מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

אנו מציגים פרוטוקול פלואורסנציה למערכות ביולוגיות קיפול ואיגוד אינטראקציות עם thermolabile ליגנדים שימוש דיפרנציאלי calorimetry סריקה מהירה.

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לחלץ את הפרמטרים התרמודינמיים השולטים באינטראקציות קיפול וקשירה ביו-מולקולריות על ידי קלורימטריית סריקה דיפרנציאלית, או DSC, באמצעות ליגנד תרמו-לאביל בשני ניסויים בלבד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביוקלורימטריה ותכנון תרופות, כגון מהם הגדלים היחסיים של הפרמטרים התרמודינמיים השולטים באינטראקציות בין ביומולקולות ומעכבי קשירה הדוקים? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שטיטרציה מלאה של ליגנד מבוצעת בניסוי יחיד המאפשר מיצוי מהיר של פרמטרים תרמודינמיים מניתוח ההתאמה הגלובלית.

כדי להתחיל, הכינו מאגרים לדיאליזה של הביו-מולקולה המטוהרת לתמיסה של ליגנדים. דיאליזה של הביו-מולקולה כנגד לפחות ליטר אחד של חיץ באמצעות צינורות דיאליזה עם חתך של 0.5 עד 1.7 קילו-דלטון. השלב החשוב ביותר בהשגת נתוני DSC באיכות גבוהה הוא דיאליזה של ליגנד הביו-מולקולה כנגד המאגר הרצוי.

זה מבטיח שאין חפצים לא תואמים של מאגר בנתוני DSC. סנן את המאגר הסופי המכונה מאגר העבודה דרך מסנן 0.2 מיקרון שאוזן היטב עם מאגר. שקלו את המסות הרצויות של הליגנדים והמיסו אותם במאגר עבודה מסונן.

אם ריכוזי הליגנדים הרצויים דורשים מסות קטנות מכדי לשקול במדויק, הכינו תמיסת מלאי ליגנד מרוכזת. סנן את תמיסת מלאי הביו-מולקולה דרך מסנן של 0.2 מיקרון שאוזן היטב עם מאגר עובד. לאחר מכן, קבע את ריכוז הביו-מולקולה על ידי מדידות ספיגה.

אחסן את הביו-מולקולה והליגנד המוכנים במקרר של ארבע מעלות צלזיוס או במינוס 20 או מינוס 80 מעלות צלזיוס אם הביו-מולקולה והליגנדים סובלים הקפאה ונדרש אחסון לטווח ארוך. הסר את המאגר על ידי מולקולה ותמיסות ליגנד במסיר גז על השולחן לפני הטעינה לתוך קלורימטר הסריקה הדיפרנציאלי, או DSC. נתק את ידית הלחץ מה- DSC.

לאחר מכן, הפעל צינורות סיליקון מהמאגר העובד והצמד אותו לאוגן הקדמי של נימי הייחוס. צור גשר בין הייחוס לנימים לדוגמה על ידי חיבור אוגן הייחוס האחורי לאוגן הפשוט הקדמי. לאחר מכן, חבר חתיכת צינור סיליקון לאוגן הדגימה האחורי שעובר לבקבוק פסולת עם קו ואקום מחובר.

הפעל את קו הוואקום כדי לשטוף את ה- DSC עם 200 מיליליטר של מאגר עבודה. התחל בהצמדת קטעים של כשלושה עד חמישה סנטימטרים של צינורות סיליקון לאוגני נימי הייחוס. לאחר מכן, הכנס קצה פיפטה של מיליליטר אחד לצינור הסיליקון של האוגן האחורי.

משוך 0.8 מיליליטר של מאגר עבודה עם פיפטה והכנס את קצה הפיפטה עם המאגר לתוך צינור הסיליקון של אוגן הייחוס הקדמי. לחץ בעדינות על בוכנת הפיפטה כלפי מטה כדי להעביר את המאגר העובד דרך צינור הסיליקון הקדמי לתוך נימי הייחוס ולמעלה לקצה הפיפטה המצורף של האוגן האחורי. לחץ על בוכנת הפיפטה כלפי מטה עד שרמת החיץ העובדת תגיע ממש מעל צינור הסיליקון הקדמי, ולאחר מכן שחרר את בוכנת הפיפטה עד שרמת החיץ העובדת תגיע ממש מעל צינור הסיליקון האחורי.

המשך להעביר את מאגר העבודה קדימה ואחורה בנימי הייחוס כדי לטהר את נפח הבועות. לאחר מכן, כסו את קצה הפיפטה האחורית באצבע המורה ומשכו בעדינות כלפי מעלה את קצה הפיפטה האחורית ואת הפיפטה הקדמית כדי להסיר אותם מאוגני הייחוס כשצינור הסיליקון מחובר. טען את נימי הדגימה עם מאגר עובד כמו קודם.

הנח מכסה פלסטיק שחור על אוגני דגימת הייחוס האחוריים והשאיר את האוגנים הקדמיים חשופים. חבר את ידית הלחץ ל-DSC ולאחר מכן פתח את תוכנת DSC ולחץ על המכשיר על ידי לחיצה על החץ האדום למעלה בחלק העליון של הממשק לאחר שקריאת הכוח התייצבה. הספק ה-DSC מצוין בתיבה בפינה השמאלית העליונה של הממשק יחד עם קריאת הטמפרטורה והלחץ של המכשיר.

אזן את ה-DSC עם מאגר עבודה על ידי ביצוע סריקה קדימה ואחורה בכרטיסיית השיטה הניסיונית בצד שמאל של המסך. ודא שאפשרות הסריקה נבחרה להפעלת מצב סריקת DSC וטמפרטורה. בפרמטרי הטמפרטורה המוכנסים תחת לשונית השיטה הניסיונית, לחץ על כפתור החימום.

הזן 1 ו-100 מעלות צלזיוס עבור טמפרטורות הניסוי התחתונות והעליונות, מעלה צלזיוס אחת לדקה עבור קצב הסריקה ו-60 שניות עבור תקופת שיווי המשקל. לחץ על כפתור AddSeries מתחת לשדה הקלט עבור תקופת שיווי המשקל. הזן שניים בשלבים להוספה בחלון המוקפץ וסמן את התיבה חימום/קירור חלופי

לחץ על OK. הסריקות שנוספו מופיעות בחלק התחתון של הממשק. בדוק שהפרמטרים עבור כל סריקה הם כרצונך. התחל את הניסוי על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה הירוק בחלק העליון של הממשק.

נווט לחלון הרצוי והזן שם קובץ לשמירת הניסוי בחלון המוקפץ. הצג את התקדמות הניסוי על ידי לחיצה על לשונית הנתונים מימין לכרטיסיית שיטת הניסוי. הפעל ניסויי ייחוס לחיסור בסיסי של נתוני הדגימה על ידי טעינה מחדש של ה-DSC עם מאגר עבודה בשני הנימים.

אסוף מספר סריקות קדימה ואחורה בטווח טמפרטורות מתאים במעלה צלזיוס אחת לדקה עם זמן שיווי משקל של 120 שניות. מחק את סריקות שיווי המשקל הקודמות מהחלק התחתון של הממשק על ידי הדגשת כל אחת בנפרד ולחיצה על ה-X האדום בפינה השמאלית האמצעית של הממשק. הוסף את הסריקות החדשות על ידי לחיצה על כפתור AddSeries, הזנת 20 בשדה לשלבים להוספה וסימון תיבת חימום/קירור חלופי

לאחר מכן, לחץ על אישור והפעל את הניסוי על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה הירוק כמו קודם. חזור על שלבים אלה עם מאגר עבודה המכיל את הריכוז הרצוי של ליגנד בשני הנימים כדי להשיג את ניסויי הייחוס עבור הליגנד. אסוף שני ניסויים נפרדים שישמשו ברכישת קבוע הקצב להמרה תרמו-לבילית.

עבור מערך הנתונים של הביו-מולקולה החופשית, ודא שנימי הייחוס מכילים את מאגר העבודה ואילו נימי הדגימה מכילים את הביו-מולקולה החופשית בריכוז הרצוי במאגר העבודה. לאחר מכן, הפעל את הניסויים לדוגמה באמצעות אותו נוהל טעינת DSC ופרמטרים ניסיוניים המשמשים בסריקות הייחוס. עבור הניסויים הקשורים לליגנד, ודא שהליגנד נמצא במאגר העבודה ונימי הייחוס והביו-מולקולה בתוספת ליגנד נמצאים במאגר העבודה בנימי הדגימה.

שטפו את המערכת בין תוספות של ליגנדים שונים כמו קודם. בצע ניסוי נוסף אחד עם הביו-מולקולה הקשורה לליגנד התרמו-לאביל שבו תקופת שיווי המשקל בטמפרטורה גבוהה מוגברת ל-600 שניות וכל שאר הפרמטרים הניסיוניים זהים לקודם. המשך לעיבוד וניתוח הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

המיקום והגובה של שיא הליגנד הקשור התרמו-לאביל נעים ברציפות כלפי מטה לכיוון זה של המולקולה הלא קשורה כאשר הליגנד התרמו-לאביל מתרוקן עם כל סריקה. פרופיל ההתבגרות התלת מימדית משמש כהתייחסות לנקודת הקצה של המרת ליגנד תרמו-לבילית. הגדלת תקופת שיווי המשקל בטמפרטורה גבוהה מניבה הפחתות בולטות יותר של ריכוז הליגנד התרמו-לאביל בכל סריקה ביחס למערך הנתונים של תקופת שיווי המשקל הקצרה.

באמצעות פרמטרי ריכוז ההתאמה הגלובלית האופטימליים משני מערכי הנתונים, ניתן לחשב את קבוע הקצב להמרת ליגנד בטמפרטורת שיווי המשקל הגבוהה. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך 72 שעות אם היא מבוצעת כראוי. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור לנקות גם את הליגנד הביו-מולקולי כדי לטהר את נימי ה-DSC מבועות באמצעות פיפטת הטעינה כדי למנוע חפצי נתונים.

לאחר צפייה בסרטון זה וקריאת המאמר, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע ניסויי DSC על ביומולקולות וכן יישום ניתוחי התאמה גלובליים על מנת לחלץ במהירות פרמטרים תרמודינמיים השולטים באינטראקציות קיפול וקשירה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציות קשירה של קיפול שיווי משקל, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון ביומולקולות המציגות קינטיקה של קיפול איטי ו/או קשירת ליגנד.