הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי
15 באוגוסט 2017
מאמר זה מדגים כיצד תרבות תודרנית לבנה השתילים בשטח פלטפורמה דו שכבתי microfluidic מגבילה את הבסיס העיקרי ואת שערות השורש למישור אופטי יחיד. פלטפורמה זו יכולה לשמש עבור הדמיה אופטית בזמן אמת מורפולוגיה שורש בסדר גם באשר דימות ברזולוציה של באמצעים אחרים.
המטרה הכוללת של שיטת גידול מיקרופלואידית זו היא לגדל צמחים ישירות מזרע בסביבה מובנית שיכולה לשמש גם לטיפול מבוקר והדמיה ברזולוציה גבוהה של שורשי השתילים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הצמח כגון, כיצד צמיחת שורשי הצמח מגיבה לרמזים פיזיקליים וכימיים בקנה מידה מרובה אורך. היתרון העיקרי של פלטפורמה זו הוא שהתיקונים מוגבלים למישור אחד, מה שהופך את זה לבלתי אפשרי לטפל ולצלם אותם מבלי לאבד את המיקוד האופטי.
מי שתסייע לי היום תהיה ד"ר סהר חסים, היא פרופסור חבר מחקר באוניברסיטת טנסי. כדי להתחיל, שפכו יחס של 10:1 של PDMS לחומר ריפוי על פרוסת מאסטר מוכנה מראש וסלניזציה. הסירו את ה-PDMS בתא ואקום ולאחר מכן, רפאו את הפולימר בתנור בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך שעה.
לאחר מכן, השתמש באזמל כדי לחתוך את מכשירי ה- PDMS ולקלף אותם מהמאסטר. לאחר מכן, השתמש בביופסיה של 1.5 מיליליטר כדי לנקב את כניסת הזרעים בזווית של 45 מעלות, כדי לעודד צמיחת שורשים לתעלה הראשית. כמו כן, השתמש באותו אגרוף כדי לנקות את כניסות הטיפול.
השתמש בסרט דבק כדי להסיר כל פסולת מהמכשיר והנח אותו עם הצד המעוצב כלפי מטה על שקופית כיסוי זכוכית. לאחר ההרכבה, חיטוי המכשירים. מניחים את זרעי Arabidopsis thaliana בצינור מיקרופוגה ומוסיפים תערובת של אקונומיקה וחומר ניקוי כדי לעקר את הזרעים.
לאחר מכן, שטפו את הזרעים ארבע פעמים במים סטריליים. לאחר מכן, שכבו את הזרעים על ידי קירורם בצינור המיקרופוגה למשך הלילה או אחסנו אותם עד שבוע בארבע מעלות צלזיוס. לפני השימוש במכשירים הסטריליים, הנח אותם בתא הסרת גז ואקום, כדי להוציא אוויר מה-PDMS החדיר לגז ותעלות נוזליות.
זה ישפר את מילוי המכשירים שלאחר מכן. הוציאו את המכשירים מתא הוואקום וטבלו אותם מיד בצלחת פטרי מלאה בחומר צמחי נוזלי בעל רבע חוזק, ב-pH של 5.7. בעזרת פיפטה, משוך נוזל דרך הכניסות כדי למלא את המכשיר.
ודא שלא נותרו בועות אוויר בתוך התעלות על ידי בדיקה ויזואלית שלהן לפני העברתן לצלחות פטרי טריות ויבשות בודדות. לאחר מכן, שפכו אגר חם סביב המכשיר עד שמפלס האגר כמעט סומק עם החלק העליון של המכשיר. בסביבה סטרילית, השתמש בפיפטה קטנה והעביר זרע מעוקר אחד לכניסה של כל מכשיר.
לאחר מכן, מכסים כל צלחת פטרי בסרט שעווה ומניחים אותם בתא גידול אופניים כהה בהיר בטמפרטורת החדר. כוונו את צלחת הפטרי בתא הגידול בטמפרטורת החדר, אנכית, כך שכוח הכבידה יעודד את השורשים לצמוח דרך התעלה. בזמן הרצוי ובהתפתחות השתיל, השתמש בפיפטה כדי להוסיף כמות קבועה של הטיפול הניסיוני לכל אחת משמונה יציאות הצד במכשירים.
בסיום, אטמו מחדש את כלי הפטרי בניילון שעווה. לאחר מכן, החזירו אותם לתא הגידול. כוונן את ההגדלה של מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך, בהגדלה של פי 4 עד פי 20.
הנח את כל צלחת הפטרי המכילה את המכשיר והשתיל מתחת למיקרוסקופ להדמיית ניגודיות שדה בהיר או הפרעות דיפרנציאליות. מטב את תנאי התאורה על ידי התאמת זמני החשיפה, בהירות המנורה, הצמצם וקוטביות האור כדי להבהיר את המאפיינים המורפולוגיים המעניינים. לאחר מכן, הובילו את השלב לאזור הרצוי של השורש והתמקדו בשיער השורש או השורש המעניין.
רכוש נקודת זמן אחת או סדרת זמן של תמונות כדי לדמיין את צמיחת שערות השורש. עבור סדרת הזמן, דמיינו את שערות השורש הצומחות פעם בדקה. כדי לדמיין את צמיחת השורש הראשי, רכשו תמונה אחת כל 30 דקות.
בסיום, החזירו את צלחת הפטרי ואת השתילים לתא הגידול, במצב אנכי. לאחר שהשתיל גדל לזמן הרצוי, השתמש בזוג מלקחיים כדי להסיר את החלקת הכיסוי ואת המכשיר מהאגר. לאחר מכן, הרטיבו רקמת מעבדה באתנול והשתמשו בה כדי לנקות את החלק התחתון של החלקת הכיסוי.
מרחו את השמן המתאים על מטרת טבילת שמן פי 63 והניחו את החלקת הכיסוי על המיקרוסקופ stage. לאחר מכן, הרם את הבמה כדי ליצור קשר עם המדיה הטבולה במטרה. מטב את תנאי התאורה, על ידי התאמת זמני החשיפה, בהירות המנורה, הצמצם וקוטביות האור.
לאחר מכן, סעו את הבמה לאזור הרצוי של השורש והתמקדו בשערות השורש המעניינות. כדי לכמת את צמיחת שיער השורש לאורך זמן, הגדר את התוכנה לרכישת תמונה אחת לדקה, במיקום המעניין. על מנת לדמיין סמני פלואורסצנציה אוטומטיים או פלואורסצנטיים של צמחים, צמצם את זמן החשיפה לפלואורסצנטיות, תוך שמירה על אות פלואורסצנטי הניתן לזיהוי.
רכוש תמונות של האברונים במהירות שזמן החשיפה יאפשר. לאחר שהשתיל גדל למשך הזמן הרצוי, הסר את המכשיר ואת החלקת הכיסוי מצלחת הפטרי. הפוך את המכשיר וקילף בעדינות את החלקה כך שהשורש יישאר בתוך תעלת ה-PDMS.
הנח את מכשיר ה-PDMS על מצע רפלקטיבי שטוח, כגון, מצופה מיקרו בזהב, ולאחר מכן, התקן את המכשיר על מחזיק דגימת ה-AFM, כשצד השורש כלפי מעלה. לאחר אבטחת חיבור באר נוזלית על גבי מכשיר ה-PDMS, מלאו אותו במים כדי לשמור על לחות השורשים במהלך ההדמיה. לאחר טעינת הדגימה לתוך ה-AFM, כוונן את בקרת z לעובי התקן ה-PDMS והסיע את השלוחה לאזור העניין בשורש.
בעזרת מצלמה להדרכה, יישר את הלייזר עם קצה השלוחה והשתמש בהדמיית מצב מגע כדי להפעיל כוח מינימלי על השורש במהלך הסריקה. הורד לאט את מנגנון הסריקה עד שהשלוחה פשוט יוצרת מגע עם הדגימה. לאחר מכן, התאם את גודל הסריקה לאזור הרצוי ובחר מהירות סריקה של שורה אחת לשנייה עם 256 נקודות מתח לכל קו.
לבסוף, רכוש את הסריקה. למכשירים המיקרופלואידיים הדו-שכבתיים PDMS המתוארים כאן, יש תעלה מרכזית בגובה 200 מיקרומטר לשורש ה-Arabidopsis הראשי ושני תאים צדדיים בגובה 20 מיקרומטר, כדי להגביל את שערות השורש הצומחות לרוחב. זה מבטיח ששערות השורש נמצאות באותו מישור הדמיה, כמו השורש הראשי.
בתוך הפלטפורמה המיקרופלואידית, ניתן לכמת שערות שורש ברמה התאית, מבחינת אורכן, צפיפותן וזווית צמיחתן מהשורש. אחד היתרונות החזקים ביותר של שימוש בפלטפורמה מיקרופלואידית, הוא היכולת להוסיף באופן אחיד ריכוזים מדויקים של טיפולים כימיים לאורגניזמים. כאן, שתיל מצולם לפני ואחרי תוספת של חרוזי פוליסטירן קרבוקסנטיים פלואורסצנטיים.
הוספת טיפול אביוטי זה, לא שיבשה את כיוון המיקוד האופטי של שערות השורש של השתילים. באמצעות סמנים פלואורסצנטיים ניתן לראות זרימה ציטופלזמית בשערת שורש. התנועה של שלושת האברונים הללו נלכדת בתרשים התפלגות מצטבר זה.
בנוסף להדמיה אופטית, פלטפורמה זו מאפשרת גם הדמיית AFM ו-SEM, בשל יכולת הפירוק שלה, מבלי להפריע לשורש. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כולל הדמיה כימית, על מנת לענות על שאלות נוספות כמו איך נראים פרופילים כימיים סביב השורש.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים שיטה מיקרופלואידית לגידול שתילי Arabidopsis thaliana, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של מורפולוגיה של שורשים. הפלטפורמה מגבילה את השורשים למישור אופטי יחיד, מה שמאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של צמחים
- מיקרופלואידיקה
- מורפולוגיה של שורשים
רקע
- הבנת צמיחת השורשים של הצמח חיונית לביולוגיה של הצמח.
- פלטפורמות מיקרופלואידיות יכולות לספק סביבות מבוקרות למחקרים בצמחים.
- טכניקות הדמיה בזמן אמת משפרות את חקר תגובות השורשים.
- שיטה זו מתמודדת עם אתגרים בשמירת מיקוד אופטי במהלך הדמיה.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לגידול שתילים בסביבה מובנית.
- לאפשר טיפול מבוקר והדמיה של שורשי צמחים.
- לחקור את תגובות צמיחת השורשים לגירויים שונים.
שיטות ששימשו
- הכנת פלטפורמת מיקרופלואידית PDMS.
- הסרת אוויר מ-PDMS בתא ואקום.
- ריפוי הפולימר ב-70 מעלות צלזיוס.
- שימוש בפלטפורמה להדמיה בזמן אמת של שורשים.
תוצאות עיקריות
- הפלטפורמה מגבילה בהצלחה את השורשים למישור יחיד.
- הדמיה בזמן אמת מאפשרת תצפית מפורטת על מורפולוגיה של שורשים.
- השיטה תומכת בטכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה.
- היא מספקת תובנות לגבי תגובות השורשים לגירויים פיזיים וכימיים.
מסקנות
- פלטפורמה מיקרופלואידית זו היא כלי חשוב למחקר בביולוגיה של צמחים.
- היא משפרת את היכולת לחקור את הדינמיקה של צמיחת השורשים.
- השיטה יכולה להוביל לגילויים חדשים בתגובות הצמח לגורמים סביבתיים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This microfluidic platform enables high-resolution, real-time imaging of root hair morphology in Arabidopsis thaliana, providing a controlled environment for studying plant responses to chemical and physical stimuli. By confining roots to a single optical plane, it eliminates z-axis drift during treatment addition, ensuring consistent focus for quantitative analysis. The system supports downstream applications such as AFM and SEM while maintaining gnotobiotic conditions, offering a scalable tool for mechanistic de-risking in early-stage target validation for agrochemical or biostimulant discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying root hair length, density, and angular growth in response to exogenous compounds.
- Operational Value: Supports biological de-risking through precise, reproducible delivery of chemical treatments via side ports without disrupting optical focus.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking compound exposure to observable subcellular dynamics such as cytoplasmic streaming and organelle movement.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Provides a standardized, gnotobiotic platform for preparing validated biological systems suitable for compound screening workflows.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of root hair morphology at cellular and organelle levels, generating structured data for dose-response modeling.
- Platform Reuse: Allows disassembly and use as a substrate for AFM or SEM imaging, extending utility beyond live imaging to multi-modal analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains fine root structures intact after optical imaging, enabling correlation of in vivo-like responses with ex vivo chemical or mechanical profiling.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing quantitative, imaging-based endpoints for root morphology changes under treatment.
- Disease-Relevant System: Offers a disease-relevant model for studying root responses to abiotic stressors, relevant to seed treatment or soil health product development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing, assay standardization, and quantitative phenotypic readouts that inform lead identification and preclinical progression decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing root hair responses to chemical cues in a controlled microenvironment.
- Screening: Ensures assay readiness through reproducible device fabrication, sterile seeding, and uniform treatment delivery across multiple channels.
- Analytics: Generates quantitative data on root hair length, density, angularity, and organelle dynamics, enabling statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery-phase imaging to preclinical validation by preserving root integrity for downstream AFM/SEM or chemical imaging.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for iterative screening campaigns, reducing need for repeated device fabrication and supporting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in root response assays through high-resolution, time-lapse imaging.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized PDMS fabrication, vacuum degassing, and sterile seeding protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling multi-modal imaging (brightfield, DIC, fluorescence, AFM, SEM) from a single sample, reducing need for parallel workflows.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantifiable, imaging-based phenotypic data for early triage of bioactive compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, sterile plant handling, and microscopy techniques including brightfield, DIC, and fluorescence imaging.
- Depends on access to vacuum degassing chambers, ovens for PDMS curing, and inverted microscopes with oil immersion objectives.
- Necessitates cross-team standardization between plant biology, imaging, and analytics teams to ensure consistent device preparation and data interpretation.
- Adaptation considerations include adjusting channel dimensions for different plant species or root architectures while maintaining single-plane confinement.
- Practical limitations include the need for manual seed inoculation and potential clogging of side ports during viscous treatment delivery, as noted in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Two-layer Platform Fabrication
1:48
Arabidopsis thaliana Seed and Device Preparation
3:05
Planting of Arabidopsis thaliana Seeds into the Microfluidic Devices and Experimental Treatments
3:51
Low Magnification Imaging (4-20X)
4:55
High Magnification Imaging (63X)
6:11
Atomic Force Microscopy
7:32
Results: Arabidopsis thaliana Characterization in Multple Platforms
9:02
Conclusion
