שיטות וטיפים על עירוי לוריד של Adeno-הקשורים וירוס חולדות והערכה של מערכת העצבים המרכזית התמרה חושית

המטרה הכוללת של העברת גן וקטור וירוס הקשור לאדנו היא לתמרן גנטית את המוח וחוט השדרה של החולדה על בסיס נרחב בקנה מידה רחב. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום העברת הגנים. זוהי דרך יעילה מאוד להכניס גנים in vivo ולכן טכניקה חזקה מאוד, מגוונת מאוד.

הליך זה מהיר וניתן לשחזור מאוד. השתמשנו בגישת העברת גנים בקנה מידה רחב כדי לבטא חלבון הקשור לטרשת רוחבית אמיוטרופית בכל חוט השדרה של חולדות במספר פרסומים. עמיתי, רוברט דייטון ידגים את ההליך.

מיכל גראמס תסייע לרוברט. התחל בהכנת תחנת העבודה, ראשית, נקה את המשטח עם 70% אתנול. לאחר מכן הניחו כרית חימום באזור העבודה והגדירו אותה להתחמם ל -37 מעלות צלזיוס.

הניחו כרית ספסל על גבי כרית החימום. בדוק שיש מספיק חמצן ואיזופלורן להליך. נקו את תא האינדוקציה ומסכת ההרדמה עם אתנול 70% והניחו את מסכת ההרדמה על כרית הספסל.

וודאו שהדברים הבאים נמצאים בהישג יד, ריבוע סרט פרפין אחד של כ-5X5 סנטימטרים לכל חיה, כרית אחת להכנת אלכוהול ושתיים או שלוש רפידות גזה לכל חיה, קצות פיפטה ומיקרופיפטה. לאחר מכן, הפשירו את הווקטור בטמפרטורת החדר וסמנו צינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי אחד לכל חיה. הכניסו את הנפח הנדרש של AAV לתוך הצינור המתאים והביאו את הנפח לנפח ההזרקה הרצוי עם תמיסת רינגר חלב או מי מלח.

לאחר מערבולת הדגימה למשך שנייה או שתיים ולאחר מכן, דופק צנטריפוגה למשך חמש שניות כדי להביא את הדגימה לתחתית הצינור. פיפטה את נפח ההזרקה הכולל מתוך הצינור אל ריבוע סרט הפרפין. לאחר מכן, הנח מחט בגודל 30 על מזרק מיליליטר אחד.

הנח את המחט כשהשיפוע פונה כלפי מטה לתוך הווקטור על סרט הפרפין. משוך לאחור את בוכנת המזרק עד שכל הנגיף נמצא במחט ובמזרק. להרדים כראוי את החולדה באמצעות מערכת ההרדמה.

הקפידו על מישור הרדמה הולם על ידי היעדר תגובה לצביטה בבוהן. לאחר מכן, הניחו את החולדה באזור העבודה על צדה ושמרו על הרדמה באמצעות חרוט האף. כשהחולדה שוכבת על צדה, וריד זנב צדדי אחד צריך להיות פונה כלפי מעלה.

ההזרקה היא שני שליש לאורך הזנב. נגב את מקום ההזרקה עם כרית הכנת האלכוהול. החזק בחוזקה את הזנב מעט מעל אזור ההזרקה, עם אצבע אחת ישירות מעל וריד הזנב הרוחבי, זה ירחיב את הווריד.

כשהשיפוע פונה כלפי מעלה, יישר את המחט עם וריד הזנב הגלוי באותו כיוון. יש לנקב את העור מעל וריד הזנב, תוך הקפדה יתרה על כך שהיד השנייה לא תחזיק את הזנב ותלחץ על וריד הזנב. שחרר לחץ מווריד הזנב כדי לאפשר זרימת דם תקינה.

ואז העבירו את המחט לווריד. כדי להבטיח שהמחט ניקבה את וריד הזנב, משוך מעט לאחור את הבוכנה. אם המחט נמצאת בווריד, הדם יזרום לתוך המחט.

לאחר מיקום מחדש של המחט במידת הצורך, ייצב את המחט על ידי החזקת קצה המזרק כנגד הזנב. הזרקו לאט את הווקטור לזנב במהירות של כ-20 מיקרוליטר לשנייה. במקרה של הזרקה לקויה, החיה תועבר רק באופן חלקי והתוצאות כנראה לא יהיו מועילות.

עם זאת, עם תרגול, זריקות טובות ניתנות לשחזור ואמינות מאוד. אם הווקטור ניתן, הסר את המחט מהזנב ולחץ פד גזה על מקום ההזרקה כדי לעזור לעצור את הדימום למשך 30 עד 60 שניות. כבה את הרדמת האיזופלורן והחמצן.

עקוב אחר החולדה עד שהיא חוזרת להכרה ולאחר מכן החזיר אותה לכלוב שלה. השלך את החומרים שאולי מזוהמים ב-AAV למיכל ביולוגי מתאים ונקה את תחנת העבודה עם 70% אתנול. השג קטעי עטרה של 50 מיקרון מהמוח הקבוע והמוגן בהקפאה של בעל חיים מוזרק AAV, באמצעות מיקרוטום הזזה עם שלב הקפאה.

לאחר צביעה חיסונית ל-GFP והרכבה על שקופיות, פוטומיקרוגרף כל קטע באזור העניין המוגדר עם עדשת הגדלה נמוכה באמצעות מיקרוסקופ. שמור על הגדרות המצלמה זהות בכל הדגימות לניתוח ושמור את הנתונים כקובצי TIFF. פתח את הפוטומיקרוגרף בתוכנית Scion Image הזמינה באופן נרחב.

ייפתחו שני חלונות, סגור את החלון המצוין כצבע אינדקס. בחר אפשרויות ולאחר מכן פרוסת צפיפות מגוון גוונים יצוין באדום בחלון טבלת החיפוש.

בחלון, השתמש בסמן כדי למלא את תווית ה- GFP הספציפית בלבד ועצור כאשר הרקע הלא ספציפי מתחיל להיקלט בתמונה. לאחר מכן, לחץ על נתח והגדר קנה מידה. בשורה הרביעית צריך להיות יחידות, מהרשימה הנפתחת, בחר פיקסלים ולאחר מכן לחץ על אישור.

כדי למדוד את האזור הפלואורסצנטי, לחץ על נתח ולאחר מכן על מדוד. לאחר מכן, לחץ על נתח והצג תוצאות. יופיע חלון תוצאות ומדידת השטח הפלואורסצנטי תהיה תחת הכותרת שכותרתה, אזור.

לאחר רישום כל המדידות, ממוצע הערכים משלושה עד שישה חלקים לכל חיה. השתמש במבחן סטטיסטי מתאים כדי להשוות את האזורים המומרים בין הקבוצות. תמונה מייצגת זו מציגה אימונופלואורסצנציה של GFP במוח הקטן של חולדה, ארבעה שבועות לאחר הזרקת וריד הזנב של AAV 9 GFP.

נעשה שימוש בתוכנת ניתוח תמונות כדי להדגיש באופן סלקטיבי את האזור הפלואורסצנטי ולכמת את הפיקסלים המודגשים. זוהי תמונת GFP מבעל חיים שאינו מתמר. ניתוח תמונה זו, תוך שימוש באותם פרמטרים עבור החיה המוזרקת GFP, אכן מזהה רמה נמוכה מאוד של אות רקע.

לאחר השליטה, ניתן לבצע את ההזרקה תוך כחמש דקות לכל חולדה. לסיכום, טכניקה זו מתארת דרך להחדרת גנים ביעילות למערכת העצבים המרכזית של החולדה, אספקת גנים חד פעמית מייצרת ביטוי מתמשך והשפעות ארוכות טווח. והכי חשוב, מערכת העצבים המרכזית מנוהלת מהפריפריה.

הזרקת וקטור תוך ורידית לא פולשנית יחסית, מגיעה למוח ולחוט השדרה, למערכת העצבים המרכזית.