שיטות וטיפים על עירוי לוריד של Adeno-הקשורים וירוס חולדות והערכה של מערכת העצבים המרכזית התמרה חושית

המטרה הכללית של העברה זו של גנים באמצעות וקטור של נגיף אדנו-משויב (adeno-associated virus) היא לבצע מניפולציה גנטית של המוח וחוט השדרה של החולדה בקנה מידה נרחב. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מרכזיות בתחום העברת הגנים. זוהי דרך יעילה מאוד להחדרת גנים in-vivo, ולכן מדובר בטכניקה רב-גונית ועוצמתית מאוד.

הליך זה הוא מהיר ובעל הדירות גבוהה. השתמשנו בגישה זו להעברה רחבה של גנים כדי לבטא חלבון הקשור לטרשת נשיתית לצדית (amyotrophic lateral sclerosis) לאורך כל חבל השדרה של חולדות במספר פרסומים. עמיתי, Robert Dayton, ידגים את ההליך.

מייקל גריימס (Mychal Grames) יסייע לרוברט. התחילו בהכנת תחנת העבודה; ראשית, נקו את המשטח עם 70% ethanol. לאחר מכן, הניחו פד חימום באזור העבודה והגדירו אותו לחימום בטמפרטורה של 37 degree celsius.

הניחו רפידה לשולחן מעל רפידת החממה. ודאו כי יש כמות מספקת של חמצן ואיסופלורן עבור הפרוצדורה. נקו את תא ההשראה ואת מסכת ההרדמה עם 70% ethanol והניחו את מסכת ההרדמה על הרפידה לשולחן.

וודאו כי הפריטים הבאים נמצאים בהישג יד: ריבוע אחד של סרט פראפין בגודל של כ-5 x 5 סנטימטרים לכל בעל חיים, רפידה אחת להכנה באלכוהול ושתיים או שלוש רפידות גזה לכל בעל חיים, טיפים לפיפטה ומיקרופיפטה. לאחר מכן, הפשירו את הווקטור בטמפרטורת החדר וסמנו שפופרת מיקרוצנטריפוגה סטרילית אחת עבור כל בעל חיים. העבירו בעזרת פיפטה את הנפח הנדרש של AAV לשפופרת המתאימה, והשלימו את הנפח לנפח ההזרקה הרצוי באמצעות תמיסת Lactated Ringer או סליין.

לאחר ערבוב במכשיר הוורטקס למשך שנייה אחת או שתיים, בצעו ספינטרפוזת קצרה (pulse centrifuge) למשך חמש שניות כדי להביא את הדגימה לתחתית הפחית. העבירו באמצעות פיפטה את נפח ההזרקה הכולל מהפחית אל ריבוע של סרט פאראפין. לאחר מכן, התקינו מחט במידה 30 על מזרק של 1 מיליליטר.

החדירו את המחט, כאשר השיפוע פונה כלפי מטה, אל הווקטור שעל סרט הפרפין. משכו את בוכנת המזרק לאחור עד שכל הווירוס נמצא במחט ובמזרק. הרדימו את החולדה כראוי באמצעות מערכת ההרדמה.

יש לוודא מישור הרדמה הולם על ידי היעדר תגובה לצביטה בבהו ה🦶. לאחר מכן, יש להניח את החולדה על צדה באזור העבודה ולשמור על ההרדמה באמצעות קונו אף. כאשר החולדה שוכבת על צדה, אחד הוורידים הצידיים בזנב צריך להיות פונה כלפי מעלה.

את ההזרקה מבצעים בשליש התחתון של הזנב. נגב את נקודת ההזרקה באמצעות פדית אלכוהול. אחז את הזנב בחוזקה מעט מעל אזור ההזרקה, כאשר אצבע אחת מונחת ישירות מעל הווריד הצדי של הזנב; פעולה זו תרחיב את הווריד.

כאשר השפיץ פונה כלפי מעלה, יישרו את המחט עם וריד הזנב הנראה באותו כיוון. דקרו את העור מעל וריד הזנב, תוך הקפדה רבה להימנע מהיד השנייה המחזיקה את הזנב ולוחצת על וריד הזנב. שחררו את הלחץ מווריד הזנב כדי לאפשר זרימה תקינה של הדם.

לאחר מכן, הכניסו את המחט אל תוך הווריד. כדי לוודא שהמחט פירצה את וריד הזנב, משכו מעט את הבוצבע. אם המחט נמצאת בווריד, דם יזרום לתוכה.

לאחר מיקום מחדש של המחט במידת הצורך, ייצבו את המחט על ידי החזקת קצה המזרק כנגד הזנב. מזריקו את הווקטור לתוך הזנב באיטיות, בקצב של כ-20 microliters לשנייה. במקרה של הזרקה לקויה, החיה תעבור טרנסדוקציה חלקית בלבד והתוצאות ככל הנראה לא יהיו שמישות.

עם זאת, באמצעות תרגול, הזרקות נכונות הן הדירות ואמינות מאוד. לאחר מתן הווקטור, הוציאו את המחט מהזנב והצמידו פד גזה לאתר ההזרקה כדי לסייע בעצירת הדימום למשך 30 עד 60 שניות. כבו את הרדמת ה-isoflurane ואת החמצן.

השגח את החולדה עד שתחזור להכרה ולאחר מכן החזר אותה לכלוב. השליך את החומרים שייתכן שהזוהמו ב-AAV למכל סיכון ביולוגי מתאים ונקה את תחנת העבודה ב-70% ethanol. השג חתכים קורונליים בעובי 50 micron מהמוח המקובע והמוגן בקריו של בעל חיים שהוזרק לו AAV, באמצעות מיקרוטום גלישה עם במה להקפאה.

לאחר צביעה אימונוהיסטוכימית ל-GFP והרכבה על סליידים, צלמו מיקרוגרפיה של כל חיתוך באזור העניין המוגדר באמצעות עדשה בעלת הגדחה נמוכה תחת מיקרוסקופ. שמרו על הגדרות מצלמה זהות עבור כל הדגימות שינותחו ושמרו את הנתונים כקבצי TIFF. פתחו את התמונה בתוכנת Scion Image הזמינה באופן נרחב.

שני חלונות ייפתחו, סגור את החלון המסומן כ-index color. בחר באפשרויות (options), ולאחר מכן ב-density slice. טווח של גוונים יסומן באדום בחלון ה-look up table.

בחלון, השתמשו בסמן כדי למלא רק את סימון ה-GFP הספציפי, ועצרו כאשר הרקע הבלתי-ספציפי מתחיל להופיע בתמונה. לאחר מכן, לחצו על analyze והגדירו את קנה המידה (scale). בשורה הרביעית תופיע המילה units; מהרשימה הנפתחת, בחרו pixels ולאחר מכן לחצו על okay.

כדי למדוד את השטח הפלואורסצנטי, לחצו על analyze ולאחר מכן על measure. לאחר מכן, לחצו על analyze ו-show results. ייפתח חלון תוצאות ומדידת השטח הפלואורסצנטי תופיע תחת הכותרת labeled, area.

לאחר רישום כל המדידות, חשבו את הממוצע של הערכים משלושה עד שישה חתכים לכל חיה. השתמשו במבחן סטטיסטי מתאים כדי להשוות את השטחים שעברו טרנסדוקציה בין הקבוצות. תמונה מייצגת זו מציגה אימונופלורסצנציה של GFP במוח הדגיא של חולדה, ארבעה שבועות לאחר הזרקה של AAV 9 GFP לווריד הזנב.

תוכנה לניתוח תמונות שימשה כדי להדגיש באופן סלקטיבי את האזור הפלואורסצנטי וכדי לכמת את הפיקסלים המודגשים. זוהי תמונת GFP מבעל חיים שלא עבר טרנסדוקציה. ניתוח של תמונה זו, תוך שימוש באותם פרמטרים ששימשו עבור בעל החיים שהוזרק לו GFP, מגלה רמה נמוכה מאוד של אות רקע.

לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את ההזרקה בכ-חמש דקות לכל חולדה. לסיכום, טכניקה זו מתארת דרך יעילה להחדרת גנים למערכת העצבים המרכזית (CNS) של החולדה; הובלה חד-פעמית של הגן מייצרת ביטוי מתמשך והשפעות ארוכות טווח. חשוב מכל, מערכת העצבים המרכזית מופעלת מהפריפריה.

הזרקה של וקטור תוך-ורידי, שהיא פולשנית במידה מועטה יחסית, מגיעה למוח ולחוט השדרה, למערכת העצבים המרכזית (CNS).