Name: כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: למדו ספקטרוסקופיית כוח של מולקולת חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. שיטה זו מאפשרת למדוד יציבות חלבונים, שיעורי פרישה ומסלולי פרישה ברמת המולקולה הבודדת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית מענקים MCB-1244297 MCB-1517245 כדי PEM.

<ol><li>Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Unfolding+of+Individual+Titin+Immunoglobulin+Domains+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM.</a> Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).</li>
<li>Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+protein+mechanics+with+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The study of protein mechanics with the atomic force microscope.</a> Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).</li>
<li>Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0%2C22&q=Single+molecule+studies+of+protein+folding+by+atomic+force+microscopy&btnG=">Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM).</a> Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).</li>
<li>Rico, F., Chu, C., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRico%2C+F+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. 331-353 (2011).</li>
<li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).</li>
<li>Lv, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designed+biomaterials+to+mimic+the+mechanical+properties+of+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles.</a> Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanics+of+Streptavidin+Hubs+for+Molecular+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials.</a> Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).</li>
<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Adhesive+Hydrogels+from+Intrinsically+Unstructured+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins.</a> Advanced Materials. , (2017).</li>
<li>Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+unfolding+of+titin+under+force-clamp+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).</li>
<li>Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+Mechanical+Unfolding+Pathway+of+a+Large+Protein+with+Coiled-Coil+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).</li>
<li>Davis, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavis%2C+L+%22Basic+methods+in+molecular+biology%22">Basic methods in molecular biology</a>. , Elsevier. (2012).</li>
<li>Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.biomac.6b00548">A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy.</a> Biomacromolecules. , (2016).</li>
<li>Scholl, Z. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScholl%2C+ZN+%22The+%28Un%29+Folding+of+Multidomain+Proteins+Through+the+Lens+of+Single-molecule+Force-spectroscopy+and+Computer+Simulation%22">The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation</a>. , Duke University. (2016).</li>
<li>Pawlak, K., Strzelecki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopuller-open+data+acquisition+platform+for+AFM+force+spectroscopy+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments.</a> Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).</li>
<li>Nanopuller. , 
 <a target="_blank" href="https://sourceforge.net/projects/nanopuller/">https://sourceforge.net/projects/nanopuller/</a> (2018).</li>
<li>Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+single+molecule+force+spectroscopy+through+automated+real-time+data+collection+and+quantification+of+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions.</a> Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).</li>
<li>Bouchiat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+persistence+length+of+a+worm-like+chain+molecule+from+force-extension+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements.</a> Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).</li>
<li>Su, T., Purohit, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+forced+unfolding+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Mechanics of forced unfolding of proteins.</a> Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).</li>
<li>Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+cloning+system+for+construction+of+multimeric+proteins+for+use+in+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science%22%5BJournal%5D)">Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy.</a> Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).</li>
<li>Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular%2C+Nondegenerate+Polyprotein+Scaffolds+for+Atomic+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy.</a> Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).</li>
<li>Hoffmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+Robust+Polyprotein+Production+Facilitates+Single-Molecule+Mechanical+Characterization+of+%CE%B2-Barrel+Assembly+Machinery+Polypeptide+Transport+Associated+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22ACS%22%5BJournal%5D)">Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of β-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains.</a> ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory%2C+analysis%2C+and+interpretation+of+single-molecule+force+spectroscopy+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).</li>
<li>Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/biophysj/abstract/S0006-3495(13)03469-3">Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level.</a> Biophysical journal. 106 (2), 391a(2014).</li>
<li>Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+dynamics+in+the+unfolding+of+individual+bacteriorhodopsin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins.</a> Science. 355 (6328), 945-950 (2017).</li>
<li>Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+force+spectroscopy+unfolds+titin+at+the+velocity+of+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations.</a> Science. 342 (6159), 741-743 (2013).</li>
<li>He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+protein+conformations+by+single-molecule+AFM-FRET+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy.</a> ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).</li>
<li>Fotiadis, D., Scheuring, S., Müller, S. A., Engel, A., Müller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+manipulation+of+biological+structures+with+the+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Imaging and manipulation of biological structures with the AFM.</a> Micron. 33 (4), 385-397 (2002).</li>
<li>Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Spectroscopy+with+9-%CE%BCs+Resolution+and+Sub-pN+Stability+by+Tailoring+AFM+Cantilever+Geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry.</a> Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).</li>
<li>Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+kinetics+from+single-molecule+force+spectroscopy%3A+Nanopore+unzipping+of+DNA+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins.</a> Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).</li>
<li>Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+Force+Spectroscopy+Reveals+the+Calcium+Dependence+of+the+Alternative+Conformations+in+the+Native+State+of+a+%CE%B2%CE%B3-Crystallin+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a βγ-Crystallin Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

שלב קריטי בפרוטוקול הוא השימוש polyprotein, שמתואר בשלב 1.1.2, אשר משמש פקד חיובי כדי "טביעות אצבע" אירועים מולקולה בודדת. באופן כללי, יש חייב להיות התגלגלות אירועים של החלבונים polyprotein (עבור I91, המשמעות היא כוח התגלגלות כ-200 pN, מתאר אורך קבועה של 28 ננומטר) למסקנה חד משמעית כי החלבון עניין כבר פרש. לדוגמה, כאשר החלבון עניין משני צדדיה שלושה תחומים I91 מכל צדדיו, אז חייב להיות לפחות ארבעה אירועים I91 להסיק כי הוא בהחלט אירוע יחיד מולקולה. אם לא פקד חיובית דרך של polyprotein, או אמצעים אחרים, אז כל הנתונים הם עלולי...

ההתקדמות ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת (SMFS) על ידי AFM אפשרו במחרוזות מכני, אפיון מדויק של מולקולות חלבון יחיד. אפיון זה הפיק הרומן תובנות על חלבון מכניקה1,2, קיפול3, אינטראקציות חלבון-ליגנד4, אינטראקציות חלבון-חלבון5, החלבון ומתוכננים מבוססי חלבונים חומרים6,7,8. SMFS שימושית במיוחד עבור לימוד חלבון התגלגלות, כמו מתיחה על ידי AFM מאפשרת את הקשר הכימי והפיזי בתוך מולקולת חלבון להרחיב בהדרגה על פי שלהם נוקשות, אשר נותן לעלות באורך מתאר גדל ללא הרף. זו מתיחת של מולקולה חלבון יכול לייצר מעבר פתאומי בתוך עקומת כוח-סיומת וכתוצאה אירוע קרע (או לאלץ את שיא). הפסגה כוח נותן מידע ישיר על השינוי כוח מבניים התגלגלות של החלבון במהלך התגלגלות תהליך מכני. אחד המחקרים הראשונים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי נמדד titin1 ומצאו היבטים חדשניים של חלבון התגלגלות, refolding בתנאים פיזיולוגיים ללא שימוש denaturants לא טבעיים כמו כימיקלים מרוכזים או טמפרטורות קיצוניות.
SMFS הניסויים נערכים על מגוון מכשירים, אך כאן אנו רואים רק AFM. AFM מורכב ארבעה מרכיבים עיקריים: החללית, הגלאי, המחזיק לדוגמה, הסורק פיזואלקטריים. המכשיר הוא קצה חד על קצה זיז שמתנדנדת חופשי. לאחר כיול, כיפוף הזיז בזמן מתיחות של מולקולה המצורפת נמדד באמצעות קרן לייזר זה משתקף מעל גבי הזיז במדויק לקבוע כוחות באמצעות חוק הוק. הפרויקטים קרן לייזר משתקף לתוך גלאי פוטודיודה רביע אשר מייצר מתח בפרופורציה העקירה של קרן הלייזר מהמרכז דיודה. המצע עם הדגימה החלבון בנוזל נטענה על שלב פיזואלקטריים 3D יכול להיות נשלט עם דיוק תת ננומטר. מחשב קורא את המתח מתוך גלאי פוטודיודה ופקדים השלב 3D דרך ספק מתח מבוקר-מחשב. אלה שלבים למפעיל piezo מצוידים בדרך כלל עם קיבולי או זן-מד חיישני מיקום בדיוק המידה piezo הזחה וכדי היסטרזיס הנכון באמצעות מערכת בקרת הזנה-בחזרה. הפלט אות חיישן של הבקר piezo מומר מרחק באמצעות מתח קבוע piezo זה לבצע כיול במפעל. מעגל הרחבת כוח דוגמה של ניסוי מושך מוצג באיור2.
ישנם שני סוגים של AFM-SMFS ניסויים: מהירות קבועה וכוח קבוע משיכת מדידות. מדידות SMFS כוח קבוע מתוארים Oberhauser. et al. 9, ואילו כאן נתמקד מדידות מהירות קבועה. טיפוסי AFM מהירות קבועה מושך ניסוי נעשית על-ידי אספקת מתח piezo להעביר בעדינות מצע ביחס טיפ זיז. ניסוי טיפוסי כולל הטיפ בהתחלה לוחצת כנגד פני השטח. המדידה מושך הוא התחיל על ידי הזזת את המצע מן העצה להביא איתו קשר. אם חלבון בא במגע עם הטיפ בתחילה, זה ששולפים, נמדד המעקב התגלגלות בכוח נגד העקירה. המצע ואז מובאת בחזרה במגע עם הטיפ, עקבות מרגיעה נמדד איפה קיפול חלבונים יכול להיקבע מתוך העקירה כוח.

<table><tbody><tr><td>דיסקי דגימה של AFM, קוטר 15 מ"מ</td><td>טד פלה, בע"מ.</td><td>16218</td><td>משמש כבסיס למצע זכוכית</td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית עגולים, קוטר 15 מ"מ מס' 1 עבה</td><td>טד פלה, בע"מ.</td><td>26024</td><td>משמשים כמצע זכוכית ובסיס לציפוי זהב</td></tr><tr><td>טבליות דבק</td><td>טד פלה, בע"מ.</td><td>16079</td><td>הדבק על דיסקי דגימת AFM כדי לספק פנים דביקות לחיבור כיסויי זכוכית</td></tr><tr><td>STD מכלול ראש Multimode</td><td>Bruker Nano Inc.</td><td>1B75C</td><td>AFM</td></tr><tr><td>ראש מחזיק בדיקה מזכוכית</td><td>Bruker Nano Inc.</td>מחזיק בדיקה מזכוכית <td>MTFML-V2</td><td>לסריקה נוזלית עם MultiMode AFM.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Microlever AFM חוקרת את</td><td>Bruker Nano Inc.</td><td></td><td>שלוחת סיליקון ניטריד MLCT עם קצות סיליקון ניטריד, אידיאלי למצבי הדמיית מגע</td></tr><tr><td>בדיקות AFM עם קצות מצופים</td><td>Au Bruker Nano Inc.</td><td>OBL-10</td><td>שלוחים למשיכת חלבונים עם כוח נפרש נמוך</td></tr><tr><td>כרטיס רכישת נתונים רב-תכליתי (DAQ), 16 סיביות, 1 MS/s (רב ערוצי), 1.25 MS/s (ערוץ אחד), 32 כניסות אנלוגיות</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6259</td><td>רכישת נתונים עבור אותות מראש AFM ומפעילי Piezo</td></tr><tr><td>LISA Linear Piezo Stage Actuators</td><td>Physik Instrumente LP</td><td>P-753.11C</td><td>מפעיל Piezo לשליטה במיקום המצע וביצוע מדידות משיכה</td></tr><tr><td>XY Piezo Stage</td><td>Physik Instrumente LP</td><td>P-541.2CD</td><td>Piezo Actuator לשליטה במיקום המצע וסריקה על משטח המצע</td></tr></tbody></table>

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

הקביעה של תהליך קיפול חלבונים מרצף חומצות אמיניות שלהם למבנה תלת-ממד מקורי שלהם היא בעיה חשוב בביולוגיה. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ניתן לפתור בעיה זו על-ידי הפעלת מתיחה והרפיה של מולקולות חלבון יחיד, אשר נותן עדות ישירה של התגלגלות, refolding מאפיינים ספציפיים. מבוסס AFM מולקולה בודדת כוח-ספקטרוסקופיה (AFM-SMFS) מספק אמצעים למדוד באופן עקבי הייצורים החיים אנרגיה גבוהה בחלבונים אשר אינן אפשריות במדידות (ביוכימית) בצובר מסורתי. למרות מספר רב של מאמרים פורסמו כדי להציג את העקרונות של AFM-SMFS, זה לא קל לערוך ניסויים SMFS בשל העדר פרוטוקול ומגובה מלאה. במחקר זה, אנו להמחיש בקצרה את העקרונות של AFM, פירוט בהרחבה את הפרוטוקולים, נהלים, ניתוח נתונים כקו מנחה כדי להשיג תוצאות טובות מן הניסויים SMFS. נדגים נציג SMFS תוצאות מדידות התגלגלות מכני חלבון יחיד, אנו מספקים פתרון בעיות אסטרטגיות עבור כמה נפוץ נתקל בבעיות.

תוצאות נציג של פרוטוקול זה מוצגים באיור2. שני לוחות הצג נציג חיל-סיומת עקומות של חלבונים. העליון מציג תוצאות polyprotein I91, בעוד החלק התחתון מציג את החלבון I91 איגוף חלבון-של-עניין, מולקולת10ג ני. הקלטות אלו הראו את כוחם אופייני של I91 (200 pN) מתאר תוספת אורך (28 ננומטר) אשר מציין יישור וכיול של AFM היה מוצלח. עקומות אלה הרחבת כוח ניתן לנתח אז תולעת רשתות (קו מקווקו) אשר עוזרים לקבוע את האורך תלוי-כוח של המולקולה, לקבוע את המספר של שאריות פרש. ל...

אנו מתארים את הליכים מפורטים על מנת למדוד את תכונות מכניות מסלולים מכני התגלגלות של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. אנו גם מראים תוצאות נציג כנקודת התייחסות הבחירה ואת ההצדקה של הקלטות מולקולת חלבון אחד טוב.

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

ספקטרוסקופיית כוח של מולקולה אחת יכולה לספק תובנות עצומות על ביולוגיה מולקולרית בקנה מידה אטומי בכך שהיא מאפשרת לנו לתפעל מולקולות בודדות בכוח. כאן אנו מדגימים מדידת מהירות מתמדת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. בסופו של דבר אנו יכולים להשתמש בנתונים כדי לקבוע את יציבות החלבון, קצב ההתגלות והמסלול המתפתח.כדי להתחיל את ההליך, צרף לשונית דבק לא מוליך לדיסק ברזל נקי ברוחב 15 מ"מ. הסר את עמוד השער ולחץ בחוזקה על מגלשת זכוכית נקייה, לא מצופה או מצופה זהב על ההיצמדות החשופה. אחסן את המגלשה בצלחת פטרי נקייה ומכסה.לאחר מכן, לרכז את פוליפרוטאין מטוהרים במסנן צנטריפוגלי, ולאחר מכן להפוך את העמודה ולחמק החלבון לתוך המאגר כדי לשמש בניסוי. לקבוע את ריכוז החלבון המתאים בהתבסס על הספיגה ב 280 ננומטר, ולאחר מכן להכין 100 microliters של 100 מיקרוגרם לכל פתרון מיליליטר של החלבון. יש למרוח טיפה של 60 מיקרוליטר של תותר החלבון על מרכז השקופית.יש לדאוג לא לתת את הנוזל להחליק בין השקופית דיסק הברזל, כמו זה יוביל תנועות מדגם בלתי מבוקרת במהלך הניסוי. תן את המדגם לשבת בטמפרטורת החדר לפחות 10 דקות. ראשית, בזהירות להרים את cantilever עד הסוף ולמקום אותו בתא החזקת החללית.ודא כי cantilever הוא יושב היטב. ואז למקם את תא המעצר בראש AFM. הגדר את הראש על שלב מיקרוסקופ הפוך וחבר ערכת סוללות לראש AFM כדי להפעיל את הלייזר.הגדר מצלמה עבור גלאי המיקרוסקופ כדי להמחיש את אור הלייזר בצג או במסך טלוויזיה. מונחה על ידי המיקרוסקופ, למקם את הלייזר, כך שהוא מופנה על קצה cantilever. ברגע שהדגימה מוכנה, יש לשטוף 10 מיקרוליטרים של מאגר הניסויים לכל יציאה של תא המעצר של הגשוש.Decant כ 40 microliters של נוזלים מן השקופית מדגם ולהוסיף 40 microliters של חיץ. בינתיים, התחילו להכין את מיקרוסקופ הכוח האטומי למדידה. ראשית, מניחים את המגלשה על המגנט מעל מנוע הפיזו.אשר כי שלב AFM הוא בעמדה מוגבהת, ולאחר מכן למקם את ראש AFM על הבמה עם cantilever מעל טיפת המדגם. לאחר מכן, מניחים פיסת נייר קטנה מול פוטודיודה AFM. כוונן את הלייזר עד שהנקודה על הנייר בהירה וממוקדת ולאחר מכן הסר את הנייר.הפעל את תוכנת AFM כדי להציג את האות מהפוטודיודה. כוונן את מראה ראש ה-AFM כך שאות הלייזר יוגדל בכל ארבעת הרבעים הפוטודיודים, ואות שונה בין זוגות הרבע העליון והתחתון הוא אפס. כדי להתחיל לכייל את ה- AFM, סובב את הגדרת המסנן עבור אות ראש ה- AFM ורוחב פס מלא וודא שה-piezo כבוי.בתוכנת AFM, למדוד את הממוצע של 512 חישובים של ספקטרום החשמל, עם 1, 024 נקודות נתונים לכל חישוב. שלב את צפיפות ספקטרלית הכוח על פני הפסגה הראשונה, אשר תואמת את המצב העיקרי של רטט עבור cantilever. לאחר מכן, הפעל את בקר הפיזו והגדר את המסנן ל- 500 הרץ.הזיזו במהירות את ראש ה-AFM כמה מאות מיקרומטרים תוך ניטור האות השונה. המשך להזיז את הראש למטה כמה מאות מיקרומטרים בכל פעם תוך צפייה בקפיצות עקביות באות השונה. כאשר קפיצות האות מתחילות לעלות בגובה, הקצה קרוב מאוד למשטח המדגם.לאחר אות ההטיה רווי על מגע קצה עם פני השטח, להרים את הראש מעט, ולאחר מכן להתאים את מתח פיזו כדי להזיז את ראש AFM למעלה או למטה על ידי 100 כדי 5, 000 ננומטר כדי למצוא את משטח המדגם. לאחר מכן, לבצע ניסוי משיכה עם גודל סריקה של כ 500 ננומטר, כך הקצה יוצר קשר עם פני השטח, או כ 100 ננומטר של נסיעה מוטורית פיזו. השתמש בתוצאות כדי לחשב את קבוע האביב ואת הרגישות.בתוכנה, הגדר את גודל הסריקה ל- 40% גדול יותר מהגודל התיאורטי הכולל של הפוליפרוטאין המתפתח. מקם את ה- cantilever כך שהוא יהיה 80% מגודל הסריקה הרחק מפני השטח. הגדר את מהירות הסריקה ל-300 ננומטר לשנייה.בצע ניסוי משיכה ולמדוד את מיקום פיזו וכתוצאה מכך ואת אות photodiode. הוסף מאגר ניסוי לתא הנוזלי מדי שעה לאורך המדידה כדי למנוע מהדגימה להתייבש. האירועים שהתרחשו בהקלטות של פוליפרוטאין I91 ופוליפרוטאין שבו שלושה תחומי I91 מאגפים את מולקולת NI10C מכל צד, צוידו במודל שרשרת דמוי תולעת.שתי ההקלטות מציגות את הכוח האופייני ואת אורך קווי המתאר של I91, מה שמצביע על כך כי כיול AFM היה מוצלח. ההקלטות של הפוליפרוטאין המכיל את מולקולת N110C הראו מספיק אירועי I91 כדי לאשר כי האירועים החדשים היו מחלבון העניין המתפתח. אורך קווי המתאר הממוצע לחזרת האנקירין היה כ-10.5 ננומטר, והכוחות שהתפתחו היו בין שמונה ל-25 פיקונוטון.זה חיוני כדי להשתמש פוליפרוטאין כי האירועים המתפתחים של חלבוני האגף לספק שליטה חיובית טביעת אצבע האירוע מולקולה אחת. בלי זה, הנתונים עלולים להפוך את ההתגנות השגויה.

force-spectroscopy-single-protein-molecules-using-an-atomic-force

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

זהו צעד אחר צעד מדריך המציג את המטרה, תפעול, והתוצאות נציג ספקטרומטר כוח הכבידה הרומן.

הדגמת שימושים של ספקטרומטר הכבידה רומן כוח כדי למתוח מדוד חלבונים סיביים

במאמר זה נתאר את השימוש פינצטה מגנטיים ללמוד את ההשפעה של כוח על proteolysis האנזימטית ברמה של מולקולה בודדת באופן parallelizable ביותר.

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

צלולוזומים הם קומפלקסים מולטי-אנזימים המיועדים לעיכול תאית. SMFS מבוסס AFM שימש לחקר התכונות המכניות ותצורת הקיפול של מכלולי חלבון הקשורים לתאית. אנו מציגים זרימת עבודה מלאה לקיבוע חלבונים, רכישת נתונים וניתוח נתונים כדי לחקור את האינטראקציות של קומפלקסים בודדים של קולטנים-ליגנדים המעורבים בהרכבת תאית.

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

מוצג פרוטוקול לחיבור מגוון גדול של מולקולות בודדות באופן קוולנטי לקצה AFM. ניתנים נהלים ודוגמאות לקביעת כוח ההדבקה והאנרגיה החופשית של מולקולות אלה על תומכים מוצקים וממשקים ביולוגיים.

חוקר מולקולה בודדת הדבקה על ידי הכוח האטומי ספקטרוסקופיה

כאן אנו מציגים פרוטוקול למדוד את הכח של אינטראקציות בין משטח אורגני מוגדר היטב או פפטידים או חומצות אמינו על ידי מדידות ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). המידע המתקבל מהמדידה חשוב להבין טוב יותר את שלבי חומר פפטיד-אורגנית.

תובנה לתוך האינטראקציות של חומצות אמינו פפטידים עם חומרים אורגניים באמצעות ספקטרוסקופיית חיל מולקולה בודדת

פרוטוקול זה מתאר את הנייח קוולנטיות של חלבונים עם heterobifunctional silane זיווג סוכן תחמוצת סיליקון משטחים המיועדים ספקטרוסקופיה בכוח כוח אטומי מבוסס מיקרוסקופיה מולקולה בודדת אשר הוא כשניסחתי האינטראקציה של RrgA (pilus-1 עצה adhesin של ס pneumoniae) עם fibronectin.

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

אנו מתארים את היישום של ננו ספקטרוסקופית אינפרא אדום ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופ כוח אטומי כדי להמחיש את תהליך של חלבון הרכבה עצמית לתוך אגרגטים oligomeric ו-עמילואיד fibrils, אשר קשורה היטב התחלתה ופיתוח של מגוון רחב של מחלות ניווניות אנושיות.

אפיון מצרפים לחלבונים בודדים ע י ננו-ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום ומיקרוסקופ כוח אטומי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלים מונומר חלבון על ידי אנזימים היוצרים פולימר פולימרי עם רצף מבוקר ומשתק אותו על פני השטח עבור לימודי מולקולה בודדת של כוח ספקטרוסקופיית.

OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד

החזקה הקוולנטי של מולקולות בדיקה למיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מהווה טכניקה חיונית לחקירת התכונות הפיזיות שלהם. זה מאפשר לנו לקבוע את כוח מתיחה, כוח desorption אורך של פולימרים באמצעות AFM מבוססי כוח מולקולה בודדת ספקטרוסקופיה עם היכולת הגבוהה.

חיבור קוולנטי של מולקולות בודדות לספקטרוסקופיית כוחות מבוססי AFM

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לחקר המבנה והדינמיקה של שני חלבוני מודל שיש להם תפקיד חשוב בבריאות האדם. הטכניקה משלבת אפיון ביופיזי עם ספקטרוסקופיה של הד ספין נויטרונים כדי לגשת לדינמיקה בזמן ובקני המידה של האורך הרלוונטיים לתנועות אינטרדומיין של חלבונים.

חקר דינמיקת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיה של הד ספין נויטרונים

ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS) היא טכניקה חזקה לפתיחה מכנית וחישה בזמן אמת של מערך אנסמבל של מבנים ביומולקולריים בתחומים ביופיזיים וביו-סנסורים.

ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל על ידי כוחות גזירה

למדו ספקטרוסקופיית כוח של מולקולת חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. שיטה זו מאפשרת למדוד יציבות חלבונים, שיעורי פרישה ומסלולי פרישה ברמת המולקולה הבודדת.

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

גלה סרטונים נוספים