ניתוח אוטומטי של אוכלוסיה מבוססת נמטודות מבוססי Assay העדפה

המטרה הכוללת של הגדרת הקלטת התנהגות ופרוטוקול זה היא לכמת את ההעדפה הכימו-חושית מבוססת האוכלוסייה של C Elegans לתרכובות מסיסות באמצעות מערכת רכישת וידאו מרובת מצלמות, ואחריה ניתוח וידאו אוטומטי. שיטה זו יכולה להקל על מחקר הנוירוביולוגיה של C Elegans על ידי מתן אפשרות לניתוח התנהגותי מהיר וסטנדרטי יותר של מוטציות גנטיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבחון שכפולים מרובים בו זמנית בתנאים זהים תוך ניטור הדינמיקה הזמנית של תגובת אוכלוסיית הנמטודות לרמזים מסיסים.

שידגים את מכלול תא ההתנהגות יהיה כריסטופר קרונין, מדען צוות מהמעבדה הזו. כדי להתחיל, הכינו את כיסויי הבד, מוטות הרכבה למצלמה, סוגריים פינתיים, מוטות שחול ומכלול תושבת המצלמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. החל מפסי הקצה המחוברים לסרגל המרכזי, חבר את מעמד המצלמה והנרתיקים למכלול תושבת המצלמה.

לאחר מכן, הרכיבו את מסגרת תא ההתנהגות. התחל בחיבור ארבעה מוטות אלומיניום שחול ברגל אחת ליריעת פוליאסטר מרובעת. החלק מוט אחד על שני אגוזי ה- T של אומני יריעת הבד, במרכז המוט לאורך רוחב הבד.

הדק את המחברים כדי להדק את יריעת הבד לכל מוט. מורחים את יריעת הפוליאסטר המרובעת על משטח העבודה עם ארבעת מוטות האלומיניום המחוברים מעל. לאחר מכן, החלק שמונה סוגריים פינתיים על המשטחים העליונים של ארבעת מוטות האלומיניום, אחד בכל קצה של כל מוט.

מקם את סוגרי הפינה על הסורגים כשהרגליים האנכיות של התושבת סמוקות עם קצה הסורגים ואבטח אותם למקומם על ידי הידוק הברגים לתוך אגוזי ה-T. בכל פינה, עמדו שחול אלומיניום של רגל אחת זקופה, והחליקו את האקסטרוזיה מעל אגוזי ה-T בשתי רגלי התושבת הפינתית. לאחר מכן, אבטח את המוט הזקוף לסורגים האופקיים על ידי הידוק המחברים, ובכך הצטרף לשני הסורגים האופקיים הסמוכים.

החלק את אגוזי ה-T הרופפים של מכלול תושבת המצלמה בצורת H כלפי מטה לתוך זקפי המסגרת. הניחו ל-H להחליק עד הסוף כדי לנוח על גבי סוגרי הפינה בכל פינה של המסגרת. אבטח את מכלול תושבת המצלמה במקומו, על ידי הידוק ארבעת ברגי התושבת הפינתית.

לאחר מכן, השתמש בארבעת מוטות האלומיניום האחרונים של מטר אחד כדי להרכיב את השכבה התחתונה של החדר. מקם את תושבות הפינה כשרגלי הסוגריים סמוקות עם קצה המוט והדק את הברגים כדי לאבטח אותו במקומו. לאחר מכן, החלק את הסורגים כלפי מטה בין זקפי המסגרת עם אגוזי ה-T הרופפים בתעלות הזקופות.

מקם את המוט כך שהקצוות העליונים של תושבות הפינה שלהם יהיו סנטימטר אחד מתחת לקצה הפתוח של הזקפים ואבטח במקומם על ידי הידוק ברגי התושבת הפינתית. לאחר מכן, החלק את אגוזי ה-T של ארבעת יריעות הפוליאסטר המלבניות כלפי מטה לתוך התעלות של מוטות השחול הזקופים כדי לכסות את דפנות החדר ולהדק את המחברים כדי לאבטח אותם במקומם. בחר צד אחד שיהווה דלת לגישה לחלק הפנימי של החדר והסר את שני הברגים ואומי ה- T בשכבה התחתונה של החדר.

הניחו מכסה פלסטיק בקצה העליון של כל פינה כדי לשמש כרגליים למסגרת שהושלמה. סובב את המסגרת בצד ימין כלפי מעלה והכנס שני מחזיקי פאנל לכל שקופית בתוך שכבת שטח המסגרת, וסובב כדי לאבטח אותם במקומם. לאחר מכן, הנח חתיכת אקריליק שקופה בגודל 12 על 12 אינץ' על גבי מחזיקי הפאנל כדי לספק במה ללוחות הבדיקה.

לבסוף, מקם את המצלמה ואת תבנית הבמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. יום לפני הניסוי, הניחו 28 צלחות ריקות של 35 מילימטר בערימות של חמישה או פחות על משטח ישר. מלאו כל צלחת בדיקה בחמישה מיליליטר של אגר מצע גידול נמטודות והשאירו את צלחות הבדיקה להתייבש זקוף עם מכסים כבויים, למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

ביום הניסוי, הפעל את התאורה האחורית, אתחל את המחשב והפעל את תוכנת לכידת הווידאו של מצלמת המיקרוסקופ. חבר את מצלמת המיקרוסקופ למחשב ולחץ על התמונה הממוזערת של המצלמה הממוספרת בחלק העליון של חלון התוכנה כדי view ההזנה החיה של המצלמה. כדי להתאים את הגדרות הקלטת הווידאו, משוך כלפי מטה את תפריט פורמט הווידאו בפינה השמאלית העליונה של הזנת המצלמה ובחר MJPG 1280x1024.

לאחר מכן, משוך כלפי מטה את תפריט התיקיות שליד תפריט פורמט הווידאו, ובחר תיקיה בה ניתן לשמור את קבצי הווידאו. לחץ על סמל החשיפה האוטומטית בפינה השמאלית העליונה של הזנת המצלמה וכבה את החשיפה האוטומטית. לאחר מכן, לחץ על סמל ה-LED מימין לסמל החשיפה האוטומטית כדי לכבות את נוריות מצלמת המיקרוסקופ המובנות.

לחץ על סמל ההגדרות הסמוך ובחר, מונוכרום. הגדילו את הניגודיות והתאימו את הבהירות. יישר תבנית מיקום פתרון על גבי תבנית יישור לוחית הבמה ולחץ על סמל הקלטת הווידאו בהילוך מהיר בצד שמאל של הזנת המצלמה.

הזן חמש שניות עבור משך ושנייה אחת עבור המרווח כדי להקליט סרטון כיול של חמש שניות בפריים אחד לשנייה. השתמש בפיפטה מזכוכית של חמישה מיליליטר כדי להוסיף 1.2 מיליליטר של מאגר מצע גידול נמטודות לצלחת של תולעים מסונכרנות ולערבב בעדינות את הצלחת כדי לעקור את התולעים לתוך המאגר. פיפטו את המאגר מהצלחת והפיצו תולעים במאגר לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה נקי.

הניחו לצינורות לעמוד דקה עד שתיים כדי לאפשר לתולעים להתיישב לתחתית. לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה מפלסטיק כדי להסיר כמה שיותר מאגר כביסה מהצינורות מבלי להפריע לגלולה של תולעים מצטברות בתחתית הצינורות. מלאו מחדש את הצינור במיליליטר אחד של מאגר אמצעי גידול נמטודות נקי וחזרו על הליך הכביסה פעמיים נוספות.

לאחר מכן, הדביקו תבנית מיקום תמיסה על גבי השלב של מיקרוסקופ מנתח. לאחר מכן, הנח רצועת סרט דו צדדי משני צידי תבנית יישור צלחת. יישר את היקף לוחית הבדיקה עם העיגול בתבנית יישור הצלחת ולחץ כלפי מטה עד שהתבנית נדבקת לתחתית הצלחת.

לאחר מכן, יישר את סמני איבר תבנית לוחית הבדיקה עם סמני איבר תבנית מיקום הפתרון במיקרוסקופ הניתוח. לאחר מכן, השתמש בפיפטה P2 כדי למקם מיקרוליטר אחד של מאגר M13, כל אחד ברבעים אחד וארבע. השתמש בקצה חדש כדי למקם מיקרוליטר אחד של תמיסת CuCl2 של 10 מילי-מולרית כל אחד לרבעים שניים ושלושה.

השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להעביר את התולעים השטופות לצלחות הבדיקה לאחר שטיפות התמיסה נספגו לחלוטין באגר. הניחו טיפת תולעים על האזורים שמעל ומתחת לאזורים המטופלים המעגליים. קפלו את הטישו ארבע פעמים והשתמשו בקצה הקהה כדי לספוג עודפי מאגר כביסה על לוחות הבדיקה.

סדר מיד את לוחות הבדיקה מתחת למצלמות המיקרוסקופ בתא ההתנהגות על ידי יישור המספרים של פינות התבנית. המתן שתיים-שלוש דקות כדי לאפשר לתולעים להתאקלם ללוחות הבדיקה. לאחר מכן, לחץ על סמל הקלטת הווידאו Timelapse בצד שמאל של הזנת המצלמה והזן 10 דקות למשך ושנייה אחת למרווח כדי להקליט סרטון של 10 דקות של פריים אחד לשנייה.

לבסוף, לחץ על התחל, כדי להתחיל בהקלטת וידאו. עבור כל פריים וידאו, פונקציית מדד ההעדפות סופרת את מספר פיקסלי התולעת בכל אזור עניין ומחשבת את האחוז של פיקסל אחד מתוך המספר הכולל של פיקסלים באזור העניין. ערכי מדד ההעדפה המתקבלים עבור זיווגים שונים של גנוטיפ וטיפול מוצגים כאן.

ערך מדד העדפה חיובי מצביע על משיכה לטיפול ואילו ערך מדד העדפה שלילי מצביע על דחייה. מדד העדפה של 0.02 מתקבל כאשר פתרון החיץ M13 הוצב הן באזורי הבקרה והן באזורי הניסוי, מה שמדגים שאין הטיה מרחבית. גרף זה מראה גם שתולעי N2 נמנעו מאוד מיוני הנחושת, וכתוצאה מכך מדד העדפה של 0.67.

בנוסף, osm-3, שהם פגומים בהיווצרות ריסונים חושיים, ומוטציות ocr-2 הפגומים בתגובות נוסיספטיביות בתיווך ASH הראו הימנעות מופחתת ואפילו משיכה קלה ליוני נחושת. בזמן ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לעבוד מהר אך גם בצורה חלקה ועקבית. ניתן להתאים בקלות את מערך ההקלטה ופרוטוקול הבדיקה כדי לאפיין תגובות התנהגותיות מבוססות אוכלוסייה הנובעות מהאינטראקציות בין זנים חושיים שונים של C Elegans.