כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

ספקטרוסקופיית כוח של מולקולה אחת יכולה לספק תובנות עצומות על ביולוגיה מולקולרית בקנה מידה אטומי בכך שהיא מאפשרת לנו לתפעל מולקולות בודדות בכוח. כאן אנו מדגימים מדידת מהירות מתמדת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. בסופו של דבר אנו יכולים להשתמש בנתונים כדי לקבוע את יציבות החלבון, קצב ההתגלות והמסלול המתפתח.

כדי להתחיל את ההליך, צרף לשונית דבק לא מוליך לדיסק ברזל נקי ברוחב 15 מ"מ. הסר את עמוד השער ולחץ בחוזקה על מגלשת זכוכית נקייה, לא מצופה או מצופה זהב על ההיצמדות החשופה. אחסן את המגלשה בצלחת פטרי נקייה ומכסה.

לאחר מכן, לרכז את פוליפרוטאין מטוהרים במסנן צנטריפוגלי, ולאחר מכן להפוך את העמודה ולחמק החלבון לתוך המאגר כדי לשמש בניסוי. לקבוע את ריכוז החלבון המתאים בהתבסס על הספיגה ב 280 ננומטר, ולאחר מכן להכין 100 microliters של 100 מיקרוגרם לכל פתרון מיליליטר של החלבון. יש למרוח טיפה של 60 מיקרוליטר של תותר החלבון על מרכז השקופית.

יש לדאוג לא לתת את הנוזל להחליק בין השקופית דיסק הברזל, כמו זה יוביל תנועות מדגם בלתי מבוקרת במהלך הניסוי. תן את המדגם לשבת בטמפרטורת החדר לפחות 10 דקות. ראשית, בזהירות להרים את cantilever עד הסוף ולמקום אותו בתא החזקת החללית.

ודא כי cantilever הוא יושב היטב. ואז למקם את תא המעצר בראש AFM. הגדר את הראש על שלב מיקרוסקופ הפוך וחבר ערכת סוללות לראש AFM כדי להפעיל את הלייזר.

הגדר מצלמה עבור גלאי המיקרוסקופ כדי להמחיש את אור הלייזר בצג או במסך טלוויזיה. מונחה על ידי המיקרוסקופ, למקם את הלייזר, כך שהוא מופנה על קצה cantilever. ברגע שהדגימה מוכנה, יש לשטוף 10 מיקרוליטרים של מאגר הניסויים לכל יציאה של תא המעצר של הגשוש.

Decant כ 40 microliters של נוזלים מן השקופית מדגם ולהוסיף 40 microliters של חיץ. בינתיים, התחילו להכין את מיקרוסקופ הכוח האטומי למדידה. ראשית, מניחים את המגלשה על המגנט מעל מנוע הפיזו.

אשר כי שלב AFM הוא בעמדה מוגבהת, ולאחר מכן למקם את ראש AFM על הבמה עם cantilever מעל טיפת המדגם. לאחר מכן, מניחים פיסת נייר קטנה מול פוטודיודה AFM. כוונן את הלייזר עד שהנקודה על הנייר בהירה וממוקדת ולאחר מכן הסר את הנייר.

הפעל את תוכנת AFM כדי להציג את האות מהפוטודיודה. כוונן את מראה ראש ה-AFM כך שאות הלייזר יוגדל בכל ארבעת הרבעים הפוטודיודים, ואות שונה בין זוגות הרבע העליון והתחתון הוא אפס. כדי להתחיל לכייל את ה- AFM, סובב את הגדרת המסנן עבור אות ראש ה- AFM ורוחב פס מלא וודא שה-piezo כבוי.

בתוכנת AFM, למדוד את הממוצע של 512 חישובים של ספקטרום החשמל, עם 1, 024 נקודות נתונים לכל חישוב. שלב את צפיפות ספקטרלית הכוח על פני הפסגה הראשונה, אשר תואמת את המצב העיקרי של רטט עבור cantilever. לאחר מכן, הפעל את בקר הפיזו והגדר את המסנן ל- 500 הרץ.

הזיזו במהירות את ראש ה-AFM כמה מאות מיקרומטרים תוך ניטור האות השונה. המשך להזיז את הראש למטה כמה מאות מיקרומטרים בכל פעם תוך צפייה בקפיצות עקביות באות השונה. כאשר קפיצות האות מתחילות לעלות בגובה, הקצה קרוב מאוד למשטח המדגם.

לאחר אות ההטיה רווי על מגע קצה עם פני השטח, להרים את הראש מעט, ולאחר מכן להתאים את מתח פיזו כדי להזיז את ראש AFM למעלה או למטה על ידי 100 כדי 5, 000 ננומטר כדי למצוא את משטח המדגם. לאחר מכן, לבצע ניסוי משיכה עם גודל סריקה של כ 500 ננומטר, כך הקצה יוצר קשר עם פני השטח, או כ 100 ננומטר של נסיעה מוטורית פיזו. השתמש בתוצאות כדי לחשב את קבוע האביב ואת הרגישות.

בתוכנה, הגדר את גודל הסריקה ל- 40% גדול יותר מהגודל התיאורטי הכולל של הפוליפרוטאין המתפתח. מקם את ה- cantilever כך שהוא יהיה 80% מגודל הסריקה הרחק מפני השטח. הגדר את מהירות הסריקה ל-300 ננומטר לשנייה.

בצע ניסוי משיכה ולמדוד את מיקום פיזו וכתוצאה מכך ואת אות photodiode. הוסף מאגר ניסוי לתא הנוזלי מדי שעה לאורך המדידה כדי למנוע מהדגימה להתייבש. האירועים שהתרחשו בהקלטות של פוליפרוטאין I91 ופוליפרוטאין שבו שלושה תחומי I91 מאגפים את מולקולת NI10C מכל צד, צוידו במודל שרשרת דמוי תולעת.

שתי ההקלטות מציגות את הכוח האופייני ואת אורך קווי המתאר של I91, מה שמצביע על כך כי כיול AFM היה מוצלח. ההקלטות של הפוליפרוטאין המכיל את מולקולת N110C הראו מספיק אירועי I91 כדי לאשר כי האירועים החדשים היו מחלבון העניין המתפתח. אורך קווי המתאר הממוצע לחזרת האנקירין היה כ-10.5 ננומטר, והכוחות שהתפתחו היו בין שמונה ל-25 פיקונוטון.

זה חיוני כדי להשתמש פוליפרוטאין כי האירועים המתפתחים של חלבוני האגף לספק שליטה חיובית טביעת אצבע האירוע מולקולה אחת. בלי זה, הנתונים עלולים להפוך את ההתגנות השגויה.