, איגוד איטי, דלדול מהירה ליגנד thermolabile.

נציג נתונים עבור DSC ליגנד thermolabile מוצגים באיור1. המיקום ואת גובה הפסגה מאוגד-ליגנד thermolabile במרוכז משמרות לכיוון של biomolecule לא מאוגד כמו ליגנד thermolabile תיגמר עם כל סריקה (איור 1 א'). הפרופיל דנטורציה חינם משמש כייחוס עבור נקודת הקצה של ליגנד thermolabile המרה (איור 1b). נתונים עבור MN4 חייב כינין מוצגים כפקד שלילי לגיור ליגנד thermolabile (איור 1b). הסר...

אנו מציגים פרוטוקול פלואורסנציה למערכות ביולוגיות קיפול ואיגוד אינטראקציות עם thermolabile ליגנדים שימוש דיפרנציאלי calorimetry סריקה מהירה.

מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא להפיק את הפרמטרים התרמודינמיים השולטים בקיפול ביו-מולקולרי ובאינטראקציות קישור באמצעות קלורימטריית סריקה דיפרנציאלית, או DSC, תוך שימוש בליגנד תרמו-לבילי בשני ניסויים בלבד. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הביו-קלורימטריה ועיצוב התרופות, כגון מהם הגדלים היחסיים של הפרמטרים התרמודינמיים השולטים באינטראקציות בין ביו-מולקולות לבין מעכבים בעלי קישור חזק? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שטיטרציה מלאה של הליגנד מבוצעת בניסוי בודד, מה שמאפשר הפקה מהירה של פרמטרים תרמודינמיים מניתוח התאמה גלובלי.בתחילה, הכינו תמיסות בופר לדיאליזה של הביומולקולה המטוהרת אל תוך תמיסת ליגנדים. בצעו דיאליזה של הביומולקולה כנגד לפחות ליטר אחד של בופר באמצעות שקיק דיאליזה עם Cutoff של 0.5 עד 1.7 kilodalton. השלב החשוב ביותר להשגת נתוני DSC באיכות גבוהה הוא דיאליזה של ליגנד הביומולקולה כנגד הבופר הרצוי.פעולה זו מבטיחה כי לא יופיעו בנתוני ה-DSC ארטיפקטים הנובעים מחוסר התאמה של הבאפר. סננו את הבאפר הסופי, המכונה באפר עבודה, באמצעות מסנן 0.2 מיקרון שהושגה בו שיווי משקל מלא עם הבאפר. שקלו את המסה הרצויה של הליגנדים והמיסו אותם בבאפר עבודה מסונן.אם ריכוזי הליגנד הרצויים דורשים מסות קטנות מדי כדי לשקול אותן במדויק, הכינו תמיסת סטוק מרוכזת של הליגנד. סננו את תמיסת הסטוק ש

measuring-biomolecular-dsc-profiles-with-thermolabile-ligands-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול כללי לשימוש calorimetry טיטרציה מקורר באופן איזוטרמי לפקח על התרמודינמיקה מחייב עבור מערכות ביולוגיות עם זיקות מחייבות מתונה מוצג.

טיטרציה Calorimetry מקורר באופן איזוטרמי עבור מדידת מקרומולקולה-ליגנד זיקה

סרטון זה מדגים קלורימטריה של סריקה דיפרנציאלית — טכניקה לחקר האינטראקציה בין ביומולקולה לליגנד. הקישור של אפטמר DNA וליגנד תרמולבילי נחקר על ידי החלת מחזורי חימום וקירור חוזרים ונשנים על הדגימה וקבלת סריקות לאנליזה תרמודינמית.

סריקה דיפרנציאלית קלורימטריה לחקר DNA Aptamer-Thermolabile Ligand אינטראקציה

thermophoresis microscale (MST) יכול להיות בשימוש נרחב לקביעת זיקה מחייבת ללא טיהור של חלבון המטרה מlysates התא. הפרוטוקול כולל ביטוי יתר של החלבון ה-GFP-התמזגו, תמוגה תא שבאינו denaturing תנאים, וזיהוי של אות MST בנוכחות ריכוזים שונים של ליגנד.

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

פלואורימטריית סריקה דיפרנציאלית היא שיטה בשימוש נרחב לסינון ספריות של מולקולות קטנות לאינטראקציות עם חלבונים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה להרחבת ניתוחים אלה כדי לספק אומדן של קבוע הדיסוציאציה בין מולקולה קטנה לשותף החלבון שלה.

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

סריקת calorimetry דיפרנציאלי המודד את טמפרטורת מעבר התרמית (ים) ו אנרגית חום כוללת הנדרשת כדי לפגל חלבון. תוצאות שהתקבלו משמשות כדי להעריך את יציבות התרמית של אנטיגנים חלבון בניסוחי חיסון.

Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול על ההפקה ועל טיהור של חלבונים עם התווית עם איזוטופים יציבים, ואפיון עוקבות של אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה ו- MicroScale ניסויים Thermophoresis (MST).

מדידת אינטראקציות של חלבונים הכדוריים, Filamentous על ידי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) Microscale Thermophoresis (MST)

תרמופורזה מיקרומטרית מקבלת קבועי כריכה במהירות בעלות חומר נמוכה. תרמופורזה מיקרו-קשקשית ללא תווית או תווית זמינה מסחרית; עם זאת, תווית תרמופורזה חינם אינו מסוגל מגוון של מדידות אינטראקציה שניתן לבצע באמצעות תוויות פלואורסצנטיות. אנו מספקים פרוטוקול למדידות תרמופורזה מתויגות.

שימוש בתרמופורזה מיקרומטרית למדידת אינטראקציות בין חלבון לליפיד

ניטור שינויים בטמפרטורת ההיתוך של חלבון יעד (כלומר,בדיקת משמרות תרמית, TSA) היא שיטה יעילה לבדיקת ספריות שברים של כמה מאות תרכובות. אנו מציגים פרוטוקול TSA המיישם פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית בסיוע רובוטיקה (nano-DSF) לניטור פלואורסצנטיות טריפטופן מהותית ופיזור גב אור להקרנת שברים.

פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית להקרנה בתגלית עופרת מבוססת שבר

פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית לזיהוי הקישור בין תרכובות ומולקולות חלבון, ומציע את היתרונות של אובדן דגימת חלבון מינימלי ודיוק נתונים גבוה.

זיהוי אינטראקציה של חלבון-אומבליפרון CD40 באמצעות פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית

כאן, אנו מציגים את מבחן השינוי התרמי, טכניקה מבוססת פלואורסצנטיות בעלת תפוקה גבוהה המשמשת לחקר הקישור של מולקולות קטנות לחלבונים בעלי עניין.

שימוש בבדיקת הזזה תרמית לבדיקת קשירת מצע לסלנופרוטאין O

למד איך לחלץ פרמטרים תרמודינמיים של קיפול ואיגוד ביומולקולרי באמצעות DSC עם ליגנדים תרמולאביליים. שיטה זו מאפשרת ניתוח מהיר לעיצוב תרופות וביוקלורימטריה.

מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

גלה סרטונים נוספים